Special thanks to Dr. Peter Bradley for the antibody to detect the T. gondii mitochondria. The work was supported by National Institute of Health Grants AI072028 and AI107431 to D.G.M and a generous donation to New York Medical College for the study of tropical medicine.

The authors have no competing financial interests.

Il protocollo descritto fornisce un approccio non-polarizzato che utilizza attivazione dei macrofagi murini derivate dal midollo osseo e la genetica avanti per isolare T. mutanti gondii con un difetto nella loro capacità di sopravvivere attivazione dei macrofagi infetti. Il fenotipo dei mutanti dopo l&#39;attivazione dei macrofagi cade in genere in una delle due grandi categorie: 1) I parassiti appaiono intatte ma non riescono a replicare oltre 1 parassita per PV; 2) I parassiti apparire di qualità inferiore e possono essere in ampie PV, amorfi. Il fatto che i mutanti hanno un fenotipo come parassiti wild type in macrofagi naive in assenza di attivazione dimostra il protocollo può specificamente essere utilizzato per identificare mutanti che sono specificamente compromettere la capacità di resistere attivazione dei macrofagi. L&#39;uso di macrofagi derivati ​​dal midollo osseo primario è raccomandato contro la linea cellulare 264.7 macrofago RAW per lo schermo perché la morfologia dei parassiti e il numero parassita per vacuole sono più facilmente visualizzati in macrofagi derivate dal midollo osseo. La schermata descritta in combinazione con la genetica avanti fornisce uno strumento versatile per analizzare i geni del parassita e le vie in ultima analisi genetiche importanti per la resistenza ai mediatori specifici di cellule dell&#39;immunità autonoma. Tali studi di genetica previsionali sono importanti per identificare i geni di parassiti che possono essere seguiti come una stringa per iniziare svelare percorsi parassiti importanti per resistere specifici mediatori antimicrobici sia in vitro e durante patogenesi. Una difficoltà precedenti con approcci genetici in avanti è stato l&#39;identificazione del gene chiave interrotto in ogni mutante. Cosmide biblioteca complementazione in T. gondii è stato molto efficace per complementazione funzionale di mutanti divisione cellulare. Tuttavia, il fatto che la replica di tipo selvatico parassiti sono anche soppressa da IFN-γ e LPS solo in misura minore rispetto ai mutanti, rende più difficile complementazione funzionale than per mutanti divisione cellulare. Intero genoma mutazionale profiling sia mutanti chimici e inserzionali in T. gondii è recentemente emerso come un produttivo, e anche redditizio, viale per identificare i geni responsabili di fenotipi di mutanti in genetica avanti schermi 34,36,37,44. Di conseguenza, tutto il profiling mutazionale genoma utilizzando sequenziamento di nuova generazione ha migliorato le possibilità di utilizzo di mutagenesi chimica di T. gondii in studi genetici avanti per identificare geni importanti per funzioni specifiche. Tale approccio di genetica diretta come descritto nel protocollo corrente sono importanti come la maggior parte del genoma di T. gondii rimane ipotetica con una maggioranza di geni predetti aventi omologia ad altri geni o domini funzionali che potrebbero aiutare nella identificazione di geni candidate parassite importanti per evasione immune. Analisi IFA di 96 pozzetti non è generalmente considerato uno screening ad alto rendimento incontratohod. Nella nostra esperienza è ragionevole per una persona a macchia e schermo 10 piastre da 96 pozzetti in un giorno o circa 960 mutanti. Nel articolo di Skariah et al., Circa 8.000 mutanti sono stati analizzati e 14 mutanti indipendenti sono stati isolati che sono stati significativamente compromessa per la sopravvivenza / replica in attivo ma non macrofagi ingenue 28. La sopravvivenza alterata dei mutanti era prevalentemente il risultato di una maggiore suscettibilità alle ossido nitrico. La limitazione nel metodo generale è principalmente a livello di ottenere singoli cloni del parassita piuttosto che lo screening mediante microscopia come schermata iniziale in piastre da 96 pozzetti è qualitativa e ragionevolmente rapida. La conferma del fenotipo dei mutanti identificati nella schermata del piatto ben 96 è seguito al punto 3 per l&#39;analisi quantitativa e qualitativa con macrofagi nelle diapositive da camera e con l&#39;aggiunta di un numero uguale di tipo selvatico o parassiti mutanti. L&#39;uso di altri metodi di screening analiticiquali fluorometria a livello della popolazione totale di parassiti, piuttosto che il livello parassita individuo come valutato mediante microscopia, sono problematici nel protocollo corrente come molti dei parassiti degradati macchia con l&#39;anticorpo policlonale contro T. gondii come robusto come parassiti wild type con la differenza nel mutante essendo più qualitativa che quantitativa a livello di intensità fluoresence. Inoltre, la dose di IFN-γ e LPS necessarie per isolare mutanti con un difetto nella resistenza alla attivazione di macrofagi infettati risultati nella replicazione soppressa di tipo selvatico parassiti seppure in momenti successivi. Pertanto, la misurazione del numero totale parassita per la schermata genetica avanti compreso l&#39;uso di parassiti luminescenti è problematica. Tuttavia, è possibile che il protocollo di colorazione può essere eliminato nella fase di screening se i cloni parassita parentale impiegata per mutagenesi chimica o inserzionale espressi fluorescente o Lucifero costitutiva o inducibilemarcatore ase. Il protocollo descritto con IFA e microscopia proiezione di macrofagi in 96 pozzetti consente per l&#39;isolamento dei mutanti difettose per la sopravvivenza / replica nei macrofagi attivati ​​ma anche manca chiaramente alcuni potenziali mutanti a causa della risoluzione microscopica limitata ottenibile utilizzando il formato a 96 pozzetti come a questa risoluzione vacuoli gonfie amorfi che macchiano per l&#39;antigene parassita possono essere scambiati per i parassiti replica sani all&#39;interno di un PV normale. Sostituzione di lastre di vetro 96 e coperchio, invece di piastre a 96 pozzetti con una superficie ottica, è in grado di raggiungere una maggiore risoluzione durante la schermata di macrofagi infettati in piastre da 96 pozzetti. La stragrande maggioranza dei mutanti identificati con IFN-γ e LPS nel protocollo descritto per attivare i macrofagi seguenti invasione parassita ha un difetto nella loro capacità di proteggere se stessi da ossido di azoto 28. A questo proposito, lo schermo anche se destinato ad essere non polarizzato,può arricchire per l&#39;isolamento di mutanti parassita con maggiore suscettibilità alle specifiche mediatori antimicrobici seconda delle condizioni di attivazione, il tipo e specie di macrofagi e la tempistica di parassita invasione relativa all&#39;attivazione dei macrofagi che sono scelti per lo schermo. Così la cellula immunitaria innata scelto per lo schermo e gli stimoli di attivazione applicati sono parametri critici che influenzano il tipo di mediatori antimicrobici a cui i mutanti parassita risultanti potrebbero essere sensibili. Il genotipo del parassita è anche un parametro critico come tipo I genotipi del parassita sono relativamente resistenti alla legate all&#39;immunità GTPases (IRG) indotti in risposta a IFN-γ, mentre le II e III genotipi tipo sono più suscettibili 26,45,46. Nel protocollo descritto, i macrofagi vengono attivati ​​dopo l&#39;invasione del parassita. Sebbene il genotipo di tipo II, ceppo Prugnaud, utilizzata nella schermata descritto è suscettibile all&#39;azione di GTPasi legate all&#39;immunità, unllowing il parassita di invadere macrofagi consente prima replica di tipo parassiti selvatici prima della piena induzione degli IRG. Inoltre, non è chiaro che IRGs sono efficaci contro il parassita se sono indotti in macrofagi successive parassita invasione e inizio della replicazione. Il protocollo descritto utilizza macrofagi per identificare geni parassiti importanti per la resistenza a IFN-γ-dipendente mediatori di immunità cellulare autonoma, specialmente ossido nitrico. L&#39;isolamento di un pool di mutanti parassita che condividono una marcata suscettibilità a ossido di azoto e un fenotipo comune di ossido nitrico dipendente frammentazione mitocondriale fornisce un unico insieme di strumenti per identificare geni parassiti e percorsi importanti per la resistenza all&#39;ossido di azoto e di comprensione l&#39;azione dell&#39;ossido nitrico più ampia contro T. gondii e altro protocollo descritto pathogens.The eucariotica con piccole modifiche possono essere utilizzati per la genetica avanti studies per identificare geni importanti per la resistenza parassita a diversi mediatori della cella immunità autonoma. I potenziali modifiche includono alterando il tipo di cellula ospite infettato, gli stimoli di attivazione, o al momento dell&#39;attivazione rispetto a Parasite invasione. Ad esempio, pre-attivazione di macrofagi murini con IFN-γ prima dell&#39;aggiunta parassiti comporterebbe attivazione di GTPasi legate all&#39;immunità. Tale modello potrebbe essere utilizzato per identificare i geni del parassita in Tipo I genotipi di T. gondii che può contribuire alla resistenza mediata da ROP18 e ROP5 di immunità GTPases correlati 24,25. Mediatori di cellule dell&#39;immunità autonoma contro T. gondii in cellule immunitarie innate umani non sono così ben definiti come nei roditori. Pertanto, l&#39;uso di monociti umani di sangue periferico per schermare mutanti chimici di T. gondii può individuare sia i geni importanti per la sopravvivenza del parassita durante l&#39;infezione umana in cellule immunitarie innate e meccanismi importanti nell&#39;uomo for resistenza antimicrobica a T. gondii. Parasite geni importanti per la resistenza alla possono essere identificati isolando mutanti incapaci di sopravvivere esposizione delle cellule ospiti infette ad agenti farmacologici come ossigeno o azoto specie reattive specifici mediatori antimicrobici. Allo stesso modo il protocollo può essere modificato per isolare i mutanti del parassita con aumento della suscettibilità alle inflammasome attivazione 47-49 o la stimolazione ATP dei macrofagi recettori purinergici 50. Nel loro insieme, i protocolli descrivono un approccio utilizzando forward genetica e cellule immunitarie innate di isolare i mutanti parassita importanti per T. resistenza gondii a IFN-γ-dipendente delle cellule dell&#39;immunità autonoma. È importante sottolineare che l&#39;approccio stese è versatile e può essere facilmente modificato per isolare i geni parassita importante per eludere specifici mediatori antimicrobici, la sopravvivenza del parassita in tipi specifici di cellule ospiti o resistenza alle condizioni di stress encounterosso durante la toxoplasmosi. Inoltre, i geni parassiti importanti per resistere attivazione della cellula ospite in molti casi possono anche svolgere un ruolo, direttamente o indirettamente, nella produzione di cisti in vivo durante l&#39;infezione.

