The authors acknowledge funding from the National Institutes of Health R21CA182333.

1. Preparazione di polimerici acquosa Due sistema Phase (ATPS) <ol><li> Pesare 0,5 g di polietilene glicole (PEG) (MW: 35.000) e aggiungerlo al 9,5 ml di terreno di coltura completo in una sterile 15 ml conica per preparare 10 ml di 5% (w / v) di fase acquosa PEG. Nota: Aggiungendo la metà del mezzo alla conica per prima, seguita dalla aggiunta il polimero e quindi la quantità rimanente di supporto minimizza l&#39;adesione del polimero alle pareti coniche e aiuta il polimero sciogliere velocemente. </li><li> Pesare 0,128 g di destrano (DEX) (MW: 500.000) e aggiungerlo al 0,872 ml di terreno di coltura completo in una provetta sterile da 1,5 ml microcentrifuga per preparare 1 ml del 12,8% (w / v) fase DEX acquosa. </li><li> Soluzioni Vortex entrambi per circa 1 minuto per sciogliere i polimeri nel mezzo. </li><li> Tenere entrambe le soluzioni in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per 1 ora per assicurare dissoluzione e miscele omogenee. Tenere i tappi sopra il livello dell&#39;acqua per evitare la possibilità di contaminazione delle soluzioni dal bagnoacqua. </li><li> Caricare la soluzione fase PEG in una sterile, siringa di plastica e farla passare attraverso un filtro siringa da 0,2 micron dimensione dei pori per rimuovere le impurità. Nota: Riempire la siringa con la soluzione di PEG, posizionarlo nell&#39;inserto del filtro sopra un tubo conico e usando la forza, spingere lentamente la soluzione attraverso il filtro. È normale che si verifichi resistenza contro il movimento dello stantuffo della siringa. Minor perdita della soluzione polimerica si verifica come parte della soluzione rimarrà nel filtro, ma la concentrazione di polimero non cambierà. </li><li> Pipettare 10 microlitri della soluzione di fase DEX e diluire a 10 ml di mezzo in un tubo separato per provocare 6,4% (w / v) di fase DEX. Aspirare 100 ml di soluzione di fase PEG e versare in una capsula di Petri. <ol><li> Pipettare 0,5 ml di 6,4% (w / v) di fase nella soluzione di DEX fase di PEG. Visivamente confermare successo formazione ATPS osservando una goccia DEX al microscopio. Il confine gocciadovrebbe rimanere visibile, indicando la presenza di due fasi, distinte acquose stabili. </li></ol></li><li> Conservare lo stock acquosa PEG e soluzioni di fase DEX a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. Nota: Si raccomanda di soluzioni polimeriche sono preparati freschi prima di ogni esperimento e utilizzati entro 24 ore di archiviazione. </li></ol> 2. Preparazione per la stampa di cancro Spheroids Cellulari <ol><li> Crescere le cellule tumorali di interesse (ad esempio, le cellule MDA-MB-157 cancro al seno) per un 90% -100% confluenti monostrato. Per MDA-MB-157 cellule, usare un mezzo costituito di DMEM contenente 10% FBS, 1% glutammina e 1% di antibiotici. <ol><li> Celle di raccolta con un tampone di dissociazione cellulare (secondo il protocollo del produttore) e caricare la sospensione in una conica da 15 ml. Centrifugare per 5 min a 173,3 xg, rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 1 ml di terreno di coltura completo. </li></ol></li><li> Le celle di carico su un emocitometro e contare di calcolare il numero richiestodi cellule per una densità cellulare sferoidale desiderato. Un monostrato confluente di MDA-MB-157 cellule cresciute in un pallone T75 solito dà ~ 7 x 10 6 cellule. Nota:. Densità cellulare Richiesto per un volume di goccia per generare un singolo sferoide dipenderà dal tipo cellulare 22 Per esempio, una densità di 1,5 x 10 4 o maggiore per MDA-MB-157 cellule è raccomandato in 0,3 ml di fase DEX drop garantire la formazione di un unico sferoide. </li><li> Cellule di centrifugazione per una seconda volta per 5 minuti a 173,3 xg e risospendere in un volume adeguato di terreno di crescita per concentrare la sospensione ad una densità cellulare desiderata. Nota: Ad esempio, se sono state raccolte 7 x 10 6 cellule tumorali, il volume totale della sospensione cellulare richiesta per formare uno sferoide di densità di 1,5 x 10 4 cellule in 0,3 ml DEX fase goccia sarà di 140 microlitri. Tuttavia a causa della diluizione con soluzione di fase DEX nella fase successiva, utilizzare solo 70 ml di mezzo di coltura cellulare per risospendere le cellule. </li><li&gt; Aggiungere alla sospensione cellulare risultante un volume uguale del 12,8% (w / v) Soluzione acquosa fase DEX preparato in 1.2. Per l&#39;esempio di 1,5 x 10 4 cellule di densità