We thank N. Borel and her fish house team, M. Rastegar for help with microscopy, and T. Dickmeis for comments on the manuscript. We are grateful for support by the EU IP ZF-Health, FP7-HEALTH-2007-B2, NeuroXsys, the Interreg Network for Synthetic Biology in the Upper Rhine valley (NSB-Upper Rhine) and the BMBF funded network EraSysBio.

Zebrafish sono stati mantenuti nella struttura pesci dell&#39;Istituto di Tossicologia e Genetica (ITG) a Karlsruhe Institute of Technology (KIT). Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le norme di protezione degli animali tedeschi e sono stati approvati dal governo del Baden-Württemberg, Regierungspräsidium Karlsruhe, Germania (Aktenzeichen 35-9185.81/G-272/12 &#39;Adulte Neurogenese&#39;). 1. Generazione di una coltellata nel Telencefalo <ol><li> Anestesia <ol><li> Per preparare una soluzione stock di tricaine (3-ammino benzoico etile, chiamato anche etil 3-amminobenzoato) utilizzano 400 mg di polvere tricaine e dissolverlo in 97,9 ml di acqua e 2,1 ml di 1 M Tris / HCl (pH 9). Regolare il pH a 7. Fai aliquote di 5 ml e conservare a -20 ° C fino al loro utilizzo. </li><li> Trasferire un numero adeguato di 0,5-1 anni zebrafish dai loro carri armati in gabbie di plastica del mouse. Nota: Il cranio di un zebrafish adulto a circa 12mesi di età è ancora relativamente morbido e verranno perforati facilmente con un ago (vedere la sezione 1.2.3 e Figura 1A). </li><li> Per anestetizzare il zebrafish adulto, unire 5 tricaine ml (soluzione) in una gabbia incrocio di plastica con ~ 100 ml di acqua acquario pulita (concentrazione finale del tricaine 0,02% (w / v) tricaine). </li><li> Incubare il pesce in anestetici fino a che non si muovono più (45-60 sec). </li></ol></li><li> Telencefalo Injury <ol><li> Inserire individuo anestetizzato zebrafish in una fessura in un blocco di schiuma tricaine-impregnati. </li><li> Sotto un microscopio da dissezione con luce dall&#39;alto tenere delicatamente il pesce con una mano e orientarlo in modo tale da consentire l&#39;accesso alla testa dall&#39;alto. </li><li> Con l&#39;altra mano spingere una siringa da 30 G (siringa da insulina con ago integrato) verticalmente attraverso il cranio nella regione mediale di un emisfero telencefalico (Figure 1A-1B). Gli emisferi del telencefalo unnuovamente visibile attraverso il cranio. Assicurarsi che la lesione introdotta non è più profondo di 2 millimetri (Figura 1C). Nota: Si raccomanda di introdurre la lesione sempre nello stesso emisfero per facilitare l&#39;identificazione del sito di lesione quando sezionare il cervello dal cranio. </li><li> Dopo aver introdotto l&#39;infortunio telencefalica, mettere il pesce in acqua il pesce fresco. Continuate a 10 pesci in una gabbia 2 L del mouse riempito d&#39;acqua i pesci per il recupero e collegare la gabbia del mouse ad un sistema di flusso d&#39;acqua. Nota: Il tasso di sopravvivenza è di solito ~ 97% se i pesci sono sani e non altri esperimenti sono stati effettuati con il pesce prima. L&#39;aggiunta di antibiotici all&#39;acqua pesce non è necessario. Dopo il recupero, i pesci si comportano normalmente: nuotano, mangimi, e il compagno. </li></ol></li></ol> 2. Analizzando l&#39;effetto di telencefaliche Injury <ol><li> Cervello Dissection e Fixation <ol><li> Re-anestetizzare il pesce recuperato a tempi diversi dopo la lesione (typically, 1, 3, 5, e 14 giorni dopo lesione (dpl)) con 0,02% (w / v) tricaine come sopra e li eutanasia mettendoli in acqua e ghiaccio per 5 min. </li><li> Mettere il pesce su un fazzoletto di carta imbevuta di tampone fosfato salino (PBS) e separare la testa dal corpo tagliando dietro le branchie con una forbice affilata. </li><li> Conservare le teste in 1x PBS per 5 minuti per consentire sanguinamento. Nota: Questo drena il sangue dal tessuto, che può turbare ulteriori passi nel protocollo. </li><li> Fissare le teste notte a 4 ° C in 4% paraformaldeide (PFA) in PBS o 4 ore a temperatura ambiente (RT). </li><li> Lavare teste fisse due volte con PBS 1x in una capsula di Petri. </li><li> Sezionare il cervello con cura in 1x PBS sotto un microscopio da dissezione 23. La lesione è di solito visibile sotto il microscopio da dissezione. Brains senza una lesione visibile devono essere eliminati. </li><li> Trasferire il cervello in 2 provette ml riempiti con 1,5 ml di metanolo 100% (MeOH) e invertire i tubi 5x prima incubazioneli a -20 ° C per almeno 16 ore. Nota: I cervelli possono essere conservati per alcuni mesi in MeOH a -20 ° C fino al momento della immunoistochimica o ibridazione in situ. </li></ol></li><li> Preparazione di tessuto per immunoistochimica <ol><li> Reidratare il cervello attraverso una serie di metanolo discendente in 2 ml di tubi di plastica (sequenza 75% MeOH (1x PBS, 0.1% Tween-20 = PTW). MeOH 50%, 25% MeOH Incubare il cervello (15 cervella / 2 ml tubi di reazione ) per 5 min in ciascuna soluzione. </li><li> Lavare i cervelli in PTW per 5 min. Ripetere 4x con fresco PTW. </li></ol></li><li> Incorporare le Brains per il sezionamento <ol><li> Per incorporare, trasferire i cervelli dal tubo da 2 ml in PTW nelle cavità di un vassoio tazza stampaggio di polietilene con una pipetta di trasferimento (5 mm di diametro). </li><li> Preparare 2% agarosio (grado DNA) in 1x PBS in una beuta. Riscaldare nel forno a microonde a 600 W fino a quando l&#39;agarosio è disciolto completamente. Preparare 50 ml per 10 cervelli. Lasciate the raffreddare rivolto verso il basso per 3 minuti a temperatura ambiente prima dell&#39;uso. Mantenere l&#39;agarosio su una piastra riscaldante pre-riscaldato (60 ° C) mentre incorporamento cervello per evitare la solidificazione. </li><li> Rimuovere la PBS 1x dallo stampo contenente un cervello utilizzando una pipetta Pasteur (diametro 1 mm). Fare attenzione a non danneggiare il cervello. </li><li> Versare agarosio nello stampo e riempirlo del tutto. Quindi utilizzare un ago dissezione a turbinare il cervello in agarosio per lavare via il PTW rendendo più facile incorporare il cervello. </li><li> Orientare il cervello nella parte ventrale dello stampo verso il basso, lato dorsale e posizionarlo dritto. </li><li> Lasciare che il agarosio raffreddare. Per il raffreddamento più veloce, posizionare lo stampo sul ghiaccio. Ripetere i passaggi. </li><li> Ripetere 2.3.3-2.3.6 per tutti i cervelli. </li></ol></li><li> Taglio del agarosio Block <ol><li> Utilizzando un ago dissezione, estrarre il blocco di agarosio. </li><li> Con una lama di rasoio affilata, tagliare l&#39;agarosio alla fine posteriore del cervello. Assicurarsi che questo piano è parallelo al TElencephalon. </li><li> Tagliare il agarosio al termine anteriore del cervello. Poi capovolgere il blocco in modo che si erge sul piano posteriore. </li><li> Rimuovere l&#39;eccesso di agarosio tagliando in parallelo alla dorsale del cervello