Toxoplasma gondii (T. gondii) è un intracellulare obbligato, patogeno da protozoi. E &#39;l&#39;agente eziologico della toxoplasmosi, un pericolo per la salute in soggetti immunocompromessi. E &#39;anche il sistema di modello per altri patogeni Apicomplexa che infettano gli esseri umani, tra cui Cryptosporidium e Cyclospora. La toxoplasmosi è più comunemente acquisito attraverso l&#39;ingestione di cibo o acqua contaminati con la fase bradyzoite o oocisti del parassita. Dopo l&#39;ingestione, queste fasi convertono alla fase tachizoite del parassita che replica all&#39;interno di cellule ospiti e diffonde per via sistemica. Cellule T, IFN-γ e, in misura minore, ossido nitrico 1-4, sono importanti per il controllo di infezione, ma non sono in grado di eliminare la malattia, in proporzione tachizoiti convertono alla fase bradyzoite che sono protetti all&#39;interno cisti tissutali causando una infezione cronica di lunga durata. In realtà, non esistono terapie efficaci contro la cisti s cronicatage della malattia. Grave toxoplasmosi è più spesso dovuta alla riattivazione di infezione persistente, con la fase bradyzoite del parassita riconversione palco rapidamente replicando caratteristico tachizoite di infezione primaria e acuta. Sopravvivenza All&#39;inizio faccia della risposta immunitaria innata è importante per permettere al parassita di raggiungere numeri parassiti sufficiente, nonché di raggiungere siti distali, per consentire costituzione di infezione cronica. T. gondii è evoluto strategie per contrastare i meccanismi di difesa dell&#39;ospite che probabilmente contribuiscono alla sua capacità di replicare e diffondere all&#39;inizio dell&#39;infezione. Primo, T. gondii forma un PV unico durante parassita invasione che è in gran parte separata dai processi endocitiche e esocitosi della cellula ospite rispetto ad altri patogeni intracellulari 5-9. Inoltre, come tutti di successo patogeni intracellulari T. gondii modifica la sua cellula ospite per creare un ambiente permissivo fo la crescita. Questo include l&#39;espressione genica della cellula ospite riprogrammazione alterando fattori di trascrizione della cellula ospite, comprese quelle importanti per la regolazione attivazione delle cellule 10-15. ROP16 16-19, GRA15 20, 21 e GRA16 GRA24 22 hanno tutti dimostrato di essere importante nella regolazione della risposta trascrizionale e segnalazione cellulare cascate di cellule ospiti infettate con T. gondii. Studi recenti, con incroci genetici tra ceppi di parassiti con fenotipi distinti sono stati molto produttivi per identificare i geni che sono alla base di parassiti tratti genotipo-dipendente parassiti, tra cui l&#39;evasione legate all&#39;immunità GTPases (IRG) 16,19,23-26. Nei topi, legate all&#39;immunità GTPasi (IRG) sono fondamentali per il controllo di tipo II e III genotipi del parassita, mentre il tipo molto virulenta I genotipi sono evoluti meccanismi per eludere le IRG murini. Tuttavia, è anche evidente che il parassita è evoluto meccanismi per eludere mezzi antimicrobicatori in aggiunta ai IRGs e che alcuni di questi meccanismi possono essere conservati tutti genotipi parassita 27,28. Inoltre, si sa molto poco circa i mediatori critici di cellule dell&#39;immunità autonoma contro T. gondii durante toxoplasmosi umana. Parasite geni importanti per la resistenza ai mediatori di cellule dell&#39;immunità autonoma possono essere importanti per la sopravvivenza durante tachizoite a bradyzoite conversione che può anche essere attivato da risposta immunitaria. Ad esempio, l&#39;ossido nitrico ad alti livelli può sopprimere la replicazione parassita in macrofagi infettati ma può anche stimolare tachizoite a bradyzoite conversione con conseguente produzione cisti 30-32. ToxoDB è un database genomica funzionale per T. gondii che funziona come una risorsa critica per il campo in termini di fornitura di informazioni di sequenza del genoma del parassita e l&#39;accesso ai dati in scala genomica editi e inediti tra cui le annotazioni di comunità, gene exp<html> ression e proteomica dati 33. Simili molti patogeni protozoarie, la maggior parte del genoma è costituito da geni ipotetici senza informazioni disponibili sulla base gene omologia fornire una conoscenza loro potenziali funzioni. Così, la genetica in avanti è un potente strumento per identificare i geni parassiti nuovi importanti per evasione immune, la conversione cisti e altre funzioni critiche per parassita patogenesi e per la conversione tra le varie fasi di sviluppo differenti. Un ulteriore punto di forza genetica diretta è che può essere usato come un approccio relativamente non polarizzato per interrogare il parassita per i geni che sono importanti per compiti specifici in patogenesi, comprese evasione immune e formazione di cisti. Recenti miglioramenti a sequenziamento di nuova generazione per la profilazione mutazionale hanno fatto un metodo di scelta per identificare i geni parassita responsabile di genetica a termine studi utilizzando sia chimico inserzionale mutagenesi 34-37. S copi &quot;&gt; E &#39;importante identificare le vulnerabilità in T. gondii che possono essere sfruttate per migliorare l&#39;efficacia delle cellule meccanismi immunitari autonomi contro il parassita particolare quelli che potrebbero essere anche attivo contro il palco cisti resistente. A tal fine, in vitro murino infezione macrofagi e modello di attivazione è stato sviluppato per identificare le mutazioni nel parassita che specificamente compromettere T. gondii idoneità dopo l&#39;attivazione dei macrofagi infetti, ma non in macrofagi ingenui. Questa schermata macrofagi è stata utilizzata per interrogare una libreria di T. gondii mutanti inserzionali per fine identificare i geni T. gondii importanti per la resistenza a ossido nitrico 27,28. L&#39;isolamento di un pannello di mutanti T. gondii con resistenza ridotta alla attivazione di macrofagi infettati, in particolare una marcata sensibilità per ossido nitrico, dimostrato l&#39;utilità di schermo per identificare geni parassita importanti per la resistenzaai mediatori di cellule dell&#39;immunità autonome diverso i meccanismi di resistenza descritti per i IRG murini 28. Mutagenesi inserzionale presenta vantaggi rispetto mutagenesi chimica in termini di generazione di un numero limitato di mutazioni casuali in ogni clone parassita e, in teoria, più facile identificazione del sito di mutazione. Tuttavia, identificando il sito di inserzione del plasmide genomico in T. mutanti inserzionali gondii, in pratica, è stato sorprendentemente difficile in molti casi 37. Inserimento di un plasmide in un gene è anche probabile che interrompere la funzione di un gene in contrasto mutagenesi chimica che provoca tipicamente cambiamenti singolo nucleotide. Tuttavia, mutagenesi chimica sia con N-etil-N-nitrosourea (ITA) o sulfonato ethylmethane (EMS) può offrire una maggiore capacità di analizzare una porzione più ampia del genoma del parassita, rispetto alla mutagenesi inserzionale, in quanto crea più polimorfismi a singolo nucleotide ( stimato a 10 -100) per mutante 34, 38. Inoltre, i recenti progressi in tutto il profiling genoma ha reso possibile l&#39;utilizzo di sequenziamento di nuova generazione per identificare i geni candidati più probabili responsabili del fenotipo identificato di un parassita mutato 34,38. Indipendentemente dal metodo mutagenesi, conferma del ruolo del gene parassita resistenza alla attivazione dei macrofagi richiede infine delezione genica e complementazione di soddisfare postulati di Koch molecolare. La capacità di analizzare la funzione di un gene mediante manipolazione genetica sia del parassita e macrofagi è importante in quanto molti dei geni identificati tramite genetica diretta in T. gondii, così come altri agenti patogeni, sono ancora caratterizzati come geni ipotetici con poca o nessuna omologia di sequenza con altre proteine ​​con funzioni note. La carta corrente delinea un approccio generale che può essere utilizzato per identificare se il gene interrotto in un mutante è importante per la resistenza ad una nota osconosciuto mediatore della cellula immunità autonoma. L&#39;analisi iniziale di accoglienza fattori antimicrobici è effettuata valutando la sopravvivenza di tipo selvatico e parassiti mutanti in macrofagi da topi wild type rispetto a quelli con specifiche delezioni geniche in ossido nitrico sintasi inducibile (iNOS), gp-91 phox (NADPH ossidasi), e specifiche GTPasi legate all&#39;immunità (IRG). Questo determinerà se i geni identificati parassita sono importanti per la resistenza a ossido nitrico, intermedi reattivi dell&#39;ossigeno o legate all&#39;immunità GTPases 28 rispettivamente o se un meccanismo immunitario sconosciuto è coinvolto. L&#39;attivazione dei macrofagi infetti sia con IFN-γ e LPS, descritti nel protocollo attuale, si traduce principalmente nel isolamento di geni importanti per la resistenza dei parassiti a ossido nitrico 28. L&#39;uso di agenti farmacologici che inducono ossido nitrico in assenza di attivazione dei macrofagi (donatori di ossido nitrico) ha confermato che la maggior parte dei geni identificati fosse importante per riresistenza a ossido nitrico, piuttosto che l&#39;ossido di azoto in concerto con i mediatori aggiuntivi associati macrofagi attivazione 28. Fase uno e due descrivono uno schermo genetica avanti volto a isolare i mutanti del parassita con un difetto di forma fisica dopo l&#39;attivazione dei macrofagi del midollo osseo infette in vitro. Passo si descrive un&#39;analisi titolazione della dose per determinare empiricamente una dose di IFN-γ e LPS da utilizzare per l&#39;attivazione dei macrofagi, che riduce la replicazione del parassita, ma non inibisce completamente la replica di tipo T. selvaggia ceppo parentale gondii che viene utilizzato per la creazione della biblioteca di mutanti del parassita. Fase due descrive la schermata genetica avanti dei cloni mutanti nei macrofagi in piastre da 96 pozzetti. Fase tre delinea un approccio per confermare il fenotipo di ogni mutante identificato nella schermata dei 96 pozzetti e di valutare se il difetto in ogni mutante influenza la sopravvivenza del parassita, la replica,o di produzione cisti in risposta all&#39;attivazione dei macrofagi. Fase quattro descrive l&#39;uso di macrofagi del midollo osseo da topi con delezioni in specifiche vie antimicrobiche per identificare i mediatori immunitari a cui il mutante parassita è specificamente sensibili. Fase cinque delinea un approccio per determinare se un mutante parassita è anche compromesso da in vivo patogenesi come valutato dalla produzione cisti nel cervello dei topi infettati.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="352">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:88px;">Name of the material</td>