sferoidale, 70 microlitri della soluzione di fase DEX viene aggiunto a 70 ml di sospensione cellulare. </li><li> Mescolare bene la sospensione cellulare per assicurare una distribuzione uniforme delle cellule e miscelazione di soluzione DEX. Pipettando su e giù dovrebbe essere fatto con delicatezza per evitare la formazione di bolle. </li></ol> 3. Preparazione per la stampa di Spheroids Co-coltura <ol><li> Crescere cellule tumorali (per esempio, MDA-MB-157 cellule di cancro al seno umano) e le cellule di supporto (ad esempio, fibroblasti umani) ad un 90% -100% confluenti monostrato. Raccogliere ogni tipo di cellula con un buffer di dissociazione cellulare (secondo il protocollo del produttore). <ol><li> Caricare ogni sospensione in un conica 15 ml, li centrifugare per 5 min a 173,3 xg, e aspirare il surnatante da ciascun conica. Risospendere le cellule di ogni conica in 1 ml di completo grescita media. Nota: Coloranti fluorescenti come calceina AM (macchia cellule vive) e coloranti nucleari (Hoechst) possono essere utilizzati per distinguere i due tipi di cellule. </li></ol></li><li> Caricare ciascun tipo di cellula separatamente su un emocitometro e contarli per calcolare il numero di ciascun tipo di cellula per un rapporto desiderato di cellule tumorali di cellule di supporto in sferoidi co-coltura. Monostrati confluenti di MDA-MB-157 cellule e fibroblasti coltivate in fiasche T75 solito danno ~ 7 x 10 6 e ~ 6 x 10 6 cellule, rispettivamente. </li><li> Aggiungere il volume corretto dalla sospensione di cellule di supporto alle cellule tumorali sospensione invia un rapporto desiderato del numero di due tipi di cellule. Ad esempio, utilizzare un rapporto di 50 cellule tumorali a 1 fibroblasti. </li><li> Centrifugare la conica contenente la sospensione cellulare mista per 5 min a 173,3 XG e risospendere le cellule in un volume adeguato al risultato della densità finale comprendente dei volumi uguali di mezzo di crescita e l&#39;12,8% (w / v) DEX acquosaSoluzione fase (preparato in 1.2). </li><li> Pipettare delicatamente la sospensione cellulare risultante su e giù per assicurare l&#39;omogeneità della sospensione. </li></ol> 4. La stampa di Spheroids tumorali in una piastra a 96 pozzetti <ol><li> Un giorno prima esperimenti, cappotto lastre non trattate, a fondo tondo da 96 pozzetti con 1% (w / v) Pluronic a 37 ° C per 24 ore. Questo rivestimento impedisce l&#39;adesione delle cellule durante il periodo della cultura. </li><li> Pipettare 50 ml di filtrato 5% (w / v) fase acquosa PEG in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti (piastra di destinazione). </li><li> Utilizzando una pipetta, mescolare la sospensione cellulare (preparata al punto 2 o 3 step per mono e co-coltura, rispettivamente) e aggiungere 20 ml di sospensione di ogni altro bene da una colonna di una piastra 384 pozzetti (targa fonte) . </li><li> Accendere il gestore liquido e &quot;casa&quot; il capo di pipettaggio per registrare le coordinate. Quindi compilare un protocollo già definito (di seguito in 4.6) al fine di garantire da laboratorio e parametri sono definiti correttoly. Questo passo &quot;homing&quot; può essere diverso per i diversi gestori di liquidi. Nota: Il flusso del protocollo, mostrato passo-passo di seguito in 4.6, sarà simile a prescindere dal gestore liquido robotica utilizzato; Tuttavia, l&#39;interfaccia di programmazione può differire a causa dell&#39;uso di diversi software. </li><li> Posizionare la piastra di origine, la piastra di destinazione, e scatole di tip pipetta in posizioni definite sulla workstation del gestore liquido come mostrato in Figura 1. </li><li> Eseguire il protocollo che prevede le seguenti fasi: <ol><li> Caricare una colonna di barili dalla testa pipettaggio del gestore liquido con miscelazione punte per pipette (8 punte) dalla stazione di lavoro (Figura 1). </li><li> Mescolare la sospensione cellulare in pozzetti della piastra di sorgente (Figura 1). Selezionare un volume di miscelazione inferiore al volume di sospensione cellulare in pozzetti per evitare la formazione di bolle. </li><li> Espellere punte in una scatola discariche vuota (Figura 1). </li&gt; <li> Caricare una colonna di barili dalla testa pipettaggio con 10 microlitri di erogazione punte per pipette (Figura 1). </li><li> Aspirare 0,3 ml di sospensione cellulare dalla piastra sorgente (Figura 1) in ciascuna punta della pipetta. </li><li> Distribuire la sospensione cellulare nei pozzetti di una colonna della piastra di destinazione (Figura 1). Utilizzare un&#39;altezza erogazione di 0,5 mm e una portata di erogazione inferiore a 1 ml / sec. </li><li> Ripetere i passaggi attraverso 4.6.1 4.6.6 finché la stampa di colonna per colonna nella intera piastra destinazione è completa. </li></ol></li><li> Rimuovere con cautela la piastra di destinazione dalla superficie workstation e collocarlo in un incubatore umido a 37 ° C e 5% di CO 2. Mantenere la piastra orizzontale durante il trasporto in incubatrice per evitare di interrompere di DEX gocce fase contenenti cellule. </li><li> Incubare la piastra per 24 ore per permettere l&#39;aggregazione di cellule in uno sferoide all&#39;interno della goccia fase DEX. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. Trattamento farmacologico della Cancer Spheroids Cellulari Si noti che il seguente protocollo è per un trattamento farmacologico 4 giorni e comprende un rinnovamento con farmaco fresco dopo giorno 2. Può essere modificato per altri periodi di trattamento. <ol><li> Confermare visivamente formazione sferoide in piastre da 96 pozzetti dopo 24 ore. Se necessario, pozzi di immagine per la misurazione di dimensioni di sferoidi dalla media dei diametri più piccoli e più grandi di ogni sferoide. </li><li> Preparare la soluzione madre di un farmaco desiderato sciogliendolo in un solvente raccomandato dal costruttore, ad una concentrazione di solubilità predeterminata. Ad esempio, sciogliere cisplatino in acqua a 2 mg / ml. Nota: Proteggere la soluzione madre del farmaco dalla luce, se il farmaco è sensibile alla luce. </li><li> Utilizzando la tecnica di diluizione in serie, preparare concentrazioni di farmaco diluito con mezzo di coltura cellulare dalla soluzione madre preparata nella fase precedente. Ogni diluizione dovrebbe essere fatta due volte la concentrazione desiderata. DilRapporti ution variano a seconda della concentrazione della partenza e desiderata concentrazione di lavoro. </li><li> Aggiungere 50 ml di soluzione medicinale preparata nella fase precedente in ciascun pozzetto. Questo può essere fatto tramite macchina o pipettando manuale. Nota: Ogni concentrazione farmaco sarà diluito in mezzo alla concentrazione voluta dal 50 microlitri acquosa fase PEG già in ciascun pozzetto. <ol><li> Utilizzare sferoidi da due colonne di una piastra a 96 pozzetti (n = 16) per ciascuna concentrazione. </li><li> In pozzetti di controllo, aggiungere solo 50 ml di terreno di coltura fresco alle attuali 50 microlitri della fase acquosa PEG. </li></ol></li><li> Incubare sferoidi con il farmaco per 48 ore a 37 ° C e 5% CO 2, al riparo dalla luce. </li><li> Dopo 48 h di incubazione, preparare diluizioni fresche del farmaco, alle concentrazioni desiderate e rinnovare farmaco aggiungendo 50 ml di soluzione medicinale fresca a ciascun pozzetto. Nota: I pozzi contengono già la concentrazione del farmaco desiderato dal primo farmaco tRATTAMENTO. Pertanto in questa fase di rinnovo, ciascuna concentrazione viene preparata alla concentrazione desiderata in quanto si verificherà alcuna diluizione. </li><li> Incubare sferoidi con il farmaco per un altro 48 ore a 37 ° C e 5% CO 2, al riparo dalla luce. </li></ol> 6. Analisi della Cellular Viabilità in Spheroids <ol><li> Dopo 48 ore di incubazione con rinnovata farmaco (cioè, il tempo totale del trattamento di sferoidi con un farmaco è 4 giorni), misurare il volume totale del mezzo in un pozzetto pipettando manuale. Nota: il volume tipico in un bene è ~ 140 microlitri (un piccolo calo si verifica a causa di evaporazione). </li><li> Calcolare il volume della cella di reagente vitalità (ad esempio, PrestoBlue) come concentrazione del 10% del volume totale bene. Aggiungere questo volume di reagente vitalità cellulare in ciascun pozzetto. Nota: Con un volume di supporto esistente di 140 microlitri in un pozzo, un volume di 15,6 microlitri è necessaria per ottenere una concentrazione del 10% del totale bene. Questo è calcolatodividendo il volume del supporto esistente 9 (140 ml / 9 = 15,6 ml). </li><li> Incubare la piastra con il reagente vitalità cellulare aggiunti a ciascun pozzetto per 6 ore a 37 ° C, al riparo dalla luce. </li><li> Porre la piastra in un lettore di micropiastra e leggere il segnale di fluorescenza a 560 nm e 590 nm di eccitazione e di emissione, rispettivamente. </li><li> Calcolare la vitalità percentuale di cellule in sferoidi normalizzando il segnale fluorescente da pozzi trattati a quella di pozzetti di controllo dopo la media dei valori delle stesse condizioni di trattamento. </li></ol>

