Gli autori ringraziano René Scriwanek per l&#39;assistenza alla preparazione della figura. FR è sostenuto da ECHO (700.59.003), ALW programma aperto (821.02.017 e 822.02.014), la cooperazione DFG-NWO (DN82-303) e ZonMw VICI (016.130.606) sovvenzioni.

1. Spheroplast Preparazione <ol><li> Incubare il lievito notte a 30 ° C in 10 ml di mezzo appropriato determinato dal disegno dell&#39;esperimento. </li><li> Il giorno dopo, misurare la densità ottica della coltura a 600 nm (OD 600) usando un fotometro, Diluire le cellule nello stesso terreno di coltura ad una OD 600 di 0,2-0,4 e farle crescere ad una fase di crescita esponenziale meno che la progettazione del esperimento richiede una condizione diversa. Le cellule sono in fase esponenziale quando la coltura ha un diametro esterno 600 di 1-2. </li><li> Raccogliere 10 OD 600 equivalenti di cellule mediante centrifugazione a 3500 xg per 5 minuti in un tubo da 50 ml. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in 5 ml di tubi 100 mM (pH 9,6), ditiotreitolo 10 mM e incubate a 30 ° C per 10 min. </li><li> Raccogliere nuovamente le cellule per centrifugazione a 3.500 xg per 5 min. Scartare il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule in 5 ml di terreno (determinato dal disegno dell&#39;esperimento) contenente 1 M sorbitolo e 5 mg di enzima litico, e incubare la miscela a 30 ° C con delicata agitazione per 30 min. </li><li> Centrifugare la sospensione cellulare a 300 xg per 5 minuti per raccogliere la frazione di pellet, che corrisponde alle sferoplasti. Scartare il surnatante. </li><li> Risospendere le sferoplasti in 960 ml di ghiaccio freddo supporti (medio determinato dal disegno dell&#39;esperimento) contenente 1 M sorbitolo e trasferire il composto in una ghiacciata 2 ml provetta. </li></ol> 2. Nanogold assorbimento <ol><li> Usando una pipetta, mescolare delicatamente il spheroplast con 4 nmol di particelle cariche positivamente nanogold risospese in 40 ml di acqua. Il volume finale della miscela deve essere di 1 ml. </li><li> Posizionare la sospensione cellulare ottenuta in ghiaccio per 15 min. </li><li> Trasferire la sospensione a temperatura ambiente ed incubare per il tempo necessario a consentire nanogold internalizzazione via endocytosis. NOTA: A 5 min assorbimento sarà principalmente portare l&#39;etichettatura di vescicole e dei primi comparti endosomiali, mentre un 15 min assorbimento permetterà di contrassegnare l&#39;intero sistema endosomiale (precoce e endosomi tardivi). Tempi di incubazione più lungo (più di 30 min), consentiranno inoltre di etichettare vacuolo. NOTA: esperimenti di etichettatura Pulse-chase non possono essere eseguite con questo metodo. Pertanto, quando l&#39;etichettatura per l&#39;analisi di LE, nanogold anche essere trovate in PM e INEE. </li></ol> 3. Fissazione e sezionamento <ol><li> Interrompere l&#39;assorbimento nanogold con l&#39;aggiunta di 1 ml di doppio fissativo forza [4% paraformaldeide (PFA), 0,4% glutaraldeide (GA) in 0.1 M tampone PHEM (20 TUBI mm, 50 HEPES mM, pH 6,9, 20 mM EGTA, MgCl 4 mM 2)] contenente 1 M sorbitolo alla sospensione cellulare. Mantenuto il tubo a temperatura ambiente. </li><li> Capovolgere delicatamente manualmente le provette micocentrifuge più volte durante 30 minuti (questo permetterà di mantenere le sferoplasti insospensione) e centrifugare due volte a 1700 xg per 25 sec. </li><li> Sostituire il fissativo scartando il surnatante e con l&#39;aggiunta di 1 ml di fissativo fresco forza standard (2% PFA, 0,2% GA in 0.1 M tampone PHEM) contenente 1 M sorbitolo e incubare per 2 ore a temperatura ambiente su una ruota lenta rotazione della camera. </li><li> Elaborare le cellule per crio-sezionamento come descritto in precedenza 6. NOTA: Per le procedure di valorizzazione nanogold assorbimento e d&#39;argento, il trattamento con acido periodico descritto nel protocollo indicato è di non essere effettuati. Il trattamento con acido periodico è permeabilize meglio la parete cellulare 26 ma questa struttura è stata eliminata durante la generazione di sferoplasti. </li><li> Tagliare 50 