Name: a simple behavioral assay for testing visual function in xenopus laevis
Uploaded: 2014-06-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis at JoVE.com

Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni dal National Institutes of Health: EY015748, EY017964 (MEZ), e EY019517 (ASV). Questo lavoro è stato supportato anche dalla ricerca per la prevenzione cecità illimitato Sovvenzione al reparto di Oculistica ed i Lions di Central New York. Vorremmo anche ringraziare il nostro tecnico animali, Matteo Mellini, per la sua eccellente cura degli animali e intervenendo per recitare in questo video.

Animal Care Il Xenopus laevis girini utilizzati in questo studio sono stati coltivati, allevati e trattati secondo le procedure approvate dal Upstate Medical University IACUC e la Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio. 1. Impostazione Pre-comportamento: Girini <ol><li> Ottenere fecondati embrioni di Xenopus da una sorgente disponibile in commercio o in vitro fecondare ovociti, come descritto in precedenza 6. </li><li> Posizionare blastula a neurali embrioni stadio piastra a 18 ˚ C in 60 millimetri piastre Petri contenenti 0,1 X. MMR [10 X Marc Modificato soluzione (MMR) stock Ringer (10 mM MgCl 2, 20 mM KCl, 20 mM CaCl 2; 50 HEPES mM; 1 M NaCl, regolata a pH 7,5, autoclavato e conservati a RT)] con 50 ug / ml di gentamicina antibiotico. Cambiare 0,1 X. MMR ogni giorno e rimuovere eventuali embrioni morti. </li><li> Una volta che gli embrioni raggiungono Nieuwkoop e Faber fase ~ 27-30 Luglio, passare the embrioni in 0,1 X. MMR senza antibiotico per permettere la crescita batterica intestinale. </li><li> Crescere i girini fino a raggiungere lo stadio di alimentazione (fase 45) e spostarli in 100 millimetri piastre di Petri riempite con 0,1 X. MMR. Alimentarli ortica surnatante polvere ogni altro giorno per una settimana, cambiando il 0,1 X. MMR il giorno intermedio. </li><li> Dopo una settimana in piatto 100 millimetri Petri, spostare gli animali per mezzo gallone vasche piene d&#39;acqua rana [0.5 g / L oceano immediata e 2 mM sodio fosfato bibasico (Na 2 HPO 4: mw 141,96) pH 6,8]. Dar loro da mangiare come al punto 2.4, ma cambiare l&#39;acqua solo 2-3 volte a settimana quando l&#39;acqua è torbida. Mantenere gli animali in una 12 ore light/12 ciclo di luce buio con le luci accendere alle 06:00. </li><li> Posizionare il serbatoio mezzo gallone con i soggetti del test su una superficie bianca, come un underpad banco di laboratorio, almeno 12 ore O / N, prima del test. </li><li> Girini di prova nelle fasi 45-50 come descritto nel passaggio 3 di seguito. </li></ol> . 2 Setup Pre-comportamento: Equipment <ol><li> Mettere da parte una zona del laboratorio per il saggio comportamento. Dovrebbe essere in una tranquilla zona a traffico limitato con l&#39;illuminazione fluorescente standard. </li><li> Preparare le vasche di prova per gli animali. I nidificate, serbatoi di test mezzo gallone sono composti da due parti: un serbatoio interno che conterrà l&#39;acqua e girini; e un serbatoio esterno con stimolo visivo. <ol><li> Per il serbatoio interno, fare un piccolo segno sugli angoli esterni con un pennarello, 5 cm dal fondo; questa è la linea di galleggiamento (Figura 1A, linea tratteggiata verde). </li><li> Inoltre, per il serbatoio interno, riempire le divets nel serbatoio (agli angoli e al centro) con un composto inerte, come Sylgard elastomero. NOTA: I girini si soffermerà in queste aree se non vengono riempiti dentro </li><li> Per il serbatoio esterno, coprire esattamente la metà della parte esterna di un serbatoio con nastro isolante nero e l&#39;altra metà con il bianco fazzoletto di carta Figura 1B. </li></ol></li><li> Posizionare i carri armati sulinoculando giradischi. </li><li> Setup la webcam / treppiede in modo che sia sopra le vasche di prova. Regolare la telecamera per permettere la visualizzazione della zona test, come mostrato nella Figura 1C. </li><li> Collegare la webcam di un computer con software QuickTime Player installato 5. Accendere la fotocamera. In QuickTime Player, in File, selezionare &#39;Nuova registrazione filmato.