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Mater. 22, 2628-2631 (2010).</li><li>Tavana, H., Mosadegh, B., Zamankhan, P., Grotberg, J. B., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microprinted+feeder+cells+guide+embryonic+stem+cell+fate.">Microprinted feeder cells guide embryonic stem cell fate.</a> Biotechnol. Bioeng. 108, 2509-2516 (2011).</li><li>Kalluri, R., Zeisberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nat Rev Cancer. 6, 392-401 (2006).</li><li>Olsen, C. J., Moreira, J., Lukanidin, E. M., Ambartsumian, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mammary+fibroblasts+stimulate+invasion+of+breast+cancer+cells+in+a+three-dimensional+culture+and+increase+stroma+development+in+mouse+xenografts.">Human mammary fibroblasts stimulate invasion of breast cancer cells in a three-dimensional culture and increase stroma development in mouse xenografts.</a> BMC Cancer. 10, 444 (2010).</li><li>Ozdemir, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+carcinoma-associated+fibroblasts+and+fibrosis+induces+immunosuppression+and+accelerates+pancreas+cancer+with+reduced+survival.">Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival.</a> Cancer Cell. 25, 719-734 (2014).</li><li>Hsiao, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+system+for+formation+of+PC-3+prostate+cancer+co-culture+spheroids.">Microfluidic system for formation of PC-3 prostate cancer co-culture spheroids.</a> Biomaterials. 30, 3020-3027 (2009).</li><li>Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid-based+drug+screen:+considerations+and+practical+approach.">Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach.</a> Nat. Protoc. 4, 309-324 (2009).</li><li>Weigelt, B., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+microenvironmental+influences+on+the+normal+mammary+gland+and+breast+cancer.">Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer.</a> Semin. Cancer Biol. 18, 311-321 (2008).</li><li>Mueller, M. M., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friends+or+foes+-+bipolar+effects+of+the+tumour+stroma+in+cancer.">Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer.</a> Nature Reviews Cance. 4, 839-849 (2004).</li><li>Bissell, M. J., Radisky, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putting+tumours+in+context.">Putting tumours in context.</a> Nat. Rev. Cancer. 1, 46-54 (2001).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Spheroids presentano un modello realistico per capire meglio la fisiologia del tumore e l&#39;efficacia dei farmaci e di fornire uno strumento utile per la scoperta di nuovi farmaci anti-cancro. Tali applicazioni potrebbero trarre grandi vantaggi da semplici tecniche di generazione e di manutenzione sferoidale che richiedono solo da laboratorio standard strumenti di gestione dei liquidi e vagliatura. L&#39;uso di un sistema a due fasi acquosa cellule tumorali di aggregati spontaneamente entro la fase goccia permette una produzione efficiente e manutenzione di sferoidi con gestori liquidi robotici, in trattamento farmacologico situ ed analisi finale delle risposte cellulari con reagenti e strumenti commerciali. Così, questa tecnologia è un grande vantaggio rispetto agli approcci esistenti di 3D colture di cellule di cancro e presenta una piattaforma di screening per accelerare la scoperta di farmaci. Generazione sferoidi uniformi dimensioni all&#39;interno di una piastra micro-bene è fondamentale per le applicazioni di screening ad elevata capacità di garantire un ac cellulare di base similelivello tività in tutti sferoidi. Utilizzando gestori liquidi con un meccanismo di spostamento d&#39;aria pipettaggio, è importante per ottimizzare il processo di erogazione attraverso la quantificazione degli effetti dei parametri di trattamento liquido chiave (erogare altezza, erogare portata, e pre-volume di aria aspirata) sul erogazione della fase acquosa DEX . Questa ottimizzazione consente la testa pipettaggio per spazzare la soluzione fase DEX viscosa e le cellule tumorali nei pozzetti e producono sferoidi omogenei. Anche se i quantitativi specifici per questi tre parametri sono stati determinati nel protocollo per il gestore di liquido SRT Bravo, un approccio analogo dovrebbe essere impiegato con altri gestori di liquidi per determinare le condizioni ottimali di erogazione che si traducono in formato goccia fase DEX coerente erogato nella fase di immersione PEG. Inoltre, è possibile utilizzare 96 puntali e stampare simultaneamente sferoidi in tutti i 96 pozzetti. Ciò tuttavia aumenta notevolmente il numero di cellule necessario per riempire la piastra sorgente con ilfase acquosa contenente cellule DEX. Indipendentemente selezionando approcci stampa colonna-saggio o tutta-piastra, è fondamentale per mescolare il contenuto della piastra sorgente prima della fase di aspirazione. Questo assicura che la sospensione cellulare in fase densa DEX è omogenea e riduce le variazioni nelle dimensioni delle sferoidi. Diversi studi dimostrano che sferoidi di cellule di cancro imitano diverse proprietà chiave di tumori avascolari quali morfologia e diffusione limitazioni di reagenti; di conseguenza, essi presentano un modello fisiologicamente rilevanti per valutare l&#39;efficacia di nuovi composti e convenzionali contro le cellule tumorali rispetto a colture cellulari monostrato tradizionali. 8,17,18,21,23,37 Si dimostra che l&#39;approccio sistema bifase acquosa per produrre sferoidi permette comodamente screening di farmaci nello stesso piatto, semplicemente aggiunta e il rinnovo di un composto di droga in momenti desiderati e lo screening automatizzato di vitalità cellulare utilizzando un lettore di micro-piastra standard. Questoè un grande vantaggio rispetto tecniche come gocce appesi che richiederebbero trasferimento sferoidi ad una piastra standard per l&#39;analisi delle risposte cellulari ai farmaci. 21 Inoltre, è noto che le cellule di supporto nel microambiente tumorale e le loro interazioni con le cellule tumorali sono implicati in diversi fenotipi di cellule tumorali maligne. 33-35,38,39 quindi la capacità di generare sferoidi co-coltura di cancro e cellule stromali utilizzando la tecnologia acquosa a due fasi sarà aiutare a valutare l&#39;influenza delle cellule di supporto del microambiente tumorale sulle risposte di cancro cellule a vari trattamenti. L&#39;esperimento co-coltura eseguita in questo studio serve come concetto prova di che questa tecnologia può generare successo sferoidi contenenti cellule tumorali e cellule stromali. Studi futuri potranno sfruttare questa capacità e indagare le caratteristiche differenziali di sferoidi mono e co-coltura come la proliferazione e droga risposte. Inoltre, questoLa tecnologia offre una piattaforma per imitare più da vicino l&#39;in vivo microambiente tumorale includendo altri componenti stromali del modello di tumore. 40 In sintesi, questo protocollo permette formazione spontanea di sferoidi in piastre a 96 pozzetti senza usare qualsiasi forza esterna. Adattare la tecnica per un gestore liquido robotica migliora la velocità e l&#39;efficienza della produzione sferoide in un formato standard elevato throughput. La compatibilità della tecnologia di imaging con commerciale e saggio analizza piattaforme permette di utilizzare diversi strumenti disponibili in laboratori accademici e industriali. Per le applicazioni future, questo protocollo razionalizzerà screening di farmaci con colture di cellule di cancro 3D una tecnica di routine. Inoltre, questo approccio può essere facilmente modificato per formare sferoidi di diverse dimensioni, diversi tipi di cellule differenti combinazioni di cellule tumorali e stromali in sferoidi co-coltura, e essere scalata a resa maggiore piastre micro pozzetti to accelerare ulteriormente lo screening farmaco anti-cancro.