criosezioni sottili nm a -120 ° C con la lama di diamante a secco utilizzando un UCT ultramicrotomo come descritto in precedenza 8 e metterli su carbone Formvar rivestito 50 maglie griglie di nichel. </li></ol> 4. Miglioramento argento per Nanogold particelle Visualizzazione NOTA: La procedura per preparare le miscele di reazione è fondamentalmente quello indicato dal costruttore. Adeguamenti pratici che utilizzano questo protocollo, rende la procedura di valorizzazione argento efficace e affidabile su criosezioni. <ol><li> Rimuovere il kit di potenziamento argento dal freezer e scongelare in un incubatore a 37 ° C oa bagnomaria. Quando scongelati, posizionare il kit in un incubatore a 24 ° C collocato in una stanza buia fino al momento dell&#39;uso (vedi 4.7). </li><li> Posizionare la piastra di riscaldamento in camera oscura e riscaldarlo alla temperatura finale di 24 ° C. </li><li> Coprire la parte superiore della piastra di riscaldamento con la protezione di superficie, lato lucido, e fissarlo con un nastro. </li><li> Posizionare il Parafilm sul Benchkote e segnare i bordi con un pennarello nero per essere in grado di vedere i bordi parafilm nel buio. </li><li> Nastro un termometro sulla parte superiore della Benchkote per monitorare la temperatura della piastra riscaldante. Gradualmente regolare la temperatura se non 24 ° C. </li><li> PlaCE Il tubo da 50 ml con acqua bidistillata e il kit di miglioramento argento all&#39;interno. </li><li> Riempire le piccole piastre di Petri con acqua bidistillata, pre-riscaldato a 37 ° C. Posizionare le griglie in acqua, provino lato negativo, per 30 min. </li><li> Ripetere questo passo 4.7 ancora una volta. </li><li> Trasferire le griglie nel box di stoccaggio e portarli alla camera oscura. </li><li> Risciacquare nuovamente le griglie facendoli passare (con il lato campione giù) su alcune gocce di acqua bidistillata a 24 ° C immessi sul parafilm che è stato fissato sulla piastra di riscaldamento. </li><li> Assicurarsi che 9 supplementare doppio gocce d&#39;acqua distillata sono pronti sul Parafilm, per il risciacquo dopo la reazione valorizzazione argento. </li><li> Spegnere la luce e assicurarsi che tutte le luci siano spente. Accendere la luce rossa. </li><li> Estrarre le soluzioni A e B del kit potenziamento argento dal termostato 24 ° C. </li><li> Mettere primi 6 gocce di soluzione A e poi 6 gocce di soluzione B in un 1,5 ml provetta e mescolare bene con una pipetta Pasteur di vetro evitando di fare le bolle. La soluzione è abbastanza spessa e deve essere miscelato manualmente con una pipetta prima di finalmente vortex brevemente. </li><li> Mettere le soluzioni A e B di nuovo in incubatrice 24 ° C ed estrarre la soluzione C. </li><li> Aggiungere 6 gocce della soluzione C al mix A / B. Poi mescolare ancora prima con una pipetta Pasteur e poi nel vortex, evitare di fare bolle. </li><li> Utilizzare immediatamente la miscela finale inserendo (~ 20 l / drop) gocce sul Parafilm. </li><li> Con un pulito, pinzette anti-magnetico, posizionare le griglie sulla miscela (ad es., Argento migliorando reazione) da 6 a 15 minuti a seconda della valorizzazione (ie. Dimensione delle particelle d&#39;oro) voluto da ottenere. </li><li> Rimuovere le griglie dalla miscela e trasferirli sulla superficie dell&#39;acqua bidistillata scende a 24 ° C per lavaggi. In primo luogo, utilizzare in rapida successione 6 gocce e poi 3 gocce con 7 min tempo di incubazione per goccia, Prima di accendere le luci. </li><li> Procedere con il passaggio successivo, sia l&#39;etichettatura immuno-oro o marcatura di membrana 27, al fine di visualizzare il risultato di un&#39;inchiesta EM. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Immuno-microscopia elettronica è una tecnica che permette di combinare localizzazione di proteine ​​con la risoluzione ultrastrutturale dei vettori e organelli dove queste proteine ​​risiedono. Ciò è particolarmente importante quando si studia il sistema lievito endosomiale perché i suoi comparti appaiono come strutture puntuate in microscopia a fluorescenza. È pertanto difficile distinguerle. Per questo motivo l&#39;uso di una sonda rilevabile da EM e immettendo il percorso endocitosi in modo dipendente dal tempo è cruciale per marcare specificamente le diverse endosomi. Questo tipo di sonda è utile per valutare la funzionalità di endocitosi 6 ed è un&#39;alternativa alla mancanza di sieri rilevare marcatori proteici. La procedura qui descritta exploit caricato positivamente nanogold come sonda per etichettare i comparti endosomali. Mentre criosezionamento richiede attrezzature e competenze speciali, il protocollo presentato è tecnicamente facile e non riCoro macchine speciali. Pertanto è accessibile a qualsiasi laboratorio che vorrebbe usarlo per la sua ricerca. Tuttavia, alcune precauzioni devono essere prese durante la fase critica di questa procedura, cioè la reazione valorizzazione argento. Questa reazione è molto sensibile alla luce e quindi tutte le luci (tranne quella rossa) in sala deve essere spento e / o coperto. Come tutte le reazioni chimiche, la velocità della reazione valorizzazione argento è influenzata dalla temperatura. Per ottenere risultati coerenti e riproducibili con gli stessi parametri, tutte le soluzioni e gli strumenti devono essere attentamente preincubato a 24 ° C. È fondamentale stabilire con precisione il tempo di incubazione per la valorizzazione argento nella stanza in cui verrà effettuata regolarmente questa reazione. Espansione del nanogold deve essere sufficientemente lungo per essere in grado di rilevare visivamente la particella d&#39;oro da EM e deve essere sufficientemente breve da evitare la generazione di particelle di grandi dimensioni, che potrebbe riguardare i morfologiche. Per questo motivo, è vivamente consigliabile l&#39;esecuzione di un esperimento pilota durante l&#39;impostazione di questa tecnica in laboratorio. Durante questo test le particelle nanogold devono essere argento avanzato per tempi diversi per determinare il tempo ottimale per la reazione. Da notare che le dimensioni delle particelle ottenute non possono essere di dimensioni omogenee; ci sarà sempre qualche eterogeneità, ma questo deve essere mantenuto al minimo possibile, in un range compreso tra 5 - 15 nm. Questo è particolarmente importante se la procedura nanogold assorbimento sarà combinato con etichettature immuno-oro. Un altro aspetto da tenere in considerazione quando si interpretano i risultati è che gli esperimenti di etichettatura pulse-chase non sono possibili con questo metodo. Di conseguenza il PM e EE sono etichettati anche in un assorbimento nanogold mirato a visualizzare LE. È anche possibile vedere le applicazioni aggiuntive del protocollo presentato qui. Un&#39;opzione potrebbe essere quella di correlare i dati EM di nanogold captazione con microscop fluorescentey. FM4-64 è un lipofila colorante fluorescente marcatore che associa al PM e, nel suo cammino verso il vacuolo, sta attraversando i comparti endosomiali in modo dipendente dal tempo. Entrambi FM4-64 e nanogold entrare nella cellula in associazione con lipidi e hanno probabilmente molto simile cinetica di internalizzazione 28,29. Di conseguenza entrambi i coloranti possono essere usati allo stesso tempo in correlativo luce-EM approcci per esplorare simultaneamente la dinamica e la ultrastruttura della endocytic compartments.The presentato metodo può essere utilizzato anche per il traffico recettore-mediata attraverso il sistema endocytic 30. Derivati ​​Monomaleido e mono-solfo-N-idrossi-succinimmidico del nanogold possono essere usate per legare covalentemente queste particelle di proteine ​​6. Ad esempio reticolazione con la-a o l&#39;α-fattore può permettere a seguito della endocitosi di questi due feromoni dai loro recettori specifici. Tutti insieme, il protocollo descritto permette di specifically etichettare gli organelli del sistema lievito endosomal utilizzando una sonda endocitosi, che può essere reso rilevabile da EM. Questo strumento sperimentale è un valido approccio per studiare la biogenesi e l&#39;organizzazione dei compartimenti lievito endosomiali a livello ultrastrutturale.