			<td style="width:88px;">Company</td>
			<td style="width:88px;">Catalog number</td>
			<td style="width:88px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH3008101</td>
			<td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&#38;langId=-1&#38;catalog 
			Id=29101&#38;productId=3255471&#38;dis 
			type=0&#38;highlightProductsItemsFlag 
			=Y&#38;fromSearch=1&#38;searchType= 
			PROD&#38;hasPromo=0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hyclone FBS</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SH3091003</td>
			<td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&#38;langId=-1&#38;catalog 
			Id=29104&#38;productId=11737973&#38;dis 
			type=0&#38;highlightProductsItemsFlag 
			=Y&#38;fromSearch=1&#38;searchType= 
			PROD&#38;hasPromo=0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hyclone DPBS</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SH3002802&#160;</td>
			<td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&#38;langId=-1&#38;catalog 
			Id=29104&#38;productId=2434305&#38;dis 
			type=0&#38;highlightProductsItemsFlag 
			=Y&#38;fromSearch=1&#38;searchType 
			=PROD&#38;hasPromo=0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hyclone L-glutamine</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SH3003401&#160;</td>
			<td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&#38;langId=-1&#38;catalog 
			Id=29104&#38;productId=3311957&#38;dis 
			type=0&#38;highlightProductsItemsFlag 
			=Y&#38;fromSearch=1&#38;searchType 
			=PROD&#38;hasPromo=0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hyclone Pen strep</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SV30010&#160;</td>
			<td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?storeId=10652&#38;productId=1309668 
			6&#38;catalogId=29104&#38;matchedCat 
			No=SV30010&#38;fromSearch=1&#38; 
			searchKey=SV30010&#38;highlightPro 
			ductsItemsFlag=Y&#38;endecaSearch 
			Query=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3DSV30010%2B%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D&#38;xrefPartType=From&#38;savings= 0.0&#38;xrefEvent=1407777949003_0 
			&#38;searchType=PROD&#38;hasPromo=0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hyclone Hanks BSS</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SH3003002</td>
			<td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&#38;langId=-1&#38;catalog 
			Id=29104&#38;productId=3064595&#38;dis 
			type=0&#38;highlightProductsItemsFlag 
			=Y&#38;fromSearch=1&#38;searchType= 
			PROD&#38;hasPromo=0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LPS</td>
			<td>LIST biologicals</td>
			<td align="right">201</td>
			<td>http://www.listlabs.com/products-tech.php?cat_id=4&#38;product_id=81&#38;keywords 
			=LPS_from_%3Cem%3EEscherichia_coli%3C/em%3E_O111:B4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IFN-g</td>
			<td>Pepro Tech Inc</td>
			<td>50-813-664</td>
			<td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?itemdetail=&#39;item&#39;&#38;storeId=10652&#38; 
			productId=2988494&#38;catalogId=29 
			104&#38;matchedCatNo=50813664&#38; 
			fromSearch=1&#38;searchKey=murine+ifn+pepro+tech&#38;highlightProductsItemsFlag 
			=Y&#38;endecaSearchQuery=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3Dmurine%2Bifn%2Bpepro%2Btech%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D&#38;xrefPartType=From&#38;savings 
			=0.0&#38;xrefEvent=1407778210608_ 
			12&#38;searchType=PROD&#38;hasPromo 
			=0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chamber slides</td>
			<td>Thermo</td>
			<td align="right">177402</td>
			<td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&#38;langId=-1&#38;catalog 
			Id=29104&#38;productId=2164545&#38;dis 
			type=0&#38;highlightProductsItemsFlag 
			=Y&#38;fromSearch=1&#38;searchType= 
			PROD&#38;hasPromo=0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well optical plates</td>
			<td>Thermo</td>
			<td align="right">165306</td>
			<td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&#38;langId=-1&#38;catalog 
			Id=29104&#38;productId=3010670&#38;dis 
			type=0&#38;highlightProductsItemsFlag 
			=Y&#38;fromSearch=1&#38;searchType= 
			PROD&#38;hasPromo=0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">96-well tissue culture plates</td>
			<td></td>
			<td align="right">353072</td>
			<td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&#38;langId=-1&#38;catalog 
			Id=29104&#38;productId=3158736&#38;dis 
			type=0&#38;highlightProductsItemsFlag 
			=Y&#38;fromSearch=1&#38;searchType= 
			PROD&#38;hasPromo=0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Tissue culture flast T25</td>
			<td></td>
			<td align="right">156367</td>
			<td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?storeId=10652&#38;productId=127039 
			67&#38;catalogId=29104&#38;matchedCat 
			No=12565351&#38;fromSearch=1&#38; 
			searchKey=156367&#38;highlightProdu 
			ctsItemsFlag=Y&#38;endecaSearchQu 
			ery=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3D156367%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D&#38;xrefPartType=From&#38;savings 
			=0.0&#38;xrefEvent=1407778974800_ 
			0&#38;searchType=PROD&#38;hasPromo 
			=0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Ted Pella EM grade formaldehyde</td>
			<td></td>
			<td align="right">18505</td>
			<td>http://www.tedpella.com/chemical_html/chem3.htm#anchor267712</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151</td>
			<td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&#38;langId=-1&#38;catalog 
			Id=29104&#38;productId=3425922&#38;dis 
			type=0&#38;highlightProductsItemsFlag 
			=Y&#38;fromSearch=1&#38;searchType= 
			PROD&#38;hasPromo=1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa 488 - protein conjugation kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A20181</td>
			<td>http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A10235</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">goat serum</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN19135680</td>
			<td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&#38;langId=-1&#38;catalog 
			Id=29104&#38;productId=2133236&#38;dis 
			type=0&#38;highlightProductsItemsFlag 
			=Y&#38;fromSearch=1&#38;crossRefData 
			=ICN19135680=2&#38;searchType 
			=PROD&#38;hasPromo=0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield mounting media</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H1200</td>
			<td>https://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=428</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC-conjugated dolichos</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>FL-1031</td>
			<td>https://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=188</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibody to LAMP1</td>
			<td colspan="2">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>http://dshb.biology.uiowa.edu/LAMP-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LysoTracker</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L-7526</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/L7526?ICID=search-product</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C57BL6 mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td align="right">664</td>
			<td>http://jaxmice.jax.org/strain/000664.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gp91 phox knock out mice</td>
			<td>Jackson Labaoratories</td>
			<td align="right">2365</td>
			<td>http://jaxmice.jax.org/strain/002365.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iNOS knock out mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td align="right">2609</td>
			<td>http://jaxmice.jax.org/strain/002609.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium nitroprusside</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>AC21164-0250&#160;</td>
			<td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&#38;langId=-1&#38;catalog 
			Id=29104&#38;productId=2627727&#38;dis 
			type=0&#38;highlightProductsItemsFlag 
			=Y&#38;fromSearch=1&#38;searchType= 
			PROD&#38;hasPromo=1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DETA NONOate</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>AC32865-0250</td>
			<td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&#38;langId=-1&#38;catalog 
			Id=29104&#38;productId=2252389&#38;dis 
			type=0&#38;highlightProductsItemsFlag 
			=Y&#38;fromSearch=1&#38;searchType= 
			PROD&#38;hasPromo=1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Monoclonal mouse anti-Toxoplasma gondii Ab</td>
			<td></td>
			<td>10T19A</td>
			<td>http://1degreebio.org/reagents/product/1069274/?qid=652947</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