e lati ventrali. Poi capovolgere il cervello indietro in modo che giaccia sul suo lato ventrale. </li><li> Tagliare il blocco di un triangolo troncato in cui telencefalo si trova in corrispondenza del piano inferiore (Figura 2). </li></ol></li><li> Preparazione del Vibratome per il sezionamento <ol><li> Preparare il vibratome secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare una nuova lama di rasoio e sostituirlo dopo 10 cervelli. </li><li> Riempire la vasca tampone con PBS 1x a un livello che raggiunge solo la parte inferiore della lama. </li><li> Collocare un piccolo punto di colla sulla parte superiore del disco esemplare di vibratome. </li><li> Posizionare accuratamente il piano che si trova posteriormente al cervello sulla colla. La colla si indurisce appena è a contatto con il PBS 1x inla vasca del buffer vibratome. </li><li> Inserire il disco campione con il campione nel cassetto buffer utilizzando il manipolatore del microtomo. </li><li> Utilizzare il manipolatore per ruotare il disco di preparato nella posizione desiderata. Orientare il blocco nel bagno buffer in modo che individua telencefalo appena sotto la superficie, con la parte dorsale del cervello di fronte alla lama. Quindi serrare il SCRW con una chiave a brugola 3 mm e rimuovere il manipolatore. Nota: La vite di serraggio o uno dei dispositivi di fissaggio non devono trovarsi sul buco nel disco di preparato; in queste posizioni di bloccaggio del disco di preparato non è possibile. </li></ol></li><li> Sezionato il cervello <ol><li> Preparare una piastra da 24 pozzetti per raccogliere le sezioni. Per cervello da sezionare, riempire un pozzetto di 1 ml di tampone di bloccaggio (0.1% (v / v) 10% Tween-20, 0,2% (w / v) di siero albumina bovina (BSA), 1% (v / v) dimetilsolfossido (DMSO) in PBS). </li><li> Inizia sezionamento a 50 micron di spessore, velocità di 1 mm / sec e 70 Hzutilizzando un microtomo vibrante. </li><li> Utilizzare un pennello sintetico (1 mm) per raccogliere le fettine di agarosio come vengono fuori la lama e li raccolgono nella piastra da 24 pozzetti. </li></ol></li><li> Immunoistochimica su vibratome Sezioni <ol><li> Bloccare non specifici siti di legame per 1 ora a RT in tampone di bloccaggio (0.1% (v / v) 10% Tween 20, 0,2% (w / v) BSA, 1% (v / v) di DMSO in PBS). </li><li> Rimuovere il surnatante e aggiungere 250 microlitri di anticorpo diluito in tampone di bloccaggio notte a 4 ° C. In alternativa, incubare l&#39;anticorpo primario per 2 ore a temperatura ambiente. Quindi lavare 3x per 10 min a PTW. Nota: Per la colorazione PCNA utilizzare una diluizione 1:400 (topo anti-PCNA Per i dettagli si veda tabella dei materiali.). Anticorpi primari multipli possono essere incubate allo stesso tempo. </li><li> Incubare le sezioni anticorpo secondario per 2 ore a temperatura ambiente poi lavare 3x per 10 min a PTW. Nota: 1:1000 diluizione in PTW, per i dettagli vedere la tabella dei materiali. Anticorpi secondari multipli possono essere incubate allo stesso tempo. </li><li&gt; Opzionale: I migliori risultati si osservano quando le sezioni sono tenuti in PTW notte a 4 ° C per consentire il lavaggio di anticorpi secondari non specificatamente legato. In questo caso, sostituire il PTW ancora una volta prima del montaggio. </li></ol></li><li> Adulto RNA Cervello in situ ibridazione (in alternativa a immunoistochimica) <ol><li> Cervello Dissection e Fixation (stessa procedura per immunoistochimica): <ol><li> Ibridazione di sonda. </li><li> Reidratare il cervello in 2 provette ml come descritto per immunoistochimica. </li><li> Incubare cervelli in proteinasi K (ProtK;. 10 ug / ml conc finale) in PTW per 30 min. Dopo il periodo di incubazione rimuovere ProtK / PTW e fissare di nuovo il cervello per 20 minuti in BT-Fix (4% PFA, 4% di saccarosio, 0,12 mM CaCl 2, 77 mM Na 2 HPO 4, 23 mM NaH 2 PO 4). </li><li> Lavare cervelli 5x per 5 min in PTW (0,1% (v / v) Tween-20 in PBS). </li><li> Rimuovere PTW e sciacquare il cervello in 500 microlitriTampone HYB (50% (v / v) formammide deionizzata, 5x SSC, 500 ug / ml tRNA di lievito, 50 ug / ml di eparina, 0.1% Tween-20, 9 mM citricacid). Attendere fino cervelli depositano sul fondo della provetta poi scartare il surnatante e aggiungere 500 ml di tampone HYB pulito e incubare a 65-70 ° C per 3-4 ore. </li><li> Diluire la sonda di RNA a 1:200 o 1:400 (in base alla sonda) in volume finale di 400 microlitri di tampone HYB. Riscaldare la sonda RNA diluito a 70 ° C per 5 min. </li><li> Rimuovere il surnatante dal cervello e aggiungere la sonda RNA, incubare a 65-70 ° C (O / N). Tutte le soluzioni tampone di lavaggio devono essere preriscaldata e mantenuti a 70 ° C. </li></ol></li><li> Etichettatura <ol><li> Lavare il cervello a 65-70 ° C (durante tutte le 4 fasi di lavaggio) con 500 ml di tampone di lavaggio 1 (50% formammide, 1x SSC, 0,05% Tween 20) due volte per 30 min. Sostituire tampone 1 di tampone 2 (2x SSC, 0,1% Tween 20), e incubare per 15 min. Rimuovere il tampone 2 e lavare il cervello in tampone 3 (0.2x SSC, 0,1% Tween 20) for 30 min, ripetere questa operazione due volte. Sostituire il tampone 3 da buffer di 4 (SSC 0.1x, 0.05% Tween 20 in PTW), incubare per 5 min. </li><li> Rimuovere il surnatante e lavare per 5 minuti in 500 ml di PTW a RT. </li><li> Cervelli incorporare nel 2% agarosio (in 1x PBS) e tagliare vibratome sezioni (50-100 micron), come descritto per immunoistochimica. </li><li> Lavare 1x per 5 min in 500 microlitri di tampone bloccante (1x PBS, 0.1% Tween-20, 0,2% (w / v) BSA, 1% (v / v) di DMSO). </li><li> Rimuovere il surnatante e aggiungere 500 microlitri di tampone bloccante per 2 ore a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere il surnatante e aggiungere 300 microlitri anti-Dig anticorpo AP-coupled diluito 1:4,000 in tampone di bloccaggio. </li><li> Incubare o / n a 4 ° C. </li></ol></li><li> NBT / BCIP colorazione <ol><li> Lavare 5x per 15 min con tampone PTW a RT. </li><li> Sciacquare 1x in tampone colorazione. Lavare due volte 5 min in tampone colorazione (100 mM Tris / HCl pH 9,5, 50 mM MgCl 2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20). </li><li> Rimuovere il surnatante e macchia con 500 μl soluzione colorante (3,5 ml di 4-Nitroblue cloruro tetrazolio (NBT) e 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (BCIP) per 1 ml di tampone colorazione). </li><li> Smettere di colorazione risciacquando 3x a 5x con PTW. </li></ol></li></ol></li><li> Montaggio delle sezioni <ol><li> Montare le sezioni su vetrini utilizzando un mezzo di montaggio non fluorescente solubile in acqua (vedere la tabella dei materiali). </li><li> Conservare i vetrini in frigorifero a 4 ° C. Nota: La colorazione è stabile per diverse settimane o addirittura mesi. </li><li> Analizzare le diapositive sotto un composto o microscopio confocale. </li></ol></li></ol>