Il sistema endosomal è un importante apparato di smistamento membrana che svolge molteplici ruoli cellulari cruciali, tra cui il traffico di recettori smistamento enzima lisosomiale e il riciclaggio di membrana plasmatica (PM) recettori 1,2. Endosomi sono divisi in tre diversi comparti, vale a dire. gli endosomi precoci (EE), alla fine degli endosomi (LE) e le endosomi di riciclo. Questa classificazione si basa sul tempo impiegato materiale endocitosi raggiungerli, sulle proteine ​​marker specifiche e sulla loro morfologia. Membrane, ovvero proteine ​​e lipidi bistrati, interiorizzate dal PM possono sia essere consegnati ai lisosomi via endosomi per la degradazione o essere riciclati. Le membrane sono trasportati endosomi dal Golgi e similmente, sia continuare ad lisosomi o essere recuperate indietro ai Golgi. Inoltre, le proteine ​​possono essere filtrate in vescicole luminali erba verso l&#39;interno dalla membrana endosomal limitante, un processo che porta alla formazione diuna sottocategoria di LE, i corpi multivescicolari. Il sistema endosomal lievito è relativamente meno complessa di quella delle cellule eucariotiche superiori. Endosomi lievito sono suddivisi in EE e LE. In contrasto con cellule di mammifero non contengono endosomi di riciclo ma anche organelli lisosomi legati tessuto-specifici. Di conseguenza, essi hanno una rete meno complessa di endosomal rotte del narcotraffico 3,4. Pertanto lievito ha rappresentato e rappresenta un sistema sperimentale vantaggiosa per studiare alcuni dei principi traffico membrana sottostante nel sistema endosomal. Questo vantaggio è accentuato dal fatto che numerosi geni coinvolti nelle vie endosomali sono stati inizialmente isolato con schermi genetici nel lievito 5. Mentre il sistema endosomiale lievito wild type e cellule mutanti è stata ampiamente studiata utilizzando approcci biochimici e di microscopia a fluorescenza, la sua indagine a livello ultrastrutturale è stato solominima. Analisi morfologiche sono particolarmente rilevanti nel lievito perché la maggior parte degli organelli endosomiali vengono rilevati come strutture puntuate mediante microscopia a fluorescenza, che rendono difficile la loro identificazione univoca 6. Purtroppo solo un numero limitato di antisieri riconoscere proteine ​​marker lievito endosomali sta lavorando in immuno-microscopia elettronica (IEM) preparazioni 7-10. Per alcune proteine, questo problema è stato aggirato dalla codifica endogeno del gene di interesse e l&#39;impiego di un anticorpo che riconosce il tag di rilevarla 7,11,12. Spesso, tuttavia, le proteine ​​sono rilevabili da IEM causa dei loro livelli di espressione bassi. La loro sovraespressione non è una soluzione, perché questo approccio può indurre mis-localizzazioni e / o alterazioni nei organelli morfologia / funzioni. Così l&#39;etichettatura dei compartimenti endocitici con una sonda rilevabile mediante microscopia elettronica EM è un&#39;opzione efficace. Questa è una soluzione ottimale soprattutto se il prOBE sta entrando nel percorso endocitosi in modo dipendente dal tempo, che permette di conoscere quando segnerà un organello specifico 6. L&#39;assorbimento di nanogold carica positiva da sferoplasti lievito (vale a dire. Lievito in cui la parete cellulare è stato rimosso enzimaticamente) è stato utilizzato con successo per identificare la endosomiale lievito scomparti 10. Queste particelle si legano fortemente ai lipidi carichi negativamente che compongono le membrane biologiche. Così i soci nanogold cariche positivamente con il PM, penetra nella cellula per endocitosi e passa attraverso l&#39;EE e LE prima di raggiungere il vacuolo. Queste piccole particelle d&#39;oro, tuttavia, non hanno dimensioni adeguate per essere visto da EM. Per renderle visibili, le loro dimensioni possono essere allargata mediante reazioni chimiche che portano alla deposizione di argento o oro intorno alla sonda oro 13-15. Abbiamo sviluppato e applicato con successo un approccio IEM basato sul metodo Tokuyasu effettuare subcellularelocalizzazione studia 8,16. Questo metodo consente di eseguire etichettatura immunogold su preparazioni di lievito con una risoluzione eccellente della morfologia 8,17-24. Abbiamo anche stabilito una procedura che combina questo protocollo IEM con l&#39;etichettatura nanogold del sistema lievito endosomale compartimenti 6. Usando questo approccio abbiamo morfologicamente caratterizzato diverse sottoclassi di endosomi e ultrastrutturalmente esaminato mutanti con un traffico endosomiale difetto 6,25. Inoltre, abbiamo dimostrato che questa etichettatura nanogold può essere combinato con etichettature immunogold fornendo la possibilità di esplorare la distribuzione di una proteina di interesse sulle diverse sottopopolazioni endosomi. Qui vi presentiamo come è praticamente eseguito l&#39;etichettatura del sistema lievito endosomiale con nanogold carica positiva.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="754">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">PIPES (piperazin-1,4-bis (2-ethansulfensaure)</td>
