This work is supported by a grant awarded to MNH by Children's Healthcare of Atlanta, the APS 2014 Short-Term Research Education Program to Increase Diversity in Health-Related Research (STRIDE) fellowship awarded to PT, and the University of Notre Dame Integrated Imaging Facility.

Tutte le tecniche sperimentali devono essere condotte in conformità con le linee guida istituzionali di cura e del Comitato Usa. 1. X-ray Imaging Acquisition <ol><li> Panoramica del software (vedi Figura 1 per una panoramica delle Impostazioni del software). <ol><li> Selezionare il pulsante Cattura direttamente sotto la scheda File. </li><li> Nel menu a discesa Impostazioni, selezionare sessione corrente. </li><li> Selezionare Esposizione standard nella casella a discesa posto sotto Tempo di esposizione. </li><li> Impostare il tempo di esposizione a 2,00 min, e n Le esposizioni verso 1. Impostare la X e Y Binning categorizzazione a 2 pixel. Vedere la Figura 1. </li><li> Selezionare accumulo finale dal menu a discesa Opzioni di esportazione. </li><li> Nelle impostazioni di illuminazione, seleCT a raggi X dal menu a discesa Fonte di illuminazione. Il valore predefinito KVP è fissato a 35. </li><li> Selezionare Autoselect nel menu Applicare il file di riferimento discesa per applicare il file di riferimento a raggi X corrispondente. (Vedere paragrafo 2). </li><li> Nella fotocamera impostata impostazioni, impostare l&#39;f-stop a 2.51. </li><li> Impostare il FOV (campo visivo) a 125.64 per topi PN10. </li><li> Impostare il piano focale a 13, e nel menu a discesa accanto al dispositivo di scorrimento piano focale, selezionare X-Ray. </li><li> Per i raggi X, impostare il filtro di eccitazione e il filtro per le emissioni a 0 nel menu a discesa. </li><li> Salva sessione corrente facendo clic su Nuovo sulla parte superiore accanto a Impostazioni. Inserire il nome per la nuova Acquisisci impostazioni del file, ad esempio, &quot;Evento Giove singola esposizione per fare un protocollo.&quot; Vedere la Figura 2. </li></ol&gt; </li><li> Creazione di un protocollo di imaging a raggi X <ol><li> Fare clic sul pulsante Crea / Modifica protocolli sul lato destro della finestra aperta. </li><li> Come appare la finestra pop-up nuovo protocollo, fare clic sul pulsante Nuovo nell&#39;angolo in alto a destra </li><li> Inserire il nome che il protocollo salverà sotto, ad esempio &quot;Giove Demo Protocol&quot;, e fare clic su OK. (Vedi figura 3). </li><li> Nella parte inferiore della finestra pop-up protocollo nel protocollo passaggi, assicurarsi che Fase 1 è evidenziata in rosso, Capture Nuove Immagini è selezionata, e non fare nulla è selezionato nel menu a discesa Prima di Acquisizione Immagine. </li><li> In Capture Impostazioni, selezionare l&#39;evento esposizione singola di recente generato dal punto 1.1.12. </li><li> Selezionare Wait (sec) dal menu a discesa Dopo Acquisizione Immagine. </li><li> Fare clic sul pulsante Modifica, tipe 180 nella casella di pop-up, e fare clic su OK per aggiungere un 3 min tempo di attesa dopo ogni acquisizione 2 min. </li><li> Duplicate Passo 1 facendo clic destro sulla scheda Fase 1 e Fase selezionando Duplica. Creare 23 duplicati per un periodo di osservazione di 2 ore. (Vedi Figura 4). </li><li> Sul passo finale (punto 24), modificare l&#39;immagine Dopo l&#39;impostazione per non fare niente da Wait (sec) Capture. </li><li> Fare clic sul pulsante Salva e uscire dall&#39;editor protocollo. </li></ol></li></ol> 2. File di riferimento di illuminazione Nota: Applicare file di riferimento illuminazione a raggi X ad una immagine a raggi X per correggere automaticamente le variazioni di rivelatore uniformità delle immagini a raggi X ottenuti durante esperimento. Le procedure descritte di seguito sono specifiche per la Bruker imaging in vivo sistemi animali; altri sistemi di imaging in vivo puòessere usato. <ol><li> Generare un file di riferimento illuminazione aprendo il software di imaging molecolare e facendo clic sul pulsante Cattura. </li><li> Utilizzando il menu a comparsa, stabilire le impostazioni di acquisizione dei raggi X a Fonte di illuminazione (vedere Impostazioni di cui alla sezione 1) e poi selezionare riferimento Illuminazione nel tipo di esposizione. Questo può essere trovato sotto le esposizioni standard casella a discesa. (Vedi figura 5). </li><li> Rimuovere tutti i campioni dalla stazione di immagine. Impostare il