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J., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+cell+fate+analysis+in+zebrafish+using+olig2+BAC+transgenics.">Neural cell fate analysis in zebrafish using olig2 BAC transgenics.</a> Methods Cell Sci. 25, 7-14 (2003).</li><li>Armant, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide,+whole+mount+in+situ+analysis+of+transcriptional+regulators+in+zebrafish+embryos.">Genome-wide, whole mount in situ analysis of transcriptional regulators in zebrafish embryos.</a> Dev Biol. 380, 351-362 (2013).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Descriviamo qui un metodo per indurre una lesione telencefalico premendo un ago attraverso il cranio del zebrafish adulti, e per analizzare la reazione cellulare e molecolare di questa lesione mediante immunoistochimica e ibridazione in situ. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri approcci esistenti è la sua semplicità, velocità ed economicità. Pertanto, questa tecnica, che permette la produzione di molti cervelli feriti in breve tempo, può essere facilmente combinato con una grande scala in schermo ibridazione in situ per identificare geni con un ruolo nella rigenerazione e neurogenesi. L&#39;età del zebrafish adulti su cui viene eseguita la lesione è cruciale. Se i pesci sono più vecchi di 1,5 anni, il cranio è troppo duro ed è possibile che il cranio viene spinto verso il basso o fratturato anziché pulito forata. Al contrario, in esemplari più giovani (di età inferiore ai 4 mesi), c&#39;è ancora un sacco di neurogenesi in corso, che potrebbe lead di risultati falsi positivi per quanto riguarda la neurogenesi reattiva. Un altro passo fondamentale in questo approccio è quello di verificare l&#39;efficienza del coltellata e di escludere che entrambi gli emisferi sono feriti. Questo può essere monitorato mediante colorazione delle sezioni con l&#39;anticorpo anti-PCNA. In una lesione introdotto correttamente, PCNA dovrebbe essere significativamente up-regolata in uno solo degli emisferi. È importante tenere presente che il danno meccanico indotto una serie di effetti collaterali come l&#39;ablazione non specifica delle cellule, aumento della morte cellulare a causa della degenerazione secondaria, infiammazione e distruzione della barriera emato-encefalica, e danni di zona ventricolare e come una possibile conseguenza flusso del fluido cerebrospinale nel parenchima cerebrale. Tuttavia, i pesci feriti sembrano soffrire molto poco dall&#39;infortunio. Entro 2 minuti sono di nuovo nuoto libero e normale comportamento alimentare viene ripristinato nel giro di circa 4 ore. Dopo 3 settimane l&#39;injury non è morfologicamente più visibili. Nelle nostre mani, da diverse centinaia di interventi chirurgici non abbiamo perso un solo pesce, nonostante il fatto che abbiamo avuto un tasso di infortuni al 100% come valutato dal istologia a 5 giorni dopo la lesione. Negli ultimi anni sono state sviluppate altre tecniche come approcci transgenici in zebrafish per produrre tessuti o tipo cellulare ablazione specifico 2. Sebbene queste tecniche sono molto eleganti e minimamente invasiva si basano sulla generazione di complessi costrutti di DNA e la creazione di diverse linee transgeniche zebrafish stabili che possono essere molto noioso e che richiede tempo. Pertanto, semplici approcci meccanici quali il test descritto in questo protocollo restano uno strumento importante studiare adulto neurogenesi cervello e rigenerazione.