&#39; Il setup del test comportamento sarà visibile sul computer subito. </li><li> Drappo un panno di cotone leggero su tutta la configurazione di ridurre stimoli esterni che potrebbero influenzare il comportamento girino, nonché, ridurre la luce riflessa sulla superficie dell&#39;acqua. </li><li> Assicurarsi che la luminanza nel quadro delle misure di stoffa tra 35-50 cd / m 2. </li></ol> 3. Assay Comportamento <ol><li> Riempire il serbatoio di test interno al segno cinque centimetri di acqua fatta al passo 1.2.1 con acqua rana. </li><li> Usando una piccola rete, spostare delicatamente l&#39;animale nel serbatoio testing interno. </li><li> Aperto QuickTime software sul computer e, con il serbatoio esterno come una guida, assicurarsi che la fotocamera è in grado di visualizzare e registrare l&#39;area di prova. </li><li> Scrivere il nome dell&#39;animale, la data e l&#39;ora su un pezzo di carta e registrare con la macchina fotografica. </li><li> Posizionare il serbatoio di prova nel serbatoio esterno con il lato nero del serbatoio a destra Figura 2. </li><li> Avviare la registrazione del filmato subito dopo aver sistemato il serbatoio e impostare timer per 2 min. </li><li> Quando i segnali acustici del timer, rimuovere il serbatoio di prova interno, ruotare il serbatoio esterno di 180 ° e posizionare il serbatoio di prova interno all&#39;interno del serbatoio esterno. Avviare il timer. Nota: il lato nero dovrebbe essere sull&#39;altro lato. </li><li> Ripetere passo 3.7, più otto volte per un totale di dieci prove. Utilizzare la figura 2 come una guida, controllando fuori di ogni prova. </li><li> Ripetere l&#39;analisi condotta in due giorni separati. </li></ol> 4. Retinica assotomia <ol><li> Mettere animali a 0,02% tricaine fino a che non rispondonoad un pizzico di coda con un # 3 pinze. </li><li> Sciogliere 1% agarosio in 0,1 X. MMR e quindi aggiungere ad una piastra di Petri 60 millimetri. Una volta raffreddato, fare un piccolo incavo rettangolare in agarosio e aggiungere il girino a incavo con un po &#39;0,02% tricaine, in modo che l&#39;animale è parzialmente immersa nel liquido. </li><li> Ago nella pelle ad un angolo di 45 gradi dietro la regione dorsale dell&#39;occhio con un ago 25 G, mentre il rinforzo animale contro pinza sul lato opposto. </li><li> Facendo attenzione a non tagliare la vena, che si trova accanto al nervo ottico, raggiungono attenzione nel foro con # 5 pinze, tagliare il nervo ottico e capovolgere fuori strada. Se c&#39;è sanguinamento grave a causa accidentalmente snipping l&#39;arteria, quindi posizionare rapidamente l&#39;animale in 2% tricaine di eutanasia. ATTENZIONE: Soluzione tricaine 2% può causare intorpidimento negli esseri umani. Questa soluzione deve essere maneggiato con i guanti. </li><li> Per recuperare l&#39;animale dopo l&#39;intervento chirurgico, collocare animale da 100 mm piastra di Petri con 0,7 X MMR e gentamicina 50 mg / ml per 20 min. Next, trasferimento girino al serbatoio di recupero con acqua rana. Lasciate riposare animale O / N. </li><li> La mattina successiva, testare la funzione visiva come descritto sopra (punti 3,1-3,9). </li></ol> 5. Analisi dei risultati <ol><li> Dopo le prove sono finite, misurare la quantità di tempo girino rimane sul lato nero del serbatoio. <ol><li> Visualizzare manualmente i video utilizzando un software che visualizza l&#39;ora e permette frequenti pausa. Guardate il tempo di visualizzazione video. Annotare l&#39;inizio della prova di due minuti, che è quando il recipiente interno nidi successo all&#39;interno della vasca esterna e viene squadrato in vista della telecamera. </li><li> Utilizzare la posizione degli occhi del girino per definire quale lato della vasca gli animali sono il nuoto su. Definire attraversando da un lato del serbatoio all&#39;altro solo quando entrambi gli occhi hanno attraversato il / linea bianca nera. </li></ol></li><li> Annotare l&#39;inizio e la fine di ciascun intervallo (in secondi) che l&#39;animale trascorre sul lato nero. Pausa e riavvolgere il video per garantire la precisione. Il totale del sec all&#39;interno di ogni prova. </li><li> Ingresso questi numeri nel foglio di lavoro Behavior allegato. Il foglio calcola la proporzione di tempo che l&#39;animale ha speso sul lato bianco sottraendo il tempo speso per il lato nero del serbatoio dal totale 120 prova sec e dividere per il tempo totale in sec [(120 - secondi totali spesi il lato nero) / 120 sec]. Le medie del foglio di lavoro questo rapporto su tutte le 10 prove. </li><li> Usa T-test di uno studente, in coppia, distribuzione a due code per determinare se le prove tra le giornate sono significative (P ≤ 0,05). </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Riportiamo qui un semplice test comportamentale visione-guida che può essere facilmente eseguita in meno di una settimana da personale di laboratorio minimamente addestrato. Mentre altri test richiedono attrezzature specializzate e competenze in comportamento animale, questo test permette un rapido test per determinare la funzione visiva. Un altro test comportamentale, il saggio evitare di Visual, è stato sviluppato per determinare come la Tectum contribuisce alla percezione visiva in Xenopus 10. Questo saggio misura sintonizzazione spaziale e sensibilità al contrasto in risposta ad un movimento contro sfondo stabile, e quindi, in grado di misurare il comportamento di visione basato più