binning X e Y a 4 x 4 binning. Fare riferimento alla Tabella 1: tempi di esposizione file di riferimento illuminazione per determinare il tempo di esposizione accurata. </li><li> Press Expose. </li><li> Applicare il file di riferimento selezionando Selezione automatica dal menu a discesa sotto Applicare file di riferimento. (Vedi figura 6). Il file di riferimento illuminazione sarà ora applicato automaticamente a tutti im raggi Xetà catturati con le stesse impostazioni della fotocamera. I passaggi 2,1-2,4 non dovrà essere ripetuta se stesse impostazioni della fotocamera sono utilizzati in esperimenti successivi. Nota: Un file di riferimento illuminazione può essere applicata dopo l&#39;acquisizione delle immagini, o se un messaggio di errore si verifica dopo l&#39;auto-selezione dei file di riferimento. Applicare l&#39;illuminazione file di riferimento cattura post-immagine utilizzando la seguente serie di comandi nel pannello di navigazione del software di imaging molecolare: Immagine&gt; Immagine matematica&gt; Tipo: Task&gt; Calcolare: correzione illuminazione. Selezionare l&#39;immagine in ingresso (X) che si desidera applicare il file di riferimento illuminazione (Y). Rinominare il file corretto (Z). (Vedi Figura 7). </li></ol> Manipolazione 3. Animal <ol><li> L&#39;acquisizione di animali <ol><li> Acquisto dighe in stato di gravidanza da allevatori commerciale o allevare topi femmina in casa a 12 settimane di età (o più) in conformità con le linee guida istituzionaliS. </li><li> Casa topi neonati con madri che allattano fino al giorno postnatale (PN) 10. </li></ol></li><li> Anestesia animali (PN 10) <ol><li> Preparare un cocktail ketamina / xylazina per anestetizzare PN 10 topi per effetti anestetici prolungati della durata massima di 40 min. Aggiungere 500 ml di ketamina (100 mg / ml) a 75 ml di xilazina (100 mg / ml). Diluire 1:10 in una soluzione salina allo 0,9% per fare una ketamina (100 mg / kg) / xilazina (10 mg / kg) cocktail anestetico. </li><li> Pesare i topi appena nati. </li><li> Utilizzando una siringa 3/10 con un ago 31 G 5/16 pollici (8 mm), somministrare 10 ml / g di peso corporeo di anestesia con una iniezione intraperitoneale. </li><li> Mantenere gli animali asciutto e coibentato per evitare la perdita eccessiva di calore del corpo. </li></ol></li></ol> 4. tracheale Instillazioni <ol><li> Preparare una soluzione salina intratracheale composto da 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl 2, e 10 mM HEPES; pH = 7.4. La osmolalità della soluzione deve essere319 mosmol / kg H 2 O. </li><li> Monte anestetizzato animali lato ventrale up su una tavola inclinata chirurgica con del nastro chirurgico. Ensurethat teste degli animali sono in cima della salita. </li><li> Eseguire un pizzico punta a garantire che gli animali sono anestetizzati e pronti per la chirurgia. Disinfettare tutte le aree chirurgiche, strumenti e regione toracica dell&#39;animale. </li><li> Fare una piccola (3 mm) incisione sotto l&#39;aspetto ventrale antero-mediale della (regione della gola) del collo utilizzando un bisturi chirurgico, dimensione 11. mettere da parte il platisma e anteriore muscoli tracheale con pinze smussati in modo da visualizzare e accedere alla trachea. </li><li> Instillare 3 ml / g di peso (circa 10 - 30 ml di volume finale) di soluzione fisiologica attraverso la trachea esposto usando un ago 31 G 5/16 pollici (8 mm). L&#39;incisione minore viene lasciato aperto durante l&#39;imaging animale e di solito si guarisce bene. Consultare divisione locale di risorse animali per determinare se l&#39;incisione allo stesso modo può essere lasciata aperta. In caso contrario, può sutureessere richiesto. </li></ol> 5. Imaging Animal <ol><li> Posizionare i cuccioli ventrale su una chiara fondo, estraibile, vassoio di imaging animale. Centrare gli animali così che il fascio di raggi X verrà direttamente sopra la zona toracica. </li><li> Per dispari coorti di animali numerati, posizionare il primo cucciolo direttamente nel centro del vassoio, e per le coorti anche numerato il primo cucciolo appena a sinistra del centro in modo che quando gli altri animali sono posizionati sul vassoio tutti gli animali sono centrati. </li><li> Riportare il vassoio di imaging per il mobile imaging a raggi X e chiudere la porta dell&#39;armadio. </li><li> Accendere l&#39;unità di controllo termico all&#39;animale di mantenere la