I mammiferi hanno una capacità molto limitata di generare nuovi neuroni durante la vita adulta, e la neurogenesi adulta nel cervello è in gran parte limitato a due regioni telencefalici situate nella zona subventricolare (SVZ) dei ventricoli laterali, e la zona subgranulare (SGZ) del dentate circonvoluzione nell&#39;ippocampo 1. Mammiferi inoltre, non può riparare i danni del cervello causata da malattie neurodegenerative, ictus o lesioni, in modo efficiente. Neuroni persi non vengono sostituiti e invece proliferazione di differenti tipi di cellule gliali, compresi astrociti, microglia, oligodendrociti e, si osserva. Come conseguenza di questo processo proliferativo chiamato gliosi reattiva, il tessuto cerebrale danneggiato è isolata ermeticamente dalla formazione di una cicatrice gliale, che inibisce neuronale e rigenerazione assonale 2-4. A differenza di mammiferi, pesci teleostei come il pesce zebra formare nuovi neuroni abbondantemente in stadi adulti e hanno una rigenerante elevato e proliferative potenziale per riparare lesioni del sistema nervoso centrale 2,5-7. Il cervello adulto zebrafish contiene 16 distinte nicchie staminali neurali che generano un gran numero di nuovi neuroni durante tutta la vita 8-11. I neuroni nati in queste specifiche zone di proliferazione del cervello zebrafish adulto migrano le loro aree di destinazione, dove potranno maturare e integrare nelle reti neuronali esistenti 8,10,12-15. Tra le zone progenitrici identificati in zebrafish adulti, la zona ventricolare telencefalico è una delle nicchie staminali neuronali più studiati. Le cellule in questo progenitore di nicchia possono essere classificate in tre tipi distinti quanto riguarda la loro morfologia, il tasso di divisione e di espressione di gliali diversa o marcatori neuronali. Tipo I e le cellule di tipo II sono gliali radiali come le cellule che hanno processi lunghi. Essi esprimono cellule staminali marcatori tra cui GFAP, nestin, e S100β. Tipo I le cellule non proliferano, mentre le cellule di tipo II proliferate lentamente, come dimostra la loro espressione di marcatori di proliferazione, quali proliferazione cellulare antigene nucleare (PCNA) e l&#39;incorporazione di analoghi desoxythymidine. Le celle di tipo III sono in rapida divisione delle cellule che si sono impegnati a diventare progenitori neurali ed esprimere geni marcatori neurali, come il PSA-NCAM 5,16. Anche se le capacità rigenerative dei pesci teleostei sono ben documentati, solo poche pubblicazioni hanno descritto e studiato in dettaglio i meccanismi cellulari e molecolari coinvolti nella rigenerazione neuronale nel telencefalo adulti in risposta al danno 15,17-22. Per decifrare i meccanismi implicati nella zebrafish adulto centro di rigenerazione del sistema nervoso e la riparazione e per comprendere le somiglianze e le differenze tra neurogenesi costitutivo e rigenerativa, abbiamo sviluppato un modello di zebrafish di lesioni telencefalica adulto. Qui, descriveremo visivamente come generare un infortunio in uno dei hemisph telencefalicaeres con l&#39;aiuto di un ago di siringa, mantenendo il lato unlesioned controlaterale come controllo interno. Mostreremo anche come monitorare i cambiamenti su lesioni nella proliferazione cellulare e l&#39;espressione genica mediante immunoistochimica e in saggi di ibridazione in situ.