forward genetics screens using macrophages to identify toxoplasma gondii genes important for resistance to ifn-&#947;-dependent cell autonomous immunity

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within virtually any warm blooded vertebrate cell type. During parasite invasion of a host cell, the parasite creates a parasitophorous vacuole (PV) that originates from the host cell membrane independent of phagocytosis within which the parasite replicates. While IFN-dependent-innate and cell mediated immunity is important for eventual control of infection, innate immune cells, including neutrophils, monocytes and dendritic cells, can also serve as vehicles for systemic dissemination of the parasite early in infection. An approach is described that utilizes the host innate immune response, in this case macrophages, in a forward genetic screen to identify parasite mutants with a fitness defect in infected macrophages following activation but normal invasion and replication in na&#239;ve macrophages. Thus, the screen isolates parasite mutants that have a specific defect in their ability to resist the effects of macrophage activation. The paper describes two broad phenotypes of mutant parasites following activation of infected macrophages: parasite stasis versus parasite degradation, often in amorphous vacuoles. The parasite mutants are then analyzed to identify the responsible parasite genes specifically important for resistance to induced mediators of cell autonomous immunity. The paper presents a general approach for the forward genetics screen that, in theory, can be modified to target parasite genes important for resistance to specific antimicrobial mediators. It also describes an approach to evaluate the specific macrophage antimicrobial mediators to which the parasite mutant is susceptible. Activation of infected macrophages can also promote parasite differentiation from the tachyzoite to bradyzoite stage that maintains chronic infection. Therefore, methodology is presented to evaluate the importance of the identified parasite gene to establishment of chronic infection.