			<td style="width:188px;">Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:119px;">1,102,200,250</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">HEPES</td>
			<td style="width:188px;">Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:119px;">391,340</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">EGTA</td>
			<td style="width:188px;">Sigma, St louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">E4378</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:280px;">MgCl2.6H2O</td>
			<td style="width:188px;">Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:119px;">1,058,330,250</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">DL-Dithiothreitol</td>
			<td style="width:188px;">Sigma, St louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">D0632</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sorbitol</td>
			<td style="width:188px;">Sigma, St louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">S1876</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Positively charged Nanogold</td>
			<td style="width:188px;">Nanoprobes, Yaphank, NY</td>
			<td style="width:119px;">2022</td>
			<td style="width:167px;">store at -20 &#778;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">HQ-silver&#8482; enhancement kit</td>
			<td style="width:188px;">Nanoprobes, Yaphank, NY</td>
			<td style="width:119px;">2012</td>
			<td style="width:167px;">store at -20 &#778;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:280px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:188px;">Sigma, St louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">441244</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:280px;">Glutaraldehyde 8% EM grade</td>
			<td style="width:188px;">Polyscience, Inc. , Warrington, PA</td>
			<td style="width:119px;">216</td>
			<td style="width:167px;">store at 4 &#778;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:280px;">Lytic enzyme</td>
			<td style="width:188px;">MP Biomedicals, Santa Ana, CA</td>
			<td style="width:119px;">153526</td>
			<td style="width:167px;">store at 4 &#778;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:280px;">Parafilm M</td>
			<td style="width:188px;">Sigma, St louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">P7793</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">50 meshes nickel grids&#160;</td>
			<td style="width:188px;">Agar Scientific, Stansted, United Kingdom</td>
			<td style="width:119px;">G209N</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;">Cryo-immuno diamond knife 35 &#186;</td>
			<td style="width:188px;">Diatome AG, Biel, Switzerland</td>
			<td style="width:119px;">N.A.</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">UCT ultramicrotome&#160;</td>
			<td style="width:188px;">Leica, Solms, Germany</td>
			<td style="width:119px;">N.A.</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;">Formvar 15/95 resine</td>
			<td style="width:188px;">Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA</td>
			<td style="width:119px;">15800</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">50 meshes nickel grids&#160;</td>
			<td style="width:188px;">Agar Scientific, Stansted, United Kingdom</td>
			<td style="width:119px;">AGG2050N</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Parafilm</td>
			<td style="width:188px;">Sigma, St louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">P7793</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Grids storage box</td>
			<td style="width:188px;">Leica, Solms, Germany</td>
			<td style="width:119px;">162-50</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Falcon 100mmx15mm petri dishe&#160;</td>
			<td style="width:188px;">Corning, Corning, NY</td>
			<td style="width:119px;">351029</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Pasteur capillary pipettes 150 mm</td>
			<td style="width:188px;">Van Bruggen Glas, Rotterdam, The Netherlands</td>
			<td style="width:119px;">10216234</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">1.5 ml microcentrifuge&#160;</td>
			<td style="width:188px;">Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:119px;">72690001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">50 ml tube</td>
			<td style="width:188px;">Bio-one, Alphen aan den Rijn, The Netherlands</td>
			<td style="width:119px;">210296</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Benchkote surface protector</td>
			<td style="width:188px;">Whatman, Maidstone, United Kingdom&#160;</td>
			<td style="width:119px;">1159201</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanogold labeling of the yeast endosomal system for ultrastructural analyses