<table><tbody><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma</td><td>335.2</td><td></td></tr><tr><td>10x DPBS (-/-)</td><td>Life technologies</td><td>14200-083</td><td></td></tr><tr><td>30 G syringe (Omnican 40)</td><td>B.Braun Melsungen</td><td>916162</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene molding cup tray&amp;nbsp;</td><td>Polysciences, Inc</td><td>17177C-3</td><td></td></tr><tr><td>PeqGOLD Universal Agarose&amp;nbsp;</td><td>Peqlab</td><td>35-1020</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Biochrom</td><td>W 2835919108</td><td></td></tr><tr><td>Aqua Poly/Mount</td><td>Polysciences, Inc</td><td>18606-20</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Carl Roth</td><td>9127.1</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Carl Roth</td><td>A994.2</td><td></td></tr><tr><td>Dissection needle</td><td>Carl Roth</td><td>KX93.1</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Carl Roth</td><td>335.2</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 414</td><td>Sch&amp;ouml;ffler und W&amp;ouml;rner</td><td>&lt;a href=&quot;http://62.157.117.162/BP2NAV500/ItemDetail_NAV.aspx?ItemID=06%201362%200020&quot;&gt;06 1362 0020&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>Labonord</td><td>5305103</td><td></td></tr><tr><td>Cover slips 24 x 60 mm</td><td>Labonord</td><td>5305060</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes, 94 mm</td><td>Greiner bio-one</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes, 15 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Greiner bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>Anti-S100 (1:500)</td><td>Dako</td><td>Z031101-2</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PCNA (1:400)</td><td>Dako</td><td>M087901</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP (1:1,000)</td><td>Aves Labs</td><td>GFP-1020</td><td></td></tr><tr><td>anti-Dig AP-coupled antibody&amp;nbsp;</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP)&amp;nbsp;</td><td>Roche Diagnostics</td><td>1383221</td><td></td></tr><tr><td>4-Nitroblue tetrazolium chloride (NBT)&amp;nbsp;</td><td>Roche Diagnostics</td><td>1383213</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche Diagnostics</td><td>1092766</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene molding cup tray&amp;nbsp;</td><td>Polysciences</td><td>17177C-3</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome VT1000S</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope Sp5 DM6000</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope Nikon SMZ 645</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-well flat bottomed tissue culture plates&amp;nbsp;</td><td>Falcon catalog&amp;nbsp;</td><td>353226</td><td></td></tr><tr><td>Student Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Danio rerio Tg(olig2:EGFP)&lt;/em&gt;</td><td>Shin &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;&lt;sup&gt;24&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Danio rerio&lt;/em&gt; WT strains (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, AB2O2)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

stab wound injury of the zebrafish adult telencephalon: a method to investigate vertebrate brain neurogenesis and regeneration

Zebrafish adulto ha una straordinaria capacità di rigenerare il loro sistema nervoso centrale dopo l&#39;infortunio. Per studiare la risposta cellulare ed i meccanismi molecolari coinvolti nella zebrafish adulto sistema nervoso centrale (SNC) rigenerazione e la riparazione, abbiamo sviluppato un modello di zebrafish di lesioni telencefalica adulto. In questo approccio, generiamo manualmente un infortunio spingendo una siringa di insulina nel telencefalo adulto zebrafish. A diversi giorni di pregiudizio dopo, i pesci sono sacrificati, i loro cervelli sono sezionati fuori e colorate con immunoistochimica e / o ibridazione in situ (ISH) con marcatori appropriati per osservare la proliferazione cellulare, gliogenesi, e neurogenesi. L&#39;emisfero controlaterale unlesioned serve come controllo interno. Questo metodo combinato, ad esempio con l&#39;RNA sequenziamento profondo può aiutare a schermata di nuovi geni con un ruolo nella neurogenesi telencefalo zebrafish adulto, la rigenerazione e la riparazione.