Toxoplasma gondii replica liberamente nei macrofagi naïve e ha un tempo di raddoppio tra 6-12 ore a seconda del ceppo del parassita. La figura 1 mostra i parassiti di rappresentanza in ingenuo rispetto macrofagi derivate dal midollo osseo attivate. La figura 2 mostra la morfologia generale di parassiti in HFF cellule ospiti a 2, 4, 8, 16 e 32 parassiti / PV. Nel protocollo attuale, il parassita è permesso di invadere macrofagi naïve e stabilire un vacuolo nascente parassitoforo (PV) prima della consegna di uno stimolo di attivazione potente, LPS e IFN, ai macrofagi infetti. In questo modello, la replica di tipo parassiti selvatici è rallentata, ma la replica parassita procede ancora per circa 24 ore durante il quale i macrofagi diventano progressivamente più abili a inibire la replicazione del parassita. Lo schermo è progettato per funzionare come un modello di concorrenza modificato tra il tempo richiesto per un potente macrofagictivation funzione del tempo durante il quale il tipo selvatico o parassita parassita mutante possono continuare a replicare nel suo PV. Il primo passo nella schermata è scegliere una dose di LPS e IFN-γ da utilizzare per l&#39;attivazione dei macrofagi infetti. La dose è empiricamente determinata valutando replica parassita macrofagi attivati ​​con un dosaggio costante di IFN-γ in combinazione con un intervallo di concentrazioni LPS o una dose costante di LPS con una gamma di concentrazioni IFN (Fase 1). La dose di stimoli di attivazione deve essere valutato per i genitori parassiti wild type utilizzati per la creazione dei mutanti parassita di mutagenesi chimica o inserzionale. Idealmente la dose di LPS e IFN-γ permetterà replica parassita ad una media di 2-8 parassiti per PV 24-30 ore dopo l&#39;attivazione rispetto al 8-16 parassiti per PV in macrofagi naïve (Figure 1 e 2). Una volta che la concentrazione adeguata di LPS e IFN-^7; è determinato, i mutanti sono proiettati in fondo ottica piastre di coltura tissutale a 96 pozzetti. Il fondo ottico piastre è importante perché irregolarità nella plastica che viene utilizzata per piastre di coltura dei tessuti tradizionali rende difficile ottenere la risoluzione appropriata per schermare i parassiti di contrasto di fase e microscopia a fluorescenza. Contrasto di fase e microscopia di fluorescenza delle piastre a 96 pozzetti richiede anche un microscopio a fluorescenza invertito con contrasto di fase 4, 10, 20 o 40x obiettivo attrezzato per lunghe distanze di lavoro. Mutanti sono proiettati in lastre ripetute contenenti macrofagi derivate dal midollo osseo di topo. Dopo sfida con mutanti del parassita, macrofagi infetti nei pozzetti di una piastra sono attivati ​​con LPS e IFN-γ, mentre l&#39;altra piastra contenente macrofagi infettati è coltivato in soli mezzi D10. Le piastre vengono incubate a 37 ° C e 5% CO 2 per 24-30 ore dopo l&#39;aggiunta di LPS e IFN-γ. Dopo l&#39;incubazione, le cellule sono fissa, macchiato per i parassiti e analizzati da IFA utilizzando sia fluorescenza e microscopia a contrasto di fase. Mutanti sono selezionati che hanno numeri normali parassiti e la replica in macrofagi naïve, ma un minor numero di parassiti o vacuoli più piccole con un numero inferiore di parassiti in macrofagi infetti che vengono attivate. Una volta mutanti sono selezionati devono essere nuovo controllo in camera di diapositive (fase 3) in macrofagi attivati ​​ingenua e in due esperimenti indipendenti per consentire l&#39;analisi di parassita della morfologia con ingrandimenti maggiori (obiettivo 100X e petrolio) e per confermare che hanno normale replica in macrofagi naïve ma un difetto di replica / sopravvivenza dopo l&#39;attivazione dei macrofagi. I fenotipi dei mutanti con difetti di resistenza alla attivazione dei macrofagi infetti in genere rientrano in due grandi categorie: i parassiti che appaiono morfologicamente intatto, ma non sono in grado di replicare al di là di un singolo parassita per PV; e parassiti che sembrano essere Degraded e può anche essere in amorfi PV spaziose (Figure 1 e 3). La morfologia e ultrastruttura del parassita e PV è visualizzato la meglio su diapositive utilizzando un obiettivo e olio 100X e al microscopio a contrasto di fase in combinazione con l&#39;analisi di fluorescenza. La colorazione dei parassiti per IFA con un anticorpo di membrana lisosomiale associata proteina-1 (LAMP1) è utile per determinare se il difetto nel mutante è associato ad una incapacità del PV per evitare la fusione con i lisosomi. In figura 4 è un parassita entro un fagolisosoma (LAMP1 positivo) contro un parassita che è in un PV che è in gran parte separata dal sistema endocitico della cellula ospite (LAMP1 negativo). Il fagolisosoma è evidente da una solida fascia continua di LAMPADA1 sforzare intorno all&#39;intera parassita. Al contrario, un PV ha spesso organelli lisosomi nella zona ma non fascia continua di LAMP1 colorazione attorno alla sua circonferenza. L&#39;uso di anticorpi definite strutture / organelli all&#39;interno tlui parassita e / o PV sono utili in seguito studi IFA per identificare anomalie in ogni mutante associato con l&#39;attivazione dei macrofagi infetti. Tali interrogatori con anticorpi possono approfondire la conoscenza dei meccanismi che sono alla base del difetto di replica / sopravvivenza in un mutante. Ad esempio, la Figura 5 mostra il T. mitocondrio gondii macchiato con l&#39;anticorpo monoclonale anti-5F4 F1 ATPasi subunità beta (un gentile dono di Peter Bradley) 24 ore dopo l&#39;attivazione dei macrofagi infettati da parassiti wild type o mutanti parassiti. T. gondii è stato co-tinto con un anticorpo monoclonale anti-T. gondii anticorpi. Tipo selvaggio T. gondii ha un unico mitocondrio che si estende attorno alla circonferenza del parassita. Mitocondrio unica del parassita di tipo parassiti selvatici dopo l&#39;attivazione dei macrofagi infettati era intatto rispetto ad un mitocondrio frammentato in parassiti mutanti. I mitocondri frammentazione era evidente non solo in degradate / amorfoparassiti, ma anche in parassiti