Endosomi sono uno dei principali membrana ordinamento posti di blocco nelle cellule eucariotiche e regolano il riciclaggio o la distruzione delle proteine ​​per lo più dalla membrana plasmatica e il Golgi. Di conseguenza il sistema endosomal svolge un ruolo centrale nel mantenimento dell&#39;omeostasi cellulare, e mutazioni in geni appartenenti a questa rete di organelli interconnessi da trasporto vescicolare, causano gravi patologie tra cui il cancro e disturbi neurobiologici. E &#39;quindi di primaria importanza per comprendere i meccanismi alla base della biogenesi e l&#39;organizzazione del sistema endosomal. Il lievito Saccharomyces cerevisiae è stato fondamentale in questo compito. Per etichettare e analizzare a livello ultrastrutturale sistema endosomal di questo organismo modello specifico, presentiamo qui un protocollo dettagliato per la nanogold assorbimento carica positiva da sferoplasti seguite dalla visualizzazione di queste particelle attraverso una reazione valorizzazione argento. Questo metodo è anche un prezioso troppol per l&#39;esame morfologico di mutanti con difetti nel traffico endosomal. Inoltre, non è solo applicabile per esami ultrastrutturali ma può anche essere combinato con etichettature immunogold delle indagini localizzazione della proteina.