Utilizzando il flusso di lavoro descritto in questo articolo, una lesione è stata introdotta nel emisfero destro di un telencefalo zebrafish adulto (Figure 1A-1B). Una corretta ferimento conduce ad un canale lesione che si estende da dorsale a ventrale attraverso tutta pallio del telencefalo (Figura 3C). La lesione dovrebbe essere limitato a uno degli emisferi e non deve attraversare il ventricolo mediale. Il canale lesione è visibile con il microscopio in campo chiaro (Figura 3C) e verrà guarito dopo circa 35 giorni a 15. È stato precedentemente dimostrato che dopo aver ferito un up-regolazione di proliferazione delle cellule antigene nucleare (PCNA, figura 3A) e S100β (Figura 3B) a 3-7 DPL è rilevabile mediante immunoistochimica 15. La colorazione di PCNA e S100β è sovrapposizione, indicando proliferazione delle cellule gliali radiali. Fnoltre, al fine di visualizzare le cellule precursori degli oligodendrociti (OPC), un saggio pugnalata ferita è stata eseguita sul Tg (Olig2: EGFP) Pesci 24. Su colorazione con un anticorpo anti-GFP, accumulo di OPC in prossimità del canale lesione è rilevabile (Figura 3D). Questo accumulo è transitorio, e cluster OPC non si osservano più a 35 dpl 15. Se la lesione non è stato introdotto correttamente, il canale lesione non sarà visibile, e up-regulation di PCNA e S100β o accumulo di OPC non sarà rilevabile. PCNA è il marcatore più sensibile per le lesioni cerebrali. Al fine di verificare l&#39;efficienza del coltellata ed escludere che entrambi gli emisferi sono feriti, si raccomanda di macchiare sempre le sezioni con un anticorpo anti-PCNA. In una lesione introdotto correttamente, PCNA dovrebbe essere significativamente up-regolata (fino a 4 volte 15) in uno solo degli emisferi. Sebbene nella maggior parte dei casi èsufficiente utilizzare solo il lato unlesioned controlaterale come controllo interno per monitorare i cambiamenti nell&#39;espressione genica, si consiglia vivamente di confrontare l&#39;espressione genica nell&#39;emisfero controllo con l&#39;espressione in emisferi telencefalici di tipo cervelli selvatici. In questo modo, tutti gli effetti sistemici della lesione sull&#39;espressione genica che interesserebbe entrambi gli emisferi possono essere rilevati. La pugnalata ferita dosaggio in combinazione con uno schermo sistematica espressione di regolatori della trascrizione (TRS) (25 e Schmidt et al., Inedito) può anche essere utilizzato per identificare i geni TR con un possibile ruolo nella neurogenesi e rigenerazione (Figure 4A-4C). Questo approccio ha individuato una serie di fattori che sono espressi in telencefalo e la cui espressione è specificamente up-regolata in risposta a lesioni (Figura 4A-C). <imgalt = &quot;Figura 1&quot; fo: content-width = &quot;5in&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51753/51753fig1highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Figura 1. Rappresentazione schematica di zebrafish adulto telencefalica stab ferimento. A) L&#39;ago della siringa di insulina viene spinto attraverso il cranio di un zebrafish adulto di generare un infortunio telencefalica. Il bianco linea tratteggiata rappresenta il confine tra i due emisferi telencefalici e la croce verde indica la posizione della coltellata. B) Vista dorsale di un cervello zebrafish adulto. Sono indicate le principali aree cerebrali. La croce verde indica la posizione della lesione indotta. C) La punta dell&#39;ago, che serve per indurre il pregiudizio telencefalica, misure 2 mm. Bulbo olfattivo (ob), telencefalo (tel) e tetto ottico (ot). <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51753/51753fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. SRappresentazione chematic di un cervello zebrafish adulto in un blocco di agarosio tagliata poco prima vibratomo sezionamento. anteriore è alto. Bulbo olfattivo (ob), telencefalo (tel), tetto ottico (ot), cervelletto (cb) e midollo (m). Scala bar: 500 micron. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51753/51753fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. Risposte rigenerative per pugnalare lesioni ferita. DC) Adulto cervello zebrafish a 5 giorni dopo il lesione (dpl). AB) Il PCNA proliferativa marcatore (A) e il marcatore gliali radiali S100β (B) sono up-regolati nella zona ventricolare (frecce) sul ferimento stab. (C) Il canale lesione è visibile sotto illuminazione in campo chiaro (frecce). La zona ventricolare è indicato dalla linea verde. (D) le cellule Oligodendrocyte precursori (Olig2: EGFP +) si accumulano nel sito della lesione (frecce). Scala bar: 200 micron. In tutti i pannelli, l&#39;emisfero destro è l&#39;emisfero leso. Dorsale è alto. La linea tratteggiata in A a D indica il confine tra il pallio e la subpallium. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51753/51753fig4highres.jpg" width="600" /> Figura 4. Un esempio di geni up-regolati in risposta a pugnalare lesioni. Notare il forte up-regulation (frecce) di eomesa (A, B) e sox4a (C) espressione di mRNA nell&#39;emisfero destro telencefalica (emisfero accoltellato) monitorata mediante ibridazione in situ a 5 dpl. L&#39;emisfero sinistro è illeso e serve come controllo. (B) mostra un ingrandimento maggiore della regione telencefalica dorsale di A. dorsale è alto. Barra della scala: 200 micron per A e C e 55 micron per B. Illinea tratteggiata in A e C indica la separazione tra il pallio e la subpallium. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51753/51753fig4highres.jpg" target="_blank">cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table><tbody><tr><td colspan="2"> ABBREVIAZIONI </td></tr><tr><td> AP </td><td> Fosfatasi alcalina </td></tr><tr><td> BCIP </td><td> 5-bromo-4-cloro-3&#39;-indolyphosphate </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Albumina di siero bovino </td></tr><tr><td> CNS </td><td> Sistema nervoso centrale </td></tr><tr><td> Dig </td><td> Digossigenina </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Dimetilsolfossido </td></tr><tr><td> dpl </td><td> Giorni dopo lesione </td></tr><tr><td> eomesa </td><td> Eomesodermin omologo di un </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Proteina acidica fibrillare gliale </td></tr><tr><td> hr </td><td> Ora </td></tr><tr><td> HYBbuffer </td><td> Tampone di ibridazione </td></tr><tr><td> ISH </td><td> ibridazione in situ </td></tr><tr><td> MeOH </td><td> Metanolo </td></tr><tr><td> NBT </td><td> Nitro-blu tetrazolio </td></tr><tr><td> OPC </td><td> Cellule precursori degli oligodendrociti </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Tampone fosfato </td></tr><tr><td> PCNA </td><td> Antigene nucleare della proliferazione cellulare </td></tr><tr><td> PFA </td><td> Paraformaldeide </td></tr><tr><td> ProtK </td><td> Proteinasi K </td></tr><tr><td> PSA-NCAM </td><td> Polysialylated neuronale molecola di adesione delle cellule </td></tr><tr><td> PTW </td><td> PBS, 0.1% Tween-20 </td></tr><tr><td> RNA </td><td> Acido ribonucleico </td></tr><tr><td> RT </td><td> Temperatura ambiente </td></tr><tr><td> SGZ </td><td> Zona subgranular </td></tr><tr><td> sox4a </td><td> SRY-box contenente gene 4a</td></tr><tr><td> SSC </td><td> Citrato di Saline di sodio </td></tr><tr><td> SVZ </td><td> Zona subventricolare </td></tr><tr><td> TR </td><td> Regolatori della trascrizione </td></tr></tbody></table>

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Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.

Stab Ferita Lesione del Zebrafish adulti Telencefalo: Un metodo per Indagare vertebrati cervello neurogenesi e rigenerazione

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular ...

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Nanyang Technological University

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The Nervous System and Nervous Tissue

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15.3K Views.  Karlsruhe Institute of Technology. To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.

Video: Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes. External development and optical transparency make these embryos especially amenable to microscopy, and numerous transgenic lines that label specific cell types with fluorescent proteins are available, making the zebrafish embryo an ideal system for visualizing the interaction of vascular, hematopoietic, and other cell types during injury and repair in vivo. Forward and reverse genetics in zebrafish are well developed, and pharmacological manipulation is possible. We describe a mechanical vascular injury model using micromanipulation techniques that exploits several of these features to study responses to vascular injury including hemostasis and blood vessel repair. Using a combination of video and timelapse microscopy, we demonstrate that this method of vascular injury results in measurable and reproducible responses during hemostasis and wound repair. This method provides a system for studying vascular injury and repair in detail in a whole animal model.

This article describes a method for creating a mechanical vessel injury in zebrafish embryos. This injury model provides a platform for studying hemostasis, injury-related inflammation, and wound healing in an organism ideally suited for real-time microscopy.