che hanno mostrato un normale morfologia valutata mediante microscopia a contrasto di fase. Ciò suggerisce che il difetto nel mutante parassita può aumentare la suscettibilità del mitocondrio parassita ospitare mediatori cellulari indotti da attivazione dei macrofagi. L&#39;attuale modello utilizza una combinazione di IFN-γ e LPS per attivare i macrofagi infetti. Γ IFN stimola il fattore di trascrizione STAT1. LPS, come TNF-α, stimola il fattore di trascrizione NF-kB. IFN-γ Conosciuto mediatori antimicrobici -dipendenti importanti nella cella immunità autonoma contro T. gondii comprendono una serie di IFN-γ-dipendente GTPases legate all&#39;immunità (IRG, Gbps) e reattive di ossigeno e azoto specie in aggiunta ad altri agenti. Per determinare se il difetto in ogni mutante è specificamente associata con la produzione di IFN-γ noto mediatori antimicrobici -inducible, macrofagi del midollo osseo sono isolati daliNOS - / -, gp 91 phox - / - o gene cancellato topi IRG / GBP specifici e analizzati per l&#39;attività contro i parassiti mutanti. La combinazione di IFN-γ e LPS di attivare i macrofagi infetti si traduce preferenzialmente in mutanti con una maggiore suscettibilità a ossido nitrico rispetto al tipo selvaggio parassiti 28. L&#39;attivazione dei macrofagi infetti può indurre la differenziazione fase dei parassiti dal tachizoiti a bradyzoites contenuti in cisti tissutali. Tali cisti sono caratteristici di infezione cronica. Così, mutanti parassita che sono difettosi per la replica / sopravvivenza dopo l&#39;attivazione dei macrofagi infetti possono essere difettosi per la conversione di cisti durante l&#39;infezione in vivo. Al fine di valutare la produzione di cisti durante l&#39;infezione cronica, i topi sono chiamati per via intraperitoneale (ip) con una dose non letale del parassita ceppo parentale o il clone mutante. Le cisti nell&#39;intervallo cervello nel formato da meno di 10 _6;. M di diametro maggiore di 50 micron, come mostrato in figura 6 Contare il numero di grandi e piccole cisti di IFA ma mantengono i conteggi separati al fine di determinare se il mutante parassita è compromessa per produzione totale cisti o solo per lo stabilimento e manutenzione di grandi cisti. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52556/52556fig1.jpg" /> Figura 1. ingenui macrofagi derivate dal midollo osseo di topo sono permissive per la replica di T. gondii ma attivazione con IFN-γ e LPS inibisce sostanzialmente replica. (A) A vacuolo parassitoforo (PV) del wild type T. gondii 24 ore dopo l&#39;invasione dei macrofagi del midollo osseo murino naïve. (B) A PV di selvaggio tipo T. gondii Parassiti composto da quattro parassiti per vacuole 24 ore dopo l&#39;attivazione dei macrofagi infetti.(C) Un esempio di un parassita mutante incapace di replicarsi e ancora in un&#39;altra parassita / PV 24 ore dopo l&#39;attivazione dei macrofagi infettati. (D) Un esempio di un parassita mutante che appare degradata amorfo PV 24 ore dopo l&#39;attivazione dei macrofagi infettati . La riga superiore mostra immagini di fase dei parassiti e la riga in basso mostra le immagini fluorescenti con un anti-siero policlonale contro T. gondii. La barra della scala rappresenta il 5 micron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52556/52556fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52556/52556fig2.jpg" /> Figura 2. Parasite replica valutato per il numero di parassiti per fotovoltaico. Le immagini mostrano 2, 4, 8, 16 e 32 per i parassiti PV nelle cellule HFF. Ogni immagine è una immagine fusa fase thin mostra policlonale anticorpi colorazione del parassita in rosso e il nucleo HFF in blu (DAPI). La barra della scala rappresenta il 5 micron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52556/52556fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52556/52556fig3.jpg" /> Figura 3. Mutants presentano una serie di fenotipi dopo l&#39;attivazione di macrofagi infettati. La colonna di sinistra è un&#39;immagine di fase del parassita nei macrofagi, colonna centrale è un&#39;immagine fluorescente utilizzando un anticorpo a T. gondii, e la colonna di destra è una fusione della fase e l&#39;immagine fluorescente. Il parassita è mostrato in verde e il nucleo macrofagi in blu. La barra della scala rappresenta il 5 micron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52556/52556fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una più grande</a>versione di questa figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52556/52556fig4.jpg" /> Figura 4. LAMP1 colorazione distingue PV da phagolysomes-contenenti parassiti. I parassiti sono colorate con un policlonale anti T. gondii anticorpi (rosso) e LAMPADA1 con il mAb 1D4B (verde). Una freccia indica un PV parassita che ha fuso con i lisosomi. Il parassita, senza la freccia è in un vacuolo parassitoforo (PV), che non ha fuso con i lisosomi. La barra della scala rappresenta il 5 micron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52556/52556fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52556/52556fig5.jpg" /> Figura 5. parassiti wild type mantenere un mitocondrio intatto mentre le mitochondrisu è degradata in mutanti parassiti seguenti attivazione dei macrofagi infetti. mitocondrio (verde) di tipi di parassiti selvatici (pannello superiore) rispetto ai tre diversi T. mutante gondii parassiti a diversi stadi di degradazione (in basso tre pannelli) 24 ore dopo l&#39;attivazione dei macrofagi infetti. La barra della scala rappresenta il 5 micron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52556/52556fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52556/52556fig6.jpg" /> Figura 6. Individuazione delle cisti di parassiti nel cervello utilizzando Dolichos FITC-coniugati biflorus lectina. La parete cisti etichettato con la lectina viene visualizzato in verde. La barra della scala rappresenta 50 micron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52556/52556fig6large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere un grande versio</a>n di questa figura.