Secondo il protocollo presentato, la morfologia del sistema lievito endosome può essere accesso da EM trasmissione. Figura 1 mostra diversi tipi di compartimenti endosomiali che sono stati raggiunti e quindi etichettati con nanogold. Il nanogold-argento avanzato può essere chiaramente visto come elettroni particelle dense. Le impostazioni ottimali stabiliti per la reazione valorizzazione argento permette avente particelle di oro in una gamma omogenea dimensioni tra 5 e 15 nm, che non interferisce con l&#39;ultrastruttura della cellula di lievito. Membrana plasmatica così come compartimenti endosomiali primi sono accessibili al nanogold dopo 5 min di incubazione a 24 ° C (Figura 1A), mentre LE, nei casi presentati corpi multivescicolari, sono raggiungibili da queste particelle dopo almeno 30 minuti di assorbimento (Figura 1B). Il potere di risoluzione di combinare la nostra procedura IEM 8 con il protocollo valorizzazione nanogold / argento qui descritta è ONUderlined dalla conservazione e qualità della morfologia degli organelli mostrate, in particolare le vescicole interno degli organismi multivesicular (Figura 1B). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51752/51752fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Analisi ultrastrutturale di nanogold marcato compartimenti lievito endosomali. Sferoplasti sono stati ottenuti dal ceppo SEY6210 wild type (MATalpha URA3-52 LEU2-3, 112 his3-Δ200 TRP1-Δ901 lys2-801 SUC2-Δ9 mel GAL), come descritto nel protocollo presentato. Sferoplasti sono state poi incubate con 4 nmol di nanogold carico positivamente a 4 ° C per 15 minuti prima di essere trasferito a temperatura ambiente per 10 (pannello A) o 30 min (pannello B). Le cellule sono state successivamente fissati, preparate per criosezionamento 8 prima di effettuare la reazione valorizzazione argento sul preparato come descrittonel protocollo presentato. A. compartimenti precoce del sistema lievito endosomal. Oltre alla membrana plasmatica, una breve assorbimento del nanogold (5 min) permette l&#39;etichettatura di vescicole singole (frecce), vescicole eventualmente endocitosi e di strutture tubolari (freccia), molto probabilmente endosomi precoci. B. Il lievito ultrastruttura corpo multivesicular. A 30 min di incubazione conduce l&#39;etichettatura di LE / corpi multivescicolari (asterischi), ma anche endosomi precoci e in vacuoli parte (non mostrato). M, mitocondri; N, nucleo; PM, membrana plasmatica; V, vacuolo. Bar = 200 nm.