Mechanical Injury Vessel in embrioni di zebrafish

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell migration. However, when explants are established, these cells also move collectively, maintaining many of the features which make individual keratocytes an attractive model to study migration: rapid rates of motility, extensive actin-rich lamellae with a perpendicular actin cable, and relatively constant speed and direction of migration. In early explants, the rapid interconversion of cells migrating individually with those migrating collectively allows the study of the role of cell-cell adhesions in determining the mode of migration, and emphasizes the molecular links between the two modes of migration. Cells in later explants lose their ability to migrate rapidly and collectively as an epithelial to mesenchymal transition occurs and genes associated with wound healing and inflammation are differentially expressed. Thus, keratocyte explants can serve as an in vitro model for the reepithelialization that occurs during cutaneous wound healing and can represent a unique system to study mechanisms of collective cell migration in the context of a defined program of gene expression changes. A variety of mutant and transgenic zebrafish lines are available, which allows explants to be established from fish with different genetic backgrounds. This allows the role of different proteins within these processes to be uniquely addressed. The protocols outlined here describe an easy and effective method for establishing these explant cultures for use in a variety of assays related to collective cell migration.

Zebrafish keratocytes migrate in cell sheets from explants and provide an in vitro model for the study of the mechanisms of collective cell migration in the context of epithelial wound healing. These protocols detail an effective way to establish primary explant cultures for use in collective cell migration assays.

Zebrafish Keratocyte espianti per studiare la migrazione delle cellule collettiva e riepitelizzazione in guarigione delle ferite cutanee

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

The nervous system is often described as a hard-wired component of the body even though it is a considerably fluid organ system that reacts to external stimuli in a consistent, stereotyped manner, while maintaining incredible flexibility and plasticity. Unlike the central nervous system (CNS), the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair, but we have only just begun to understand the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using zebrafish as a model system, we have the unprecedented opportunity to couple regenerative studies with in vivo imaging and genetic manipulation. Peripheral nerves are composed of axons surrounded by layers of glia and connective tissue. Axons are ensheathed by myelinating or non-myelinating Schwann cells, which are in turn wrapped into a fascicle by a cellular sheath called the perineurium. Following an injury, adult peripheral nerves have the remarkable capacity to remove damaged axonal debris and re-innervate targets. To investigate the roles of all peripheral glia in PNS regeneration, we describe here an axon transection assay that uses a commercially available nitrogen-pumped dye laser to axotomize motor nerves in live transgenic zebrafish. We further describe the methods to couple these experiments to time-lapse imaging of injured and control nerves. This experimental paradigm can be used to not only assess the role that glia play in nerve regeneration, but can also be the platform for elucidating the molecular mechanisms that govern nervous system repair.

Although the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair after injury, little is known about the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using live, transgenic zebrafish and a reproducible nerve transection assay, we can study dynamic glial cell behaviors during nerve degeneration and regeneration.

Motor Nerve transezione e Time-lapse imaging di gliali comportamenti delle cellule in vivo Zebrafish

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Neuroscienze

Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its permeability, thereby allowing different molecules to be introduced to the cell. In this paper, electroporation is used to introduce plasmids to ependymoglial cells, which line the ventricular zone of the adult zebrafish telencephalon. A fraction of these cells shows stem cell properties and generates new neurons in the zebrafish brain; therefore, studying their behavior is essential to determine their roles in neurogenesis and regeneration. The introduction of plasmids via electroporation enables long-term labeling and tracking of a single ependymoglial cell. Furthermore, plasmids such as Cre recombinase or Cas9 can be delivered to single ependymoglial cells, which enables gene recombination or gene editing and provides a unique opportunity to assess the cell&#8217;s autonomous gene function in a controlled, natural environment. Finally, this detailed, step-by-step electroporation protocol is used to obtain successful introduction of plasmids into a large number of single ependymoglial cells.

Presented here is an electroporation method for plasmid DNA delivery and ependymoglial cell labeling in the adult zebrafish telencephalon. This protocol is a quick and efficient method to visualize and trace individual ependymoglial cells and opens up new possibilities to apply electroporation to a broad range of genetic manipulations.

Metodo di elettroporazione per in vivo Consegna del DNA plasmide nel Telencephalon del pesce zebra adulto

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

Spinal Cord transezione nel larvale Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Stab Wound Injury Model of the Adult Optic Tectum Using Zebrafish and Medaka for the Comparative Analysis of Regenerative Capacity

While zebrafish have a superior capacity to regenerate their central nervous system (CNS), medaka has a lower CNS regenerative capacity. A brain injury model was developed in the adult optic tectum of zebrafish and medaka and comparative histological and molecular analyses were performed to elucidate the molecular mechanisms regulating the high regenerative capacity of this tissue across these fish species. Here a stab wound injury model is presented for the adult optic tectum using a needle and histological analyses for proliferation and differentiation of the neural stem cells (NSCs). A needle was manually inserted into the central region of the optic tectum, and then the fish were intracardially perfused, and their brains were dissected. These tissues were then cryosectioned and evaluated using immunostaining against the appropriate NSC proliferation and differentiation markers. This tectum injury model provides robust and reproducible results in both zebrafish and medaka, allowing for comparing NSC responses after injury. This method is available for small teleosts, including zebrafish, medaka, and African killifish, and enables us to compare their regenerative capacity and investigate unique molecular mechanisms.

A mechanical brain injury model in the adult zebrafish is described to investigate the molecular mechanisms regulating their high regenerative capacity. The method explains to create a stab wound injury in the optic tectum of multiple species of small fish to evaluate the regenerative responses using fluorescent immunostaining.