Watch this Scientific Journal Video about Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-Î³-Dependent Cell Autonomous Immunity at JoVE

Schermate di genetica avanzata che utilizzano i macrofagi per identificare i geni del Toxoplasma gondii importanti per la resistenza all'immunità autonoma delle cellule dipendenti dall'IFN-γ | Immunologia e infezione | Video

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion.

Forward Genetica schermi usando macrofagi per identificare<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; geni importanti per la Resistenza di IFN-γ-Dependent cellulare Immunità autonoma

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

forward-genetics-screens-using-macrophages-to-identify-toxoplasma

Nanyang Technological University

Education

Research

JoVE Core

JoVE Journal

Molecular Biology

Biology

Immunology and Infection

Evolution

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Unit 2

Population Genetics

Analyzing Gene Expression and Function

SCIENTISTS IN ACTION

11.0K Views.  New York Medical College. Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion. 

Video: Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-γ-Dependent Cell Autonomous Immunity

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with causing food- and water-borne disease outbreaks. The definitive host is the feline species where sexual replication occurs resulting in the development of the highly infectious and environmentally resistant oocyst. Infection occurs via ingestion of tissue cysts from contaminated meat or oocysts from soil or water. Infection is typically asymptomatic in healthy individuals, but results in a life-long latent infection that can reactivate causing toxoplasmic encephalitis and death if the individual becomes immunocompromised. Meat contaminated with T. gondii cysts have been the primary source of infection in Europe and the United States, but recent changes in animal management and husbandry practices and improved food handling and processing procedures have significantly reduced the prevalence of T. gondii cysts in meat1, 2. Nonetheless, seroprevalence in humans remains relatively high suggesting that exposure from oocyst contaminated soil or water is likely. Indeed, waterborne outbreaks of toxoplasmosis have been reported worldwide supporting the theory exposure to the environmental oocyst form poses a significant health risk3-5. To date, research on understanding the prevalence of T. gondii oocysts in the water and environment are limited due to the lack of tools to detect oocysts in the environment 5, 6. This is primarily due to the lack of efficient purification protocols for obtaining large numbers of highly purified T gondii oocysts from infected cats for research purposes. This study describes the development of a modified CsCl method that easily purifies T. gondii oocysts from feces of infected cats that are suitable for molecular biological and tissue culture manipulation7.

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

This study describes the development of a modified CsCl method that easily purifies T. gondii oocysts from feces of infected cats that are suitable for molecular biological and tissue culture manipulation

Ottenere altamente purificato Toxoplasma gondii Oocisti da un gradiente discontinuo di cloruro di cesio

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii disseminates as a fast replicating form called the tachyzoite. Tachyzoites convert into a slow-growing encysted form called the bradyzoite by a signaling process that is not well characterized. Within animals, bradyzoite cysts are found in the central nervous system and muscle tissue and represent the chronic stage of infection. Conversion to bradyzoites can be simulated in tissue culture by CO2 starvation, using medium with high a pH, or the addition of interferon gamma (IFN&gamma;). Bradyzoites are characterized by the presence of a cyst wall, to which the lectin Dolichos biflorus agglutinin (DBA) binds. Fluorescently labeled DBA is used to visualize the cyst wall in parasites grown in human foreskin fibroblasts (HFFs) that have been exposed to low CO2 and high pH medium. Similarly, parasites residing in murine bone marrow-derived macrophages (BMMs) display a cyst wall detectable by DBA after the BMMs are activated with IFN&gamma; and lipopolysaccharide (LPS). This protocol will demonstrate how to induce conversion of T. gondii to bradyzoites using a high pH growth medium with low CO2 and activation of BMMs. Host cells will be cultured on coverslips, infected with tachyzoites and either activated with addition of IFN&gamma; and LPS (BMMs) or exposed to a high pH growth medium (HFFs) for three days. Upon completion of infections, host cells will be fixed, permeabilized, and blocked. Cyst walls will be visualized using rhodamine DBA with fluorescence microscopy.

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii converts to a cyst form in response to environmental stresses, which can be mimicked in tissue culture models. This video demonstrates techniques to examine cyst wall formation by activating bone marrow-derived macrophages or changing growth medium pH in fibroblast cells.

Toxoplasma gondii parete formazione di cisti in attivo dal midollo osseo macrofagi e condizioni Bradyzoite

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged antigen-specific T cell receptor (TCR) have been an indispensable tool to study T cell development and function. However, such TCRs are usually isolated from the relevant T cells after long-term culture often following repeated antigen stimulation, which unavoidably selects for T cells with high affinity. Random genomic integration of the TCR &alpha;- and &beta;-chain and expression from non-endogenous promoters can lead to variations in expression level and kinetics.
Epigenetic reprogramming via somatic cell nuclear transfer provides a tool to generate embryonic stem cells and mice from any cell of interest. Consequently, when SCNT is applied to T cells of known specificity, these genetic V(D)J rearrangements are transferred to the SCNT-embryonic stem cells (ESCs) and the mice derived from them, while epigenetic marks are reset. We have demonstrated that T cells with pre-defined specificities against Toxoplasma gondii can be used to generate mouse models that express the specific TCR from their endogenous loci, without experimentally introduced genetic modification. The relative ease and speed with which such transnuclear models can be obtained holds promise for the construction of other disease models.

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

We demonstrate here that epigenetic reprogramming via Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) can be used as a tool to generate mouse models with pre-defined T cell receptor (TCR) specificities. These transnuclear mice express the corresponding TCR from their endogenous locus under the control of the endogenous promoter.

I topi con Transnuclear predefiniti Specificità cellule T contro il recettore Toxoplasma gondii Ottenuto Via SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the disease, is characterised by an accumulation of Plasmodium falciparum infected red blood cells (iRBC) at pigmented trophozoite stage in the microvasculature of the brain2-4. This microvessel obstruction (sequestration) leads to acidosis, hypoxia and harmful inflammatory cytokines (reviewed in 5). Sequestration is also found in most microvascular tissues of the human body2, 3. The mechanism by which iRBC attach to the blood vessel walls is still poorly understood.
The immortalized Human Brain microvascular Endothelial Cell line (HBEC-5i) has been used as an in vitro model of the blood-brain barrier6. However, Plasmodium falciparum iRBC attach only poorly to HBEC-5i in vitro, unlike the dense sequestration that occurs in cerebral malaria cases. We therefore developed a panning assay to select (enrich) various P. falciparum strains for adhesion to HBEC-5i in order to obtain populations of high-binding parasites, more representative of what occurs in vivo.
A sample of a parasite culture (mixture of iRBC and uninfected RBC) at the pigmented trophozoite stage is washed and incubated on a layer of HBEC-5i grown on a Petri dish. After incubation, the dish is gently washed free from uRBC and unbound iRBC. Fresh uRBC are added to the few iRBC attached to HBEC-5i and incubated overnight. As schizont stage parasites burst, merozoites reinvade RBC and these ring stage parasites are harvested the following day. Parasites are cultured until enough material is obtained (typically 2 to 4 weeks) and a new round of selection can be performed. Depending on the P. falciparum strain, 4 to 7 rounds of selection are needed in order to get a population where most parasites bind to HBEC-5i. The binding phenotype is progressively lost after a few weeks, indicating a switch in variant surface antigen gene expression, thus regular selection on HBEC-5i is required to maintain the phenotype.
In summary, we developed a selection assay rendering P. falciparum parasites a more "cerebral malaria adhesive" phenotype. We were able to select 3 out of 4 P. falciparum strains on HBEC-5i. This assay has also successfully been used to select parasites for binding to human dermal and pulmonary endothelial cells. Importantly, this method can be used to select tissue-specific parasite populations in order to identify candidate parasite ligands for binding to brain endothelium. Moreover, this assay can be used to screen for putative anti-sequestration drugs7.