Saggi cellulari forniscono uno strumento importante per lo sviluppo e la scoperta di nuovi farmaci anti-cancro. 1,2 Storicamente, colture monostrato di cellule tumorali sono stati impiegati per studiare l&#39;efficacia di composti candidati contro particolari tipi di cellule tumorali. La facilità di manutenzione delle colture monostrato in piastre di coltura standard, la compatibilità di piatti standard con strumenti robotici commerciali per l&#39;aggiunta dei reagenti, e con attrezzature di screening per l&#39;analisi a valle di risposte cellulari a composti chimici sono i principali vantaggi che rendono le culture 2D uno strumento interessante per test anti-droga. 3 Purtroppo, saggi cellulari monostrato spesso non riescono a prevedere l&#39;efficacia di composti in vivo, rendendo lo sviluppo di farmaci e la scoperta di un processo estremamente costoso. 4,5 Nonostante investimento significativo e lo sforzo da aziende farmaceutiche e unità accademiche, solo ~ 1% di anti-cancro sono stati approvati i farmaci negli studi clinicidalla FDA negli ultimi due decenni. 6 Disparità tra culture 2D e l&#39;ambiente 3D complesso di cellule tumorali in vivo è una grave lacuna di sistemi di coltura monostrato. 7 Pertanto, lo screening di composti candidati contro le cellule tumorali in un ambiente che assomiglia più da vicino l&#39;ambiente tumore 3D potrebbe accelerare lo sviluppo di nuovi farmaci chemioterapici. 8 Sferoidi di cellule di cancro presentano un rilevante modello di tumore 3D in vitro. 9,10 Spheroids sono gruppi compatti che si formano attraverso l&#39;assemblaggio spontanea o indotta delle cellule tumorali su superfici non aderenti o in sospensione utilizzando tecniche come pallone filatore, overlay liquido, micro- microfabbricazione . ben array, microfluidica, e gocce appesi 11-16 Spheroids imitano le caratteristiche principali di tumori solidi, tra cui la geometria e il trasporto limitata di ossigeno, sostanze nutritive, e composti di droga nella zona centrale; di conseguenza, hanno più da vicino rigenerano respon drogase di tumori solidi rispetto a colture monostrato. 17-19 Nonostante questo notevole vantaggio, sferoidi non sono comunemente usate per lo screening di composti chimici contro le cellule tumorali. Difficoltà di produrre sferoidi uniformi dimensioni in un ambiente standard elevato rendimento che è compatibile con la robotica disponibili in commercio e strumenti di screening / immagini impedisce l&#39;incorporazione della cultura sferoide in pipeline di sviluppo di farmaci. Anche se i materiali personalizzati e piastre hanno recentemente resi disponibili in commercio per rispondere a questa esigenza, le considerazioni sui costi scoraggiare il loro uso diffuso. Due importanti tecniche con la capacità di produrre sferoidi dimensioni consistenti in un throughput elevato utilizzare una nuova piattaforma goccia pendente e microfabbricati micro-pozzetti. 13,16,20 Tuttavia, entrambi gli approcci richiedono piatti e dispositivi che sono costosi da produrre e scomodo per gli utenti endpoint speciali in centri di ricerca di base e le industrie farmaceutiche, dove la più grande efforti per la scoperta di nuovi farmaci anti-cancro sono fatti. Nonostante alcuni miglioramenti nella stabilità di gocce di cellule contenenti un recente disegno di appendere piastre goccia, solo ogni foro della piastra è ancora usato durante la coltura per evitare la diffusione / fusione di gocce. 16 Ciò riduce significativamente il throughput sperimentale. Inoltre e rinnovamento della droga è difficile con manuale o robotizzato pipettaggio e sferoidi devono essere trasferiti in una piastra standard per l&#39;analisi biochimica, perché questa configurazione targa non è facilmente compatibile con gli apparecchi tradizionali, come lettori di piastre. 21 micro-pozzetti fabbricati usando litografia soft anche consentire dimensione controllata produzione sferoide. 13,20 Tuttavia, l&#39;incompatibilità di questa piattaforma con strumenti di pipettaggio standard di trattamento impedisce di sferoidi individuali con composti farmacologici / concentrazioni diverse, esponendo tutti sferoidi a una sola condizione di trattamento. Così, questo metodo non è appropriato per altalo screening composti rendimento che richiede il test simultaneo di più composti / concentrazioni. Per superare questi ostacoli, è stata sviluppata una nuova tecnica per la produzione ad alta velocità di costantemente dimensioni sferoidi di cellule di cancro in piastre a 96 pozzetti standard. 22,23 L&#39;approccio si basa su un sistema polimerico acquoso bifase (ATPS) con polietilene glicole ( PEG) e destrano (DEX) polimeri in fase di formatura. 24 ATPSs sono state recentemente utilizzato in una varietà di applicazioni biologiche romanzo cellulari per consentire micropatterning cellulare e localizzata consegna dei reagenti biologici alle cellule in mezzi acquosi altamente. 25-32 Per formare un sferoide, le cellule tumorali sono mescolati con la fase acquosa DEX e un calo sub-microlitri della sospensione risultante viene pipettato in una immersione soluzione fase PEG acquosa contenente bene. La goccia rimane immiscibile dalla fase di immersione e cellule limita a facilitare la formazione di uno sferoide. Diavolettoortantly, la fase di immersione molto acquosa fornisce sostanze nutritive alle cellule della sferoide e minimizza il problema ben noto dei media evaporazione comune ad alcuni altri test che causano i cambiamenti nei mezzi osmolalità e le fluttuazioni delle concentrazioni di droga. Questa tecnica permette la produzione sferoide e trattamento farmacologico solo utilizzando reagenti disponibili in commercio e strumenti di dispensazione in piastre da 96 pozzetti standard. È importante sottolineare che l&#39;analisi delle risposte cellulari di sferoidi viene eseguita nella stessa piastra utilizzando saggi biochimici standard e lettori di piastre. La facilità di lavorare con ATPS e adattabilità del approccio alla gestione dei liquidi robotizzato fa generazione ad alto rendimento sia mono-cultura e di co-coltura sferoidi una tecnica di laboratorio semplice. Questo nuovo approccio sarà un importante passo avanti verso l&#39;integrazione di sferoidi di cellule di cancro nei processi di sviluppo di farmaci e di scoperta con una migliore velocità di test e di costo-efficacia (un numero crescente di composti e Redu testaticonsumo di reagente ced) e l&#39;efficienza (riduzione hands-on tempo). Un protocollo dettagliato per la produzione robotizzata di sferoidi di cellule di cancro in piastre da 96 pozzetti utilizzando l&#39;approccio ATPS è descritto di seguito. Inoltre, i dettagli di trattamento farmacologico di sferoidi conseguenti e analisi a valle delle risposte cellulari utilizzando un test biochimico commerciale sono presentati.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents and Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol, Mw: 35,000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>94646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Mw: 500,000</td>
			<td>Pharmacosmos</td>
			<td>5510 0500 9007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12306C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clacein AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C3100MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>33342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>Spectrum Chemicals</td>
			<td>15663-27-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrestoBlue</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-13261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-108</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>542342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Tips (10 &#181;l)</td>
			<td>Fluotics</td>
			<td>C-P10V11.ST</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Tips (70 &#181;l)</td>
			<td>Fluotics</td>
			<td>C-P70V11.ST</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom 96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Handler</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>SRT Bravo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>Biotek Instruments</td>
			<td>Synergy H1M</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

robotic production of cancer cell spheroids with an aqueous two-phase system for drug testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

La workstation del gestore liquido robotizzato è mostrato in Figura 1. La testa di pipettaggio e tutte le stazioni utilizzati nella stampa robotico di sferoidi nella sezione 4.6 sono etichettati. L&#39;immagine mostra l&#39;uso di due diverse stazioni per scatole di tip (una serie di punte per la miscelazione e la seconda serie di aspirazione / erogazione di cellula miscela fase DEX sospensione acquosa). L&#39;intera configurazione è alloggiato all&#39;interno di un armadio standard di sicurezza biologica per mantenere la sterilità. La figura 2 illustra uno schema del processo di &quot;stampa&quot; con il sistema a due fasi acquosa. Un puntale caricato con la sospensione cellulare nella fase acquosa DEX (blu, fase patterning) si abbassa in un pozzo fondo rotondo di una piastra a 96 pozzetti contenente la fase acquosa PEG (rosa, fase di immersione) per erogare il contenuto vicino a fondo del pozzetto. La fase risultante calo DEX limita le cellule tumorali di dispersione e incoraggia le interazioni cellula-cellula che provocanoaggregazione delle cellule e formazione sferoide. Formazione Spheroid è spontanea ed avviene entro 24 h di incubazione, come mostrato nella figura sperimentale di figura 2. In pratica, stampa sferoidale viene eseguita colonna per colonna in piastre da 96 pozzetti. Dopo formano sferoidi, mezzo di coltura viene rinnovato mediante aggiunta diretta di terreno fresco, convertendo il sistema a due fasi ad una singola fase acquosa. Questa transizione è dovuto alla riduzione delle concentrazioni di PEG e DEX di sotto di una soglia di concentrazione necessaria per la separazione di fasi acquose PEG e DEX. Erogazione di un meccanismo di spostamento d&#39;aria pipettaggio convenzionale del liquid handler è stato ottimizzato in modo parametrico e si è constatato che l&#39;altezza di erogazione di 0,5 mm, una portata di erogazione del minore di 1 ml / sec seguita da erogare 0,2 ml di pre-aspirato volume d&#39;aria produce la dimensione più consistente di DEX acquosa gocce, e quindi sferoidi. 23 Figura dis 3agioca la distribuzione del diametro di 96 sferoidi da una piastra con un diametro medio di 332 ± 31 micron. L&#39;esperienza precedente mostra che questo approccio genera tipicamente sferoidi con l&#39;8% -10% errore standard intorno al diametro medio. Figura 3b mostra la distribuzione della frequenza di diametro sferoidi della stessa piastra come in figura 3a, dimostrando che i diametri sono distribuiti normalmente. Successivamente, il potenziale di questo approccio per lo screening composti in piastre da 96 pozzetti standard e analisi delle risposte cellulari nelle stesse piastre, senza necessità di trasferire sferoidi alle nuove piastre è stata dimostrata. La Figura 4 mostra uno studio di dose-dipendente della redditività di MDA -MB-157 seno sferoidi di cellule di cancro trattati con un farmaco chemioterapico clinico, cisplatino. Sferoidi droga trattati e di controllo sono state incubate con un reagente PrestoBlue commerciale (cellule viabilità reattivo). Cellule enzimaticamente attivi ridotto il reagent e comportato un cambiamento del colore del supporto e un cambiamento nel segnale fluorescente. Il cambiamento di segnale era grande con cellule vive (ad esempio, in sferoidi di controllo). La vitalità delle cellule tumorali in sferoidi è diminuita con l&#39;aumentare della concentrazione di farmaco superiore a 1 micron. Questa prova ha determinato una concentrazione di farmaco dose letale 50% di LD50 = 4.67 mM. Questa tecnologia sistema bifasico acquosa per cultura 3D permette la produzione diretta di modelli tumorali più realistici includendo altri componenti di microambienti cellulari come supporto cellule stromali. E &#39;stato dimostrato in precedenza che comprese le cellule stromali in culture 3D modula la crescita, la proliferazione e l&#39;invasione delle cellule tumorali. 33-35 come un proof-of-concept sferoidi esperimento, co-coltura sono stati generati dalla combinazione di MDA-MB-157 materno le cellule tumorali e fibroblasti umani a un rapporto di 50:. 1 36 Prima di esperimenti, le cellule MDA-MB-157 e fibroblasti erano macchiaticon un colorante nucleare (blu) e colorante cellule vive (verde), rispettivamente, per consentire il rilevamento di immagini in cellule fluorescenti. Figura 5a mostra immagini fluorescenti e fase di sferoidi co-coltura con una densità di 1,5 x 10 4 cellule e 50 :. 1 rapporto tra cellule tumorali e fibroblasti Figura 5b mostra sferoidi di controllo MDA-MB-157 cellule per il confronto. Questo approccio consentirà valutare l&#39;effetto delle cellule stromali su vari fenotipi di cellule tumorali. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52754/52754fig1.jpg" /> Piattaforma Manipolazione Figura 1. Liquid. Il gestore liquido è costituito da stazioni in cui miscelazione suggerimenti, consigli di erogazione, di dialogo suggerimenti rifiuti, piatto di origine, e le posizioni piastra destinazione sono collocati. La posizione di ciascuna stazione è definito nel protocollo. Punte di miscelazione vengono caricati su una colonna della testa di pipettaggio e utilizzati per miscelare la soluzione della fase acquosa DEX<html> contenente cellule nella piastra di origine. Questi suggerimenti vengono poi smaltiti nella casella discariche e le punte di erogazione sono inseriti sulla stessa colonna della testa pipettaggio. Questi suggerimenti aspirare 0,3 ml della fase acquosa contenente DEX cellule dalla piastra sorgente e dispensare nella piastra di destinazione per formare gocce di cellule contenenti della fase DEX all&#39;interno fase già nei pozzetti della piastra di destinazione immersione PEG. Infine questi suggerimenti sono smaltiti in scatola discariche per completare un ciclo di stampa. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52754/52754fig2.jpg" /> Figura 2. La formazione Spheroid. Il gestore liquido eroga 0,3 ml di fase acquosa DEX (blu) contenente cellule (verde) in un pozzetto contenente la soluzione acquosa di PEG (rosa). Ciò provoca la formazione di uno sferoide dopo 24 ore di incubazione, come illustrato nell&#39;immagine a destra. Scale bar 200 micron.tps: //www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52754/52754fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52754/52754fig3highres.jpg" width="600" /> Figura 3. Spheroid Coerenza dei dati. (A) Distribuzione di diametro di sferoidi misurati da una piastra a 96 pozzetti, ogni punto rappresenta uno sferoide. (B) la distribuzione di frequenza dei diametri mostra normale distribuzione dei dati. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52754/52754fig4highres.jpg" width="600" /> Figura 4. Drug Risposta Spheroids. La vitalità delle cellule MDA-MB-157 sferoidi di cellule di cancro al seno riduce con aumento della concentrazione di cisplatino oltre 1 nM-200 gamma mM. La linea tratteggiata è una misura sigmoidale ai dati redditività. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52754/52754fig5.jpg" /> Figura 5. Co-Cultura Spheroids (a) fluorescente (a sinistra) e contrasto di fase (a destra) le immagini di sferoidi di MDA-MB-157 cellule del cancro al seno (blu) co-coltura con fibroblasti (verde) a 50:. 1 Rapporto. (B) Spheroids di MDA-MB-157 cellule sono mostrati per il confronto. Bar Scala 100 micron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52754/52754fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