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Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses

Lievito di birra, Saccharomyces cerevisiae, è stata un organismo modello chiave per identificare e studiare geni che regolano la biogenesi e le funzioni del sistema endosomal. Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato per l&#39;etichettatura specifico dei comparti endosomiali per gli studi ultrastrutturali.

Nanogold Etichettatura del Sistema lievito endosomiale per le analisi ultrastrutturali

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the ...

nanogold-labeling-yeast-endosomal-system-for-ultrastructural

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

10.2K Views.  University Medical Center Utrecht.  Lievito di birra, Saccharomyces cerevisiae, è stata un organismo modello chiave per identificare e studiare geni che regolano la biogenesi e le funzioni del sistema endosomal. Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato per l'etichettatura specifico dei comparti endosomiali per gli studi ultrastrutturali. 

Video: Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses

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Progranulin (PGRN), also known as granulin epithelin precursor (GEP), is a 593-amino-acid autocrine growth factor. PGRN is known to play a critical role ...

The Green Monster Process for the Generation of Yeast Strains Carrying Multiple Gene Deletions

Phenotypes for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a particular genetic background or environmental condition1,2. There are examples where many genes need to be deleted to unmask hidden gene functions3,4. Despite the potential for important discoveries, genetic interactions involving three or more genes are largely unexplored. Exhaustive searches of multi-mutant interactions would be impractical due to the sheer number of possible combinations of deletions. However, studies of selected sets of genes, such as sets of paralogs with a greater a priori chance of sharing a common function, would be informative.
In the yeast Saccharomyces cerevisiae, gene knockout is accomplished by replacing a gene with a selectable marker via homologous recombination. Because the number of markers is limited, methods have been developed for removing and reusing the same marker5,6,7,8,9,10. However, sequentially engineering multiple mutations using these methods is time-consuming because the time required scales linearly with the number of deletions to be generated.
Here we describe the Green Monster method for routinely engineering multiple deletions in yeast11. In this method, a green fluorescent protein (GFP) reporter integrated into deletions is used to quantitatively label strains according to the number of deletions contained in each strain (Figure 1). Repeated rounds of assortment of GFP-marked deletions via yeast mating and meiosis coupled with flow-cytometric enrichment of strains carrying more of these deletions lead to the accumulation of deletions in strains (Figure 2). Performing multiple processes in parallel, with each process incorporating one or more deletions per round, reduces the time required for strain construction.
The first step is to prepare haploid single-mutants termed 'ProMonsters,' each of which carries a GFP reporter in a deleted locus and one of the 'toolkit' loci&#x2014;either Green Monster GMToolkit-a or GMToolkit-&alpha; at the can1&Delta; locus (Figure 3). Using strains from the yeast deletion collection12, GFP-marked deletions can be conveniently generated by replacing the common KanMX4 cassette existing in these strains with a universal GFP-URA3 fragment. Each GMToolkit contains: either the a- or &alpha;-mating-type-specific haploid selection marker1 and exactly one of the two markers that, when both GMToolkits are present, collectively allow for selection of diploids.
The second step is to carry out the sexual cycling through which deletion loci can be combined within a single cell by the random assortment and/or meiotic recombination that accompanies each cycle of mating and sporulation.

The Green Monster method enables the rapid assembly of multiple deletions marked with a reporter gene encoding green fluorescent protein. This method is based on driving yeast strains through repeated cycles of sexual assortment of deletions and fluorescence-based enrichment of cells carrying more deletions.

Il processo di Green Monster per la generazione di ceppi di lieviti trasporto gene delezioni multiple

Phenotypes  for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a  particular genetic background or environmental condition1,2. ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

Germogliamento lievito proteine ​​estrazione e purificazione per lo Studio della funzione, interazioni e modificazioni post-traduzionali

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

Le domande di pHluorin per quantitativa, Cinetica e high-throughput analisi di endocitosi in germogliamento lievito

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize macromolecular complexes at very high resolution. However, to get as close as possible to the native state, perfect sample preservation is required. Conventional electron microscopy (EM) fixation with aldehydes, for instance, does not provide good ultrastructural preservation. The slow penetration of fixatives induces cell reorganization and loss of various cell components. Therefore, conventional EM fixation does not allow for an instantaneous stabilization and preservation of structures and antigenicity. The best choice for examining intracellular events is to use cryofixation followed by the freeze-substitution fixation method that keeps cells in their native state. High-pressure freezing/freeze-substitution, which preserves the integrity of cellular ultrastructure, is the most commonly used method, but requires expensive equipment. Here, an easy-to-use and low-cost freeze fixation method followed by freeze-substitution for suspension cell cultures is presented.

This manuscript describes an easy-to-use and low-cost cryofixation method for visualizing suspension cells by transmission electron microscopy.

Plunge congelamento: uno strumento per l&#39;ultrastrutturali e Immunolocalizzazione Studi di cellule in sospensione in microscopia elettronica a trasmissione

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

Protocollo di laboratorio per analisi genetiche del contenuto dell'intestino del rDNA acquatica macroinvertebrati Using Group-specific Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

Nanogold Etichettatura del Sistema lievito endosomiale per le analisi ultrastrutturali

Riepilogo

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Modificato lievito-sistema del doppio ibrido per identificare proteine che interagiscono con il fattore di crescita progranulina

Il processo di Green Monster per la generazione di ceppi di lieviti trasporto gene delezioni multiple

Germogliamento lievito proteine estrazione e purificazione per lo Studio della funzione, interazioni e modificazioni post-traduzionali

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