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

An in vitro model for cerebral malaria sequestration is described1. Plasmodium falciparum infected red blood cells are selected for binding to immortalized human brain microvascular endothelial cells. The selected parasites show a distinct phenotype. The selection process can be applied using various P. falciparum strains and endothelial cell lines.

Selezione di Plasmodium falciparum Parassiti per Cytoadhesion alle cellule cerebrali umane endoteliali

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth defects upon congenital infection. The lytic replication cycle is characterized by three stages: 1. active invasion of a nucleated host cell; 2. replication inside the host cell; 3. active egress from the host cell. The mechanism of egress is increasingly being appreciated as a unique, highly regulated process, which is still poorly understood at the molecular level. The signaling pathways underlying egress have been characterized through the use of pharmacological agents acting on different aspects of the pathways1-5. As such, several independent triggers of egress have been identified which all converge on the release of intracellular Ca2+, a signal that is also critical for host cell invasion6-8. This insight informed a candidate gene approach which led to the identification of plant like calcium dependent protein kinase (CDPK) involved in egress9. In addition, several recent breakthroughs in understanding egress have been made using (chemical) genetic approaches10-12. To combine the wealth of pharmacological information with the increasing genetic accessibility of Toxoplasma we recently established a screen permitting the enrichment for parasite mutants with a defect in host cell egress13. Although chemical mutagenesis using N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) or ethyl methanesulfonate (EMS) has been used for decades in the study of Toxoplasma biology11,14,15, only recently has genetic mapping of mutations underlying the phenotypes become routine16-18. Furthermore, by generating temperature-sensitive mutants, essential processes can be dissected and the underlying genes directly identified. These mutants behave as wild-type under the permissive temperature (35 &deg;C), but fail to proliferate at the restrictive temperature (40 &deg;C) as a result of the mutation in question. Here we illustrate a new phenotypic screening method to isolate mutants with a temperature-sensitive egress phenotype13. The challenge for egress screens is to separate egressed from non-egressed parasites, which is complicated by fast re-invasion and general stickiness of the parasites to host cells. A previously established egress screen was based on a cumbersome series of biotinylation steps to separate intracellular from extracellular parasites11. This method also did not generate conditional mutants resulting in weak phenotypes. The method described here overcomes the strong attachment of egressing parasites by including a glycan competitor, dextran sulfate (DS), that prevents parasites from sticking to the host cell19. Moreover, extracellular parasites are specifically killed off by pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), which leaves intracellular parasites unharmed20. Therefore, with a new phenotypic screen to specifically isolate parasite mutants with defects in induced egress, the power of genetics can now be fully deployed to unravel the molecular mechanisms underlying host cell egress.

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Forward genetics is a powerful method to unravel the molecular level of how Toxoplasma egresses from its host cell. Protocols are provided to chemically mutagenize parasites, enrich for mutants with defects in induced egress, and validate the phenotype of cloned mutants.

Uno screening genetico per isolare Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Here we report a method for using type I and type II &Delta;ku80 strains of Toxoplasma gondii to efficiently generate targeted gene deletions and gene replacements for functional genomic analysis.

La manipolazione genetica in<em&gt; Δku80</em&gt; Ceppi per analisi genomica funzionale di<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its intractability to experimental transformation with recombinant DNA. We developed an approach to perform genetic analysis in C. trachomatis&#160;despite the lack of molecular genetic tools. Our method involves: i.) chemical mutagenesis to rapidly generate comprehensive libraries of genetically-defined mutants with distinct phenotypes; ii.) whole-genome sequencing (WGS) to map the underlying genetic lesions and to find associations between mutated gene(s) and a common phenotype; iii.) generation of recombinant strains through co-infection of mammalian cells with mutant and wild type bacteria. Accordingly, we were able to establish causal relationships between genotypes and phenotypes. The coupling of chemically-induced gene variation and WGS to establish correlative genotype&#8211;phenotype associations should be broadly applicable to the large list of medically and environmentally important microorganisms currently intractable to genetic analysis.

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

We describe a methodology to perform genetic analysis in Chlamydia based on chemical mutagenesis and whole genome sequencing. In addition, a system for DNA exchange within infected cells is described that can be used for genetic mapping. This method may be broadly applicable to microbial systems lacking transformation systems and molecular genetic tools.

Approcci genetici in avanti<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important for developing durable disease-resistant plants against wide range of pathogens. Virus-induced gene silencing (VIGS)-based forward genetics screening is a useful approach for identification of plant defense genes imparting nonhost resistance. Tobacco rattle virus (TRV)-based VIGS vector is the most efficient VIGS vector to date and has been efficiently used to silence endogenous target genes in Nicotiana benthamiana.

	In this manuscript, we demonstrate a forward genetics screening approach for silencing of individual clones from a cDNA library in N. benthamiana and assessing the response of gene silenced plants for compromised nonhost resistance against nonhost pathogens, Pseudomonas syringae pv. tomato T1, P. syringae pv. glycinea, and X. campestris pv. vesicatoria. These bacterial pathogens are engineered to express GFPuv protein and their green fluorescing colonies can be seen by naked eye under UV light in the nonhost pathogen inoculated plants if the silenced target gene is involved in imparting nonhost resistance. This facilitates reliable and faster identification of gene silenced plants susceptible to nonhost pathogens. Further, promising candidate gene information can be known by sequencing the plant gene insert in TRV vector. Here we demonstrate the high throughput capability of VIGS-mediated forward genetics to identify genes involved in nonhost resistance. Approximately, 100 cDNAs can be individually silenced in about two to three weeks and their relevance in nonhost resistance against several nonhost bacterial pathogens can be studied in a week thereafter. In this manuscript, we enumerate the detailed steps involved in this screening. VIGS-mediated forward genetics screening approach can be extended not only to identifying genes involved in nonhost resistance but also to studying genes imparting several biotic and abiotic stress tolerances in various plant species.

Virus-induced gene silencing is an useful tool for identifying genes involved in nonhost resistance of plants. We demonstrate the use of bacterial pathogens expressing GFPuv in identifying gene silenced plants susceptible to nonhost pathogens. This approach is easy, fast and facilitates large scale screening and similar protocol can be applied to studying various other plant-microbe interactions.

VIGS-Mediated Forward Genetica screening per la identificazione di geni coinvolti nella resistenza Nonhost


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

Usando RNA-interferenza per Indagare sulla risposta immunitaria innata in mouse macrofagi

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Forward Genetica schermi usando macrofagi per identificare

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video