Modello di lesione da coltellata del tectum ottico adulto utilizzando zebrafish e medaka per l'analisi comparativa della capacità rigenerativa

While zebrafish have a superior capacity to regenerate their central nervous system (CNS), medaka has a lower CNS regenerative capacity. A brain injury ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to synaptic degeneration, inflammation, neuronal death, and learning deficits. Humans cannot regenerate lost neurons in the case of AD in part due to impaired proliferative capacity of the neural stem/progenitor cells (NSPCs) and reduced neurogenesis. Therefore, efficient regenerative therapies should also enhance the proliferation and neurogenic capacity of NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) is a regenerative organism, and we can learn the basic molecular programs with which we could design therapeutic approaches to tackle AD. For this reason, the generation of an AD-like model in zebrafish was necessary. Using our methodology, we can introduce synthetic derivatives of A&#946;42 peptide with tissue penetrating capability into the adult zebrafish brain, and analyze the disease pathology and the regenerative response. The advantage over the existing methods or animal models is that zebrafish can teach us how a vertebrate brain can naturally regenerate, and thus help us to treat human neurodegenerative diseases better by targeting endogenous NSPCs. Therefore, the amyloid-toxicity model established in the adult zebrafish brain may open new avenues for research in the field of neuroscience and clinical medicine. Additionally, the simple execution of this method allows for cost-effective and efficient experimental assessment. This manuscript describes the synthesis and injection of A&#946;42 peptides into zebrafish brain.

This protocol describes the synthesis, characterization, and injection of monomeric amyloid-&#946;42 peptides for generating amyloid toxicity in adult zebrafish to establish an Alzheimer&#39;s disease model, followed by histological analyses and detection of aggregations.

Modellazione dell'amiloide-β42 tossicità e neurodegenerazione nel cervello adulto di Zebrafish

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and heterogenous secondary effects. While there is no mechanism to replace or regenerate the lost neurons following a TBI in humans, zebrafish possess the ability to regenerate neurons throughout their body, including the brain. To examine the breadth of pathologies exhibited in zebrafish following a blunt-force TBI and to study the mechanisms underlying the subsequent neuronal regenerative response, we modified the commonly used rodent Marmarou weight drop for the use in adult zebrafish. Our simple blunt-force TBI model is scalable, inducing a mild, moderate, or severe TBI, and recapitulates many of the phenotypes observed following human TBI, such as contact- and post-traumatic seizures, edema, subdural and intracerebral hematomas, and cognitive impairments, each displayed in an injury severity-dependent manner. TBI sequelae, which begin to appear within minutes of the injury, subside and return to near undamaged control levels within 7 days post-injury. The regenerative process begins as early as 48 hours post-injury (hpi), with the peak cell proliferation observed by 60 hpi. Thus, our zebrafish blunt-force TBI model produces characteristic primary and secondary injury TBI pathologies similar to human TBI, which allows for investigating disease onset and progression, along with the mechanisms of neuronal regeneration that is unique to zebrafish.

We modified the Marmarou weight drop model for adult zebrafish to examine a breadth of pathologies following blunt-force traumatic brain injury (TBI) and the mechanisms underlying subsequent neuronal regeneration. This blunt-force TBI model is scalable, induces a mild, moderate, or severe TBI, and recapitulates injury heterogeneity observed in human TBI.

Un modello scalabile per studiare gli effetti della lesione da forza smussata nel pesce zebra adulto

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and ...

Assessment of Swim Endurance and Swim Behavior in Adult Zebrafish

Due to their renowned regenerative capacity, adult zebrafish are a premier vertebrate model to interrogate mechanisms of innate spinal cord regeneration. Following complete transection of their spinal cord, zebrafish extend glial and axonal bridges across severed tissue, regenerate neurons proximal to the lesion, and regain their swim capacities within 8 weeks of injury. Recovery of swim function is thus a central readout for functional spinal cord repair. Here, we describe a set of behavioral assays to quantify zebrafish motor capacity inside an enclosed swim tunnel. The goal of these methods is to provide quantifiable measurements of swim endurance and swim behavior in adult zebrafish. For swim endurance, zebrafish are subjected to a constantly increasing water current velocity until exhaustion, and time at exhaustion is reported. For swim behavior assessment, zebrafish are subjected to low current velocities and swim videos are captured with a dorsal view of the fish. Percent activity, burst frequency, and time spent against the water current provide quantifiable readouts of swim behavior. We quantified swim endurance and swim behavior in wild-type zebrafish before injury and after spinal cord transection. We found that zebrafish lose swim function after spinal cord transection and gradually regain that capacity between 2 and 6 weeks post-injury. The methods described in this study could be applied to neurobehavioral, musculoskeletal, skeletal muscle regeneration, and neural regeneration studies in adult zebrafish.

Capable of functional recovery after spinal cord injury, adult zebrafish is a premier model system to elucidate innate mechanisms of neural regeneration. Here, we describe swim endurance and swim behavior assays as functional readouts of spinal cord regeneration.

Valutazione della resistenza al nuoto e del comportamento di nuoto nel pesce zebra adulto

Due to their renowned regenerative capacity, adult zebrafish are a premier vertebrate model to interrogate mechanisms of innate spinal cord regeneration. ...

Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae possess a fully functional central nervous system (CNS) with a high regenerative capacity only a few days after fertilization. This makes this animal model very useful for studying spinal cord injury and regeneration. The standard protocol for inducing such lesions is to transect the dorsal part of the trunk manually. However, this technique requires extensive training and damages additional tissues. A protocol was developed for laser-induced lesions to circumvent these limitations, allowing for high reproducibility and completeness of spinal cord transection over many animals and between different sessions, even for an untrained operator. Furthermore, tissue damage is mainly limited to the spinal cord itself, reducing confounding effects from injuring different tissues, e.g., skin, muscle, and CNS. Moreover, hemi-lesions of the spinal cord are possible. Improved preservation of tissue integrity after laser injury facilitates further dissections needed for additional analyses, such as electrophysiology. Hence, this method offers precise control of the injury extent that is unachievable manually. This allows for new experimental paradigms in this powerful model in the future.

The present protocol describes a method to induce tissue-specific and highly reproducible injuries in zebrafish larvae using a laser lesion system combined with an automated microfluidic platform for larvae handling.

Lesioni indotte da laser semi-automatizzate controllate per lo studio della rigenerazione del midollo spinale nelle larve di zebrafish

Zebrafish larvae possess a fully functional central nervous system (CNS) with a high regenerative capacity only a few days after fertilization. This makes ...