temperatura corporea degli animali anestetizzati. Utilizzare l&#39;impostazione alta per ottenere una temperatura della camera di circa 35-37 ° C. Accendere l&#39;unità animale anestesia (isoflurano vaporizzato distribuito mediante ossigeno) per garantire gli animali sono anestetizzati e immobilizzati per tutta la durata della procedura di imaging 2 ore. </li><li> protocollo di imaging Esecuzione a raggi X<ol><li> Clicca sulla cattura e selezionare il protocollo appropriato, ad esempio, &quot;Giove Demo protocollo,&quot; dal menu a discesa Protocollo. (Vedere Figura 8). </li><li> Fare clic sul pulsante Esegui protocollo selezionato il software di imaging molecolare. Nota: Viene visualizzata una finestra pop-up per monitorare lo stato della acquisizione delle immagini, quando il protocollo è completata la finestra scompare. La dose di raggi X è bassa, &lt;di 0,3 mrem o circa 10 volte meno di un dentale X-ray. Come con altre procedure X-Ray, non c&#39;è nessuna radiazione residua. </li><li> Quando la sessione di acquisizione 2 ore, rimuovere gli animali dal vassoio di imaging e restituirli alla loro gabbia. Monitorare gli animali per il pieno recupero prima di tornare a rack. </li></ol></li></ol> Analisi 6. Dati Nota: il software di imaging molecolare permette per la quantificazione e la traduzione di Xray intensità dei pixel in frequenza della clearance fluido polmonare. Le seguenti procedure delineano le procedure necessarie per normalizzare le immagini a raggi X e quantificare intensità nelle regioni definite di interesse (ROI). <ol><li> Progettare un modello di ROI Nota: Una regione di template interesse deve essere creata specifico per le immagini radiografiche acquisite durante lo studio 2 hr, e deve essere usato per comparare le intensità dei raggi X tra i gruppi sperimentali. Da piccoli volumi di soluzione salina sfide tipicamente accumulano nel lobo superiore sinistro del polmone 4-6, il ROI (s) dovrebbe concentrarsi su questa parte del polmone. <ol><li> Aprire la prima e l&#39;ultima immagine a raggi x nel set di 2 ore. Selezionare la finestra dell&#39;immagine prima x-ray. </li><li> Nella barra degli strumenti di navigazione, selezionare Manuale-ROI&gt; Nuovo ROI Set. </li><li> Clicca ROI Ellisse e creare un ROI che copre adeguatamente il mouse a destra lung.An ROI non è definito fino a quando il rosso, ha delineato il ROI è il dragged in una posizione diversa. Un ROI definita verrà delineata in blu con un numero. </li><li> Se più cuccioli vengono esposte, clicca con il rosso, il ROI delineato e trascinare per i polmoni a sinistra degli altri topi per creare più ROI individuale nello stesso set. Trascinare il rosso, ROI delineato in una zona con un fondo chiaro per creare un ROI sfondo. <ol><li> Selezionare puntatore di selezione per posizionare le ROI a giacere sopra polmone sinistro di ogni mouse, direttamente sotto la seconda costola. </li></ol></li><li> Nella barra degli strumenti superiore, fare clic su display LCD. </li><li> Controllare Overlay nella finestra di visualizzazione delle immagini per sovrapporre l&#39;ultima immagine a raggi x, pur mantenendo le posizioni set ROI. Se necessario, selezionare puntatore di selezione nella barra degli strumenti di navigazione per regolare le posizioni del ROI e garantire una copertura adeguata del polmone in entrambe le immagini. </li><li> Nella finestra di dialogo ROI manuale, selezionare Modello&gt; Salva come modello. nome tegli modello e fare clic su OK. </li><li> Chiudere entrambe le immagini. Selezionare No quando viene richiesto di salvare le modifiche. </li><li> Applicare il modello di ROI per ogni immagine a raggi X catturato per analizzare gioco fluido con l&#39;apertura di tutte le immagini scattate nel corso dello studio. Inizia selezionando un file aperto e fare clic su ROI Manuale&gt; Modello. </li><li> Selezionare il modello ROI creato in precedenza dal menu a discesa e fare clic su Applica a tutti i documenti aperti. </li></ol></li><li> Export numerica ROI dati dalle immagini su un foglio di calcolo <ol><li> Nell&#39;angolo in alto a sinistra, fare clic su File&gt; Esporta dati&gt; ROI. </li><li> Controllare come visualizzato e Auto Open in Excel nella finestra di pop-up. </li><li> Selezionare Esporta tutti aperti Documenti. </li><li> Assegnare un nome al file e fare clic su Salva. </li><li> Chiudi software di imaging molecolare. </li></ol></li></ol&gt;