Produzione robotica di Cancer Cell Spheroids con un sistema acquoso bifase per Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.9K Views.  The University of Akron. A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

Video: Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells within a tissue, however, are typically encased within a closely packed tissue mass in which cells establish intimate connections with many near-neighbors and with extracellular matrix components. Accordingly, the chemical milieu and physical forces experienced by cells within a 3D tissue are fundamentally different than those experienced by cells grown in monolayer culture. This has been shown to markedly impact cellular morphology and signaling. Several methods have been devised to generate 3D cell cultures including encapsulation of cells in collagen gels1or in biomaterial scaffolds2. Such methods, while useful, do not recapitulate the intimate direct cell-cell adhesion architecture found in normal tissues. Rather, they more closely approximate culture systems in which single cells are loosely dispersed within a 3D meshwork of ECM products. Here, we describe a simple method in which cells are placed in hanging drop culture and incubated under physiological conditions until they form true 3D spheroids in which cells are in direct contact with each other and with extracellular matrix components. The method requires no specialized equipment and can be adapted to include addition of any biological agent in very small quantities that may be of interest in elucidating effects on cell-cell or cell-ECM interaction. The method can also be used to co-culture two (or more) different cell populations so as to elucidate the role of cell-cell or cell-ECM interactions in specifying spatial relationships between cells. Cell-cell cohesion and cell-ECM adhesion are the cornerstones of studies of embryonic development, tumor-stromal cell interaction in malignant invasion, wound healing, and for applications to tissue engineering. This simple method will provide a means of generating tissue-like cellular aggregates for measurement of biomechanical properties or for molecular and biochemical analysis in a physiologically relevant model.

We describe a simple, rapid method of generating 3D tissue-like spheroids and their potential application to quantify differences in cell-cell interactions.

Un semplice Hanging goccia Cultura protocollo cellulare per la generazione di sferoidi 3D

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

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Bioingegneria

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

Cella Co-cultura Patterning Uso acquose due sistemi monofase

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically relevant than conventional adherent-sheet cultures, they more accurately recapitulate the complexity and interactions present in real tumors. In order to harness this model to better assess tumor biology, or the efficacy of novel therapeutic agents, it is necessary to be able to generate spheroids reproducibly, in a controlled manner and in significant numbers.
The AggreWell system consists of a high-density array of pyramid-shaped microwells, into which a suspension of single cells is centrifuged. The numbers of cells clustering at the bottom of each microwell, and the number and ratio of distinct cell types involved depend only on the properties of the suspension introduced by the experimenter. Thus, we are able to generate tumor spheroids of arbitrary size and composition without needing to modify the underlying platform technology. The hundreds of microwells per square centimeter of culture surface area in turn ensure that extremely high production levels may be attained via a straightforward, nonlabor-intensive process. We therefore expect that this protocol will be broadly useful to researchers in the tumor spheroid field.

We introduce a protocol for the generation of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of uniform size- and composition-controlled tumor spheroids, using commercially available microwell plates.

Produzione di grandi numeri di-Size controllata Tumore Spheroids Uso micropiastra

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically ...

Robotic Mirror Therapy System for Functional Recovery of Hemiplegic Arms

Mirror therapy has been performed as effective occupational therapy in a clinical setting for functional recovery of a hemiplegic arm after stroke. It is conducted by eliciting an illusion through use of a mirror as if the hemiplegic arm is moving in real-time while moving the healthy arm. It can facilitate brain neuroplasticity through activation of the sensorimotor cortex. However, conventional mirror therapy has a critical limitation in that the hemiplegic arm is not actually moving. Thus, we developed a real-time 2-axis mirror robot system as a simple add-on module for conventional mirror therapy using a closed feedback mechanism, which enables real-time movement of the hemiplegic arm. We used 3 Attitude and Heading Reference System sensors, 2 brushless DC motors for elbow and wrist joints, and exoskeletal frames. In a feasibility study on 6 healthy subjects, robotic mirror therapy was safe and feasible. We further selected tasks useful for activities of daily living training through feedback from rehabilitation doctors. A chronic stroke patient showed improvement in the Fugl-Meyer assessment scale and elbow flexor spasticity after a 2-week application of the mirror robot system. Robotic mirror therapy may enhance proprioceptive input to the sensory cortex, which is considered to be important in neuroplasticity and functional recovery of hemiplegic arms. The mirror robot system presented herein can be easily developed and utilized effectively to advance occupational therapy.

We developed a real-time mirror robot system for functional recovery of hemiplegic arms using automatic control technology, conducted a clinical study on healthy subjects, and determined tasks through feedback from rehabilitation doctors. This simple mirror robot can be applied effectively to occupational therapy in stroke patients with a hemiplegic arm.