specializzato del semplice test riportati qui. Un sistema automatizzato comportamento è stato segnalato in grado di misurare la quantità di tempo trascorso su un lato del serbatoio 8. C&#39;è anche un software disponibile in commercio (ad esempio software QUALSIASI-labirinto) che è stato usato per misurare la quantità di tempo zebrafish trascorrere in ambienti scuri o luminosi 9. L&#39;unassay riportiamo qui non richiede l&#39;acquisto di questi tipi di attrezzature costose o software, ma invece si basa su reagenti e apparecchiature di uso quotidiano per misurare la funzione visiva. Il saggio visione guidata viene eseguita su un solo animale per testare la sua funzione visiva. Quando si confrontano i risultati del test comportamentali di girini diversi tra loro, abbiamo osservato alcuna differenza statistica tra animali entro gruppi di trattamento. Abbiamo testato tre girini in sei giorni consecutivi e testato anche altri cinque animali per tre giorni consecutivi, l&#39;esecuzione di dieci prove al giorno. In entrambi i casi, abbiamo riscontrato cambiamenti statisticamente significative tra i gruppi assotomia non trattati o singoli (P = 0,2067), ma ottenuto un cambiamento statisticamente significativo quando questi animali sono stati confrontati con il gruppo doppia assotomia (P = 0,002). Questo è stato misurato utilizzando il software 6.0c Prism esecuzione di un test statistico ANOVA a 2 vie con test di confronto multiplo di un Tukey (n = 8 girini). Per avere il massimoquantità di punti dati prima dell&#39;intervento chirurgico, si consiglia di utilizzare il saggio comportamento di sei giorni. Se devono essere ottenuti più veloce con meno degenerazione del tessuto risultati, si consiglia di utilizzare il sistema di tre giorni. Questo test verifica un animale per volta. Abbiamo eseguito studi pilota per verificare se due girini o più potrebbero essere misurate simultaneamente. Per determinare se avere due girini in un serbatoio influenzata loro preferenza per il lato bianco del serbatoio, abbiamo testato ogni girino separatamente e poi insieme. Dal momento che le immagini sono state scattate sopra il serbatoio, se i girini nuotavano sopra o sotto l&#39;altro per un certo periodo di tempo, abbiamo trovato difficile distinguerli. Se abbiamo usato girini di varie dimensioni, abbiamo osservato che quello più grande inciderebbe in cui il più piccolo nuotato. Le tecnologie del futuro potrebbero essere sviluppati per girini geneticamente marchio, che consentirebbero una migliore tracciabilità dei più animali della stessa dimensione. In esecuzione di questo test su decine di tadpoles, abbiamo osservato che alcuni girini hanno preferito il lato bianco più coerente rispetto ad altri. Girini, il cui comportamento varia di oltre il 10% in due giorni consecutivi, prenderemmo stati testati nuovamente su un terzo giorno prima dell&#39;intervento. Questo può essere stato a causa di un&#39;altra osservazione: abbiamo notato che mettendo gli animali su uno sfondo bianco anche fatto la differenza nella loro preferenza per il lato bianco del serbatoio. Avere quel giorno in più può aver contribuito a condizionare alcuni girini a preferire il lato bianco del serbatoio. Una limitazione di questo saggio è che esso verifica solo funzione visiva. La variabilità abbiamo osservato potrebbe essere dovuto ad altri difetti di sviluppo, oltre a una ridotta funzionalità visiva o cecità. Per questo motivo, gli animali che mostravano meno del 60% preferenza prima dell&#39;intervento non sono stati testati ulteriormente. Abbiamo anche testato una vasta gamma di età compresa tra i girini pre-metamorfiche. Abbiamo scoperto che i girini più giovani di fase a 45 erano molto piccole ei loro occhi erano difficili da individuare utilizzando il nostro noiBCAM. Girini Anziani (palchi 51-55 +) erano più distratto; anche se in ultima analisi, trascorso più tempo sul lato bianco del serbatoio, sembrano richiedere più tempo per nuotare. Questi animali più vecchi erano più grandi, e quindi più facile da monitorare, ma necessari test prima dell&#39;intervento come indicato sopra. Al contrario, la maggior parte dei girini nella fase 45 fino a 50 comportava come previsto e animali di queste età sarebbe meglio utilizzare in studi futuri. Cambiamenti di luce circadiani hanno dimostrato di influenzare le risposte comportamentali visione guidata in Xenopus 2. Coerentemente con questa osservazione, abbiamo notato che lo stesso animale che nuotava rapidamente verso il lato bianco del serbatoio di prova in prove condotte in mattinata, ha preso molto più tempo durante le prove di comportamento pomeriggio. Dopo aver condotto una serie di prove «stessi animali / tempo diverso &#39;, abbiamo determinato il momento migliore per il saggio comportamento