<ol>
	<li>Institute of Laboratory Animal Resources. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , (2011).</li><li>Helms, M. N., Torres-Gonzalez, E., Goodson, P., Rojas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+tracheal+instillation+of+solutes+into+mouse+lung.">Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Hilgendorff, A., Reiss, I., Ehrhardt, H., Eickelberg, O., Alvira, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+lung+disease+in+the+preterm+infant.+Lessons+learned+from+animal+models.">Chronic lung disease in the preterm infant. Lessons learned from animal models.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 50, 233-245 (2014).</li><li>Goodson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nadph+oxidase+regulates+alveolar+epithelial+sodium+channel+activity+and+lung+fluid+balance+in+vivo+via+O2-+signaling.">Nadph oxidase regulates alveolar epithelial sodium channel activity and lung fluid balance in vivo via O2- signaling.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, L410-L419 (2012).</li><li>McNeilly, T. N., Tennant, P., Lujan, L., Perez, M., Harkiss, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+infection+efficiencies+of+peripheral+lung+and+tracheal+tissues+in+sheep+infected+with+Visna/maedi+virus+via+the+respiratory+tract.">Differential infection efficiencies of peripheral lung and tracheal tissues in sheep infected with Visna/maedi virus via the respiratory tract.</a> J Gen Virol. 88, 670-679 (2007).</li><li>Starcher, B., Williams, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+intratracheal+instillation+of+endotoxin+into+the+lungs+of+mice.">A method for intratracheal instillation of endotoxin into the lungs of mice.</a> Lab Anim. 23, 234-240 (1989).</li><li>Downs, C. A., Kumar, A., Kreiner, L. H., Johnson, N. M., Helms, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2O2+regulates+lung+ENaC+via+ubiquitin-like+protein+Nedd8.">H2O2 regulates lung ENaC via ubiquitin-like protein Nedd8.</a> J Biol Chem. 288, 8136-8145 (2013).</li><li>Gammon, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+anatomical,+molecular,+and+functional+imaging+of+the+lung+with+multiple+modalities.">Preclinical anatomical, molecular, and functional imaging of the lung with multiple modalities.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306, L897-L914 (2014).</li><li>Takemura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+regulation+of+epithelial+sodium+channels+in+rat+alveolar+type+2+epithelial+cells.">Cholinergic regulation of epithelial sodium channels in rat alveolar type 2 epithelial cells.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 304, L428-L437 (2013).</li><li>Lewis, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+the+lungs+using+x-ray+phase+contrast.">Dynamic imaging of the lungs using x-ray phase contrast.</a> Phys Med Biol. 50, 5031-5040 (2005).</li><li>Nyren, S., Radell, P., Mure, M., Petersson, J., Jacobsson, H., Lindahl, S. G., Sanchez-Crespo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhalation+anesthesia+increases+V/Q+heterogeneity+during+spontaneous+breathing+in+healthy+subjects.">Inhalation anesthesia increases V/Q heterogeneity during spontaneous breathing in healthy subjects.</a> Anesthesiology. 113 (6), 1370-1375 (2010).</li></ol>