Sistema di terapia robotica Specchio per il recupero funzionale di emiplegici Arms

Mirror therapy has been performed as effective occupational therapy in a clinical setting for functional recovery of a hemiplegic arm after stroke. It is ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful research tools for studying human health and disease. To characterize the barrier function of cell layers cultured inside organ-on-chip devices, often transendothelial or transepithelial electrical resistance (TEER) is measured. To this end, electrodes are usually integrated into the chip by micromachining methods to provide more stable measurements than is achieved with manual insertion of electrodes into the inlets of the chip. However, these electrodes frequently hamper visual inspection of the studied cell layer or require expensive cleanroom processes for fabrication. To overcome these limitations, the device described here contains four easily integrated electrodes that are placed and fixed outside of the culture area, making visual inspection possible. Using these four electrodes the resistance of six measurement paths can be quantified, from which the TEER can be directly isolated, independent of the resistance of culture medium-filled microchannels. The blood-brain barrier was replicated in this device and its TEER was monitored to show the device applicability. This chip, the integrated electrodes and the TEER determination method are generally applicable in organs-on-chips, both to mimic other organs or to be incorporated into existing organ-on-chip systems.

This publication describes the fabrication of an organ-on-chip device with integrated electrodes for direct quantification of transendothelial electrical resistance (TEER). For validation, the blood-brain barrier was mimicked inside this microfluidic device and its barrier function was monitored. The presented methods for electrode integration and direct TEER quantification are generally applicable.

Fabbricazione e validazione di un sistema di organo-on-chip con elettrodi integrati direttamente quantificare transendoteliale resistenza elettrica

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

Reprimere la trascrizione genica reindirizzando macchinario cellulare con modificatori epigenetici chimici

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

Uso di High-Throughput Microbioreactor sistema automatizzato per la produzione del modello IgG1 in cellule CHO

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using Chinese hamster ovary (CHO) cells, culture and process conditions must be optimized to maximize antibody titers and achieve target quality profiles. Typically, this optimization uses automated microscale bioreactors (15 mL) to screen multiple process conditions in parallel. Optimization criteria include culture performance and the critical quality attributes (CQAs) of the monoclonal antibody (mAb) product, which may impact its efficacy and safety. Culture performance metrics include cell growth and nutrient consumption, while the CQAs include the mAb's N-glycosylation and aggregation profiles, charge variants, and molecular weight. This detailed protocol describes how to purify and subsequently analyze HCCF samples produced by an automated microbioreactor system to gain valuable performance metrics and outputs. First, an automated protein A fast protein liquid chromatography (FPLC) method is used to purify the mAb from harvested cell culture samples. Once concentrated, the glycan profiles are analyzed by mass spectrometry using a specific platform (refer to the Table of Materials). Antibody molecular weights and aggregation profiles are determined using size exclusion chromatography-multiple angle light scattering (SEC-MALS), while charge variants are analyzed using microchip capillary zone electrophoresis (mCZE). In addition to the culture performance metrics captured during the bioreactor process (i.e., culture viability, cell counts, and common metabolites including glutamine, glucose, lactate, and ammonia), spent media is analyzed to identify limiting nutrients to improve the feeding strategies and overall process design. Therefore, a detailed protocol for the absolute quantification of amino acids by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) of spent media is also described. The methods used in this protocol take advantage of high-throughput platforms that are compatible for large numbers of small-volume samples.

A detailed protocol for the purification and subsequent analysis of a monoclonal antibody from harvested cell culture fluid (HCCF) of automated microbioreactors has been described. Use of analytics to determine critical quality attributes (CQAs) and maximizing limited sample volume to extract vital information is also presented.

Purificazione e analisi di un anticorpo monoclonale da cellule ovaio Cesster cinese utilizzando un sistema microbioreante automatizzato

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

A Spine Robotic-Assisted Navigation System for Pedicle Screw Placement

Pedicle screw implantation has excellent treatment effects and is often used by surgeons in spinal fusion surgery. However, due to the complexity of human body anatomy, this surgical procedure is difficult and challenging, especially in minimally invasive surgery or patients with congenital anomalies and kyphoscoliosis deformity. In addition to the abovementioned factors, the surgical experience and technique of the surgeon also affect the recovery rates and complications of the patients after the surgical operation. Therefore, accurately performing pedicle screw implantation has is a constant topic of common concern for surgeons and patients. In recent years, with the technological development, robot-assisted navigation systems have gradually become adopted. These robot-assisted navigation systems provide surgeons with complete preoperative planning before surgery. The system provides 3D reconstructed images of each vertebra, allowing surgeons to understand the patient&#39;s physiological characteristics more quickly. It also provides 2D images of sagittal, coronal, axial and oblique planes so that surgeons can accurately perform pedicle screw placement plan.
Previous studies have demonstrated the effectiveness of robot-assisted navigation systems for pedicle screw implantation procedures, including accuracy and safety assessments. This step-by-step protocol aims to outline a standardized surgical technique note for robotic-assisted pedicle screw placement.

This article presents a standardized surgical technique for robotic-assisted pedicle screw placement by using robotic-assisted navigational systems. We present a step-by-step protocol and describe the workflow and precautions of this procedure.

Un sistema di navigazione assistita robotica spine per il posizionamento delle viti della pedicina

Pedicle screw implantation has excellent treatment effects and is often used by surgeons in spinal fusion surgery. However, due to the complexity of human ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested cell culture fluid. While traditional methods like centrifugation or filtration are widely implemented for cell removal, the equipment for these processes have large footprints and operation can involve contamination risks and filter fouling. Additionally, traditional methods may not be ideal for continuous bioprocessing schemes for primary clarification. Thus, an alternate application using acoustic (sound) waves was investigated to continuously separate cells from the cell culture fluid. Presented in this study is a detailed protocol for using a bench-scale acoustic wave separator (AWS) for the primary separation of culture fluid containing a monoclonal IgG1 antibody from a CHO cell bioreactor harvest. Representative data are presented from the AWS and demonstrate how to achieve effective cell clarification and product recovery. Finally, potential applications for AWS in continuous bioprocessing are discussed. Overall, this study provides a practical and general protocol for the implementation of AWS in primary clarification for CHO cell cultures and further describes its application potential in continuous bioprocessing.

Presented here is a protocol for the primary clarification of CHO cell culture using an acoustic separator. This protocol can be used for the primary clarification of shake flask cultures or bioreactor harvests and has the potential application for continuous clarification of the cell bleed material during perfusion bioreactor operations.

Chiarificazione primaria del fluido di coltura cellulare raccolto da CHO utilizzando un separatore acustico

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...