Questo articolo fa parte di un numero speciale su Imaging multimodale pre-clinico, sponsorizzato da Bruker Biospin.

L&#39;utilizzo di immagini a raggi X, immagini nitide di polmoni neonatali possono essere analizzati per polmone volumi fluidi. Noi 7,3,11, e altri 10, hanno utilizzato con successo imaging a raggi X per determinare i cambiamenti dinamici nel volume del fluido polmonare in modelli animali liberamente respirazione anestetizzati, e questa tecnica rappresenta una grande promessa per far progredire lo studio del danno polmonare neonatale. Uno dei principali vantaggi nell&#39;utilizzo nostro approccio p...

Alla nascita, il polmone neonato deve passare da un secernenti liquido ad un organo riassorbire il fluido di stabilire una adeguata ventilazione e l&#39;ossigenazione del corpo. I meccanismi che facilitano (o ostacola) distanza effettiva di liquido polmonare al momento della nascita rimangono poco chiari. Modellazione il tasso di gioco fluido alveolare in C57BL / 6 cuccioli appena nati del mouse porterà a una migliore comprensione dei fattori normativi che possono migliorare o attenuare il tasso di assorbimento di liquidi. Potrebbe essere applicato anche ad altri modelli neonatali di danno polmonare acuto o infezione, e potrebbe portare a nuove strategie terapeutiche per neonati con distress respiratorio. Dal momento che i polmoni appena nati sono minuscoli rispetto ai polmoni adulti, misure convenzionali di spazio fluido alveolare che si basano su misurazioni di lavaggio o gravimetrici potrebbero non essere adatto per studiare con precisione spazio fluido polmonare in modelli polmone neonatale. In questo protocollo, dimostriamo un metodo che permette dila determinazione accurata della velocità di clearance fluidi alveolari in postnatali cuccioli giorno 10 C57BL / 6 del mouse con un piccolo imager animali. Uno dei principali vantaggi di utilizzare un approccio fluoroscopic è che gli animali vengono esposte in vivo. Essi sono liberamente respirazione e può recuperare da questo test minimamente invasiva per la futura osservazione e lo studio. L&#39;obiettivo generale di questo metodo è quello di modellare edema polmonare nel polmone neonato, e valutare il tasso di gioco fluido alveolare polmonare neonatale. Questa tecnica è stata sviluppata, in parte, come strategia di riduzione per diminuire il numero di animali necessari, ma massimizzare la produzione sperimentale. Questa tecnica consente inoltre di rilevazione superiore di volumi di fluido polmonari utilizzando immagini a raggi X e richiede competenza in moderazione animale base e trattare 1; piccoli interventi chirurgici su animali e tracheale instillazione 2, un piccolo imager animali, e software di base di analisi di immagine. Gli investigatori che desiderano valutare i volumi di fluido polmonare in vivo (liberamente Breathing anestetizzato modelli animali), può trovare questa procedura adatta per la loro applicazione. Infine, questo protocollo potrebbe aumentare di altri modelli esistenti di danno polmonare neonatale utilizzato nello studio meccanicistico di displasia broncopolmonare, tra cui lesioni iperossia indotta polmone, ventilazione meccanica, e modelli di infiammazione polmonare 3.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="826">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:443px;">Preclinical Imaging System (In- Vivo MS FX PRO)</td>
			<td style="width:241px;">Bruker; Billerica, MA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ketamine</td>
			<td>Ketaset; Fort Dodge Animal Health, IA</td>
			<td>26637-411-01</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xylazine</td>
			<td>Lloyd Laboratories; Shenandoah, IA</td>
			<td>4821</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (with Calcium and Magnesium)&#160;</td>
			<td>Lonza; Walkersville, MD</td>
			<td>17-513F</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium chloride</td>
			<td>Amresco; Solon, OH</td>
			<td>241</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassuim chloride</td>
			<td>Fisher Scientific; Fair Lawn, NJ</td>
			<td>P217-3</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich; St. Loius, MO</td>
			<td>C5080</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich; St. Loius, MO</td>
			<td>H3375</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.3 mL insulin syringe with 31Gx5/16&#34; (8mm) needle</td>
			<td>BD Insulin Syringe; Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>328438</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time x-ray imaging of lung fluid volumes in neonatal mouse lung

Alla nascita, il polmone subisce un interruttore fenotipica profonda da secrezione di assorbimento, che permette l&#39;adattamento alla respirazione indipendente. Promuovere e sostenere questo fenotipo è di fondamentale importanza nel normale scambio di crescita e di gas alveolari per tutta la vita. Diversi studi in vitro hanno caratterizzato il ruolo delle proteine ​​normativi chiave, molecole di segnalazione, e ormoni steroidei che possono influenzare il tasso di gioco fluido polmonare. Tuttavia, negli esami in vivo deve essere eseguita per valutare se questi fattori di regolazione giocano importanti ruoli fisiologici nella regolazione perinatale assorbimento del liquido polmonare. Come tale, l&#39;utilizzazione del tempo reale di immagini a raggi X per determinare perinatale passaggio fluido polmonare o edema polmonare, rappresenta un avanzamento tecnologico nel campo. Qui, spieghiamo e illustrare un approccio per valutare il tasso di alveolare spazio fluido polmonare e inondazioni alveolare in C57BL / 6 topi a post natale giorno ci 10ing imaging a raggi X e l&#39;analisi. Il successo di questo protocollo richiede l&#39;approvazione preventiva da parte la cura degli animali e sull&#39;uso di comitati istituzionali (IACUC), un sistema di imaging a raggi X per piccoli animali in vivo, e software di imaging molecolare compatibili.

I pannelli a sinistra nelle figure 9 - 10 sono di PN 10 polmoni del mouse imaged al basale (pre-instillato). Queste immagini mostrano instillazione successo di sfide salina nel lobo sinistro dei polmoni neonatali. Nella figura 9, il polmone del mouse è stato tracheally instillato con la soluzione salina definito sopra (vedi paragrafo 2.1). I pannelli centrali e di destra di figura 9 sono immagini a raggi X dello stesso topo ottenuto 5 m...

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Real-time X-ray Imaging of Lung Fluid Volumes in Neonatal Mouse Lung

We present a protocol to assess the rate of alveolar fluid clearance or pulmonary edema in neonatal mouse lung using X-ray imaging technology.

In tempo reale a raggi X Imaging del polmone volumi di fluido in neonatale topo polmone

At birth, the lung undergoes a profound phenotypic switch from secretion to absorption, which allows for adaptation to breathing independently. Promoting ...

real-time-x-ray-imaging-of-lung-fluid-volumes-in-neonatal-mouse-lung

Research

JoVE Journal

Medicine

8.6K Views.  Emory University. We present a protocol to assess the rate of alveolar fluid clearance or pulmonary edema in neonatal mouse lung using X-ray imaging technology. 

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X-ray Dose Reduction through Adaptive Exposure in Fluoroscopic Imaging

X-ray fluoroscopy is widely used for image guidance during cardiac intervention. However, radiation dose in these procedures can be high, and this is a significant concern, particularly in pediatric applications. Pediatrics procedures are in general much more complex than those performed on adults and thus are on average four to eight times longer1. Furthermore, children can undergo up to 10 fluoroscopic procedures by the age of 10, and have been shown to have a three-fold higher risk of developing fatal cancer throughout their life than the general population2,3.
We have shown that radiation dose can be significantly reduced in adult cardiac procedures by using our scanning beam digital x-ray (SBDX) system4-- a fluoroscopic imaging system that employs an inverse imaging geometry5,6 (Figure 1, Movie 1 and Figure 2). Instead of a single focal spot and an extended detector as used in conventional systems, our approach utilizes an extended X-ray source with multiple focal spots focused on a small detector. Our X-ray source consists of a scanning electron beam sequentially illuminating up to 9,000 focal spot positions. Each focal spot projects a small portion of the imaging volume onto the detector. In contrast to a conventional system where the final image is directly projected onto the detector, the SBDX uses a dedicated algorithm to reconstruct the final image from the 9,000 detector images.
For pediatric applications, dose savings with the SBDX system are expected to be smaller than in adult procedures. However, the SBDX system allows for additional dose savings by implementing an electronic adaptive exposure technique. Key to this method is the multi-beam scanning technique of the SBDX system: rather than exposing every part of the image with the same radiation dose, we can dynamically vary the exposure depending on the opacity of the region exposed. Therefore, we can significantly reduce exposure in radiolucent areas and maintain exposure in more opaque regions. In our current implementation, the adaptive exposure requires user interaction (Figure 3). However, in the future, the adaptive exposure will be real time and fully automatic.
We have performed experiments with an anthropomorphic phantom and compared measured radiation dose with and without adaptive exposure using a dose area product (DAP) meter. In the experiment presented here, we find a dose reduction of 30%.

We are developing a dynamic adaptive exposure technique using our scanning beam digital X-ray system. Rather than exposing an object uniformly, the exposure is adapted depending on the opacity of the object. Here we show an experiment on an anthropomorphic phantom that resulted in a dose saving of 30%.

X-ray riduzione della dose in caso di esposizione Adaptive in Imaging fluoroscopici

X-ray fluoroscopy is widely used for image guidance during cardiac intervention. However, radiation dose in these procedures can be high, and this is a ...

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Medicina

Segmentation and Measurement of Fat Volumes in Murine Obesity Models Using X-ray Computed Tomography

Obesity is associated with increased morbidity and mortality as well as reduced metrics in quality of life.1 Both environmental and genetic factors are associated with obesity, though the precise underlying mechanisms that contribute to the disease are currently being delineated.2,3 Several small animal models of obesity have been developed and are employed in a variety of studies.4 A critical component to these experiments involves the collection of regional and/or total animal fat content data under varied conditions.
Traditional experimental methods available for measuring fat content in small animal models of obesity include invasive (e.g. ex vivo measurement of fat deposits) and non-invasive (e.g. Dual Energy X-ray Absorptiometry (DEXA), or Magnetic Resonance (MR)) protocols, each of which presents relative trade-offs. Current invasive methods for measuring fat content may provide details for organ and region specific fat distribution, but sacrificing the subjects will preclude longitudinal assessments. Conversely, current non-invasive strategies provide limited details for organ and region specific fat distribution, but enable valuable longitudinal assessment. With the advent of dedicated small animal X-ray computed tomography (CT) systems and customized analytical procedures, both organ and region specific analysis of fat distribution and longitudinal profiling may be possible. Recent reports have validated the use of CT for in vivo longitudinal imaging of adiposity in living mice.5,6 Here we provide a modified method that allows for fat/total volume measurement, analysis and visualization utilizing the Carestream Molecular Imaging Albira CT system in conjunction with PMOD and Volview software packages.

Fat content analysis is routinely conducted in studies utilizing murine obesity models. Emerging methods in small animal CT imaging and analysis are providing for longitudinal detail rich fat content analysis. Here we detail step by step procedures for performing small animal CT imaging, analysis, and visualization.

Segmentazione e misurazione dei volumi FAT nei modelli murini di obesità Utilizzo di X-ray Tomografia Computerizzata

Obesity is associated with increased morbidity and mortality as well as reduced metrics in quality of life.1 Both environmental and genetic factors are ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

A simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or expensive animal. One of the reasons that this is not done more routinely is that it is relatively difficult, despite there being several published studies that describe ways to achieve it. In this paper we demonstrate a procedure that eliminates one of the major hurdles associated with this intubation, that of visualizing the trachea during the entire time of intubation. The approach uses a 0.5 mm fiberoptic light source that serves as an introducer to direct the intubation cannula into the mouse trachea. We show that it is possible to use this procedure to measure lung mechanics in individual mice over a time course of at least several weeks. The technique can be set up with relatively little expense and expertise, and it can be routinely accomplished with relatively little training. This should make it possible for any laboratory to routinely carry out this intubation, thereby allowing longitudinal studies in individual mice, thereby minimizing the number of mice needed and increasing the statistical power by using each mouse as its own control.

This paper describes a striaghforward and efficient method of intubating mice for pulmonary function measurements or pulmonary instillation, that allows the mice to recover and be studied at later times. The procedure involves an inexpensive fiberoptic light source that directly illuminates the trachea.

Un metodo semplice di intubazione mouse polmone

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

Liquido cerebrospinale MicroRNA profiling Utilizzando quantitativa Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Diagnostic Ultrasound Imaging of Mouse Diaphragm Function

Function analysis of rodent respiratory skeletal muscles, particularly the diaphragm, is commonly performed by isolating muscle strips using invasive surgical procedures. Although this is an effective method of assessing in vitro diaphragm activity, it involves non-survival surgery. The application of non-invasive ultrasound imaging as an in vivo procedure is beneficial since it not only reduces the number of animals sacrificed, but is also suitable for monitoring disease progression in live mice. Thus, our ultrasound imaging method may likely assist in the development of novel therapies that alleviate muscle injury induced by various respiratory diseases. Particularly, in clinical diagnoses of obstructive lung diseases, ultrasound imaging has the potential to be used in conjunction with other standard tests to detect the early onset of diaphragm muscle fatigue. In the current protocol, we describe how to accurately evaluate diaphragm contractility in a mouse model using a diagnostic ultrasound imaging technique.

Diagnostic ultrasound imaging has proven to be effective in diagnosing various respiratory diseases in human and animal subjects. We demonstrate a comprehensive ultrasound protocol utilized by Dr. Zuo's lab to analyze diaphragm kinetics specifically in mouse models. This is also a non-invasive research technique which can provide quantitative information on mouse respiratory muscle function.

Diagnostic Ultrasound Imaging di funzione mouse Diaframma

Function analysis of rodent respiratory skeletal muscles, particularly the diaphragm, is commonly performed by isolating muscle strips using invasive ...

Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis

Recent significant advances in stem cell research and bioengineering techniques have made great progress in utilizing biomaterials to regenerate and repair damage in simple tissues in the orthopedic and periodontal fields. However, attempts to regenerate the structures and functions of more complex three-dimensional (3D) organs such as lungs have not been very successful because the biological processes of organ regeneration have not been well explored. It is becoming clear that angiogenesis, the formation of new blood vessels, plays key roles in organ regeneration. Newly formed vasculatures not only deliver oxygen, nutrients and various cell components that are required for organ regeneration but also provide instructive signals to the regenerating local tissues. Therefore, to successfully regenerate lungs in an adult, it is necessary to recapitulate the lung-specific microenvironments in which angiogenesis drives regeneration of local lung tissues. Although conventional in vivo angiogenesis assays, such as subcutaneous implantation of extracellular matrix (ECM)-rich hydrogels (e.g., fibrin or collagen gels or Matrigel - ECM protein mixture secreted by Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells), are extensively utilized to explore the general mechanisms of angiogenesis, lung-specific angiogenesis has not been well characterized because methods for orthotopic implantation of biomaterials in the lung have not been well established. The goal of this protocol is to introduce a unique method to implant fibrin gel on the lung surface of living adult mouse, allowing for the successful recapitulation of host lung-derived angiogenesis inside the gel. This approach enables researchers to explore the mechanisms by which the lung-specific microenvironment controls angiogenesis and alveolar regeneration in both normal and pathological conditions. Since implanted biomaterials release and supply physical and chemical signals to adjacent lung tissues, implantation of these biomaterials on diseased lung can potentially normalize the adjacent diseased tissues, enabling researchers to develop new therapeutic approaches for various types of lung diseases.

Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse.

L&#39;impianto di fibrina gel sul mouse polmone per studiare angiogenesi Lung-specifica

Recent significant advances in stem cell research and bioengineering techniques have made great progress in utilizing biomaterials to regenerate and ...

Mouse Pneumonectomy Model of Compensatory Lung Growth

In humans, disrupted repair and remodeling of injured lung contributes to a host of acute and chronic lung disorders which may ultimately lead to disability or death. Injury-based animal models of lung repair and regeneration are limited by injury-specific responses making it difficult to differentiate changes related to the injury response and injury resolution from changes related to lung repair and lung regeneration. However, use of animal models to identify these repair and regeneration signaling pathways is critical to the development of new therapies aimed at improving pulmonary function following lung injury. The mouse pneumonectomy model utilizes compensatory lung growth to isolate those repair and regeneration signals in order to more clearly define mechanisms of alveolar re-septation. Here, we describe our technique for performing mouse pneumonectomy and sham pneumonectomy. This technique may be utilized in conjunction with lineage tracing or other transgenic mouse models to define molecular and cellular mechanism of lung repair and regeneration.

Mouse pneumonectomy is a commonly employed model of compensatory lung growth. This procedure can be used in conjunction with lineage tracing or transgenic mouse models to elucidate underlying mechanisms.

Topo Pneumonectomia Modello di crescita compensatoria Lung

In humans, disrupted repair and remodeling of injured lung contributes to a host of acute and chronic lung disorders which may ultimately lead to ...

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed lung transplantation in humans to become more readily available by enabling the ability to assess organs and expand the donor pool. As this technology expands and improves, the ability to potentially evaluate and improve the quality of substandard lungs prior to transplant is a critical need. In order to more rigorously evaluate these approaches, a reproducible animal model needs to be established that would allow for testing of improved techniques and management of the donated lungs as well as to the lung-transplant recipient. In addition, an EVLP animal model of associated pathologies, e.g., ventilation induced lung injury (VILI), would provide a novel method to evaluate treatments for these pathologies. Here, we describe the development of a rat EVLP lung program and refinements to this method that allow for a reproducible model for future expansion. We also describe the application of this EVLP system to model VILI in rat lungs. The goal is to provide the research community with key information and &#8220;pearls of wisdom&#8221;/techniques that arose from trial and error and are critical to establishing an EVLP system that is robust and reproducible.

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed lung transplantation in humans to become more readily available by enabling the ability to assess organs and expand the donor pool. Here, we describe the development of a rat EVLP program and refinements that allow for a reproducible model for future expansion.

Metodo di isolato<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Lung Perfusion in un modello di ratto: Lezioni apprese da Sviluppo di un programma EVLP Rat

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

Valutazione del polmone metastasi in mouse mammarie tumorali modelle da Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Echocardiographic Measurement of Right Ventricular Diastolic Parameters in Mouse

Diastolic dysfunction is a prominent feature of right ventricular (RV) remodeling associated with conditions of pressure overload. However, the RV diastolic function is rarely quantified in experimental studies. This might be due to technical difficulties in the visualization of the RV in the apical four-chamber view in rodents. Here we describe two positions facilitating the visualization of the apical four-chamber view in mice to assess the RV diastolic function.
The apical four-chamber view is enabled by tilting the mouse fixation platform to the left and caudally (LeCa) or to the right and cranially (RiCr). Both positions provide images of comparable quality. The results of the RV diastolic function obtained from two positions are not significantly different. Both positions are comparably easy to perform. This protocol can be incorporated into published protocols and enables detailed investigations of the RV function.

Here we describe and compare two positions for obtaining the apical four-chamber view in mice. These positions enable the quantification of the right ventricular function, provide comparable results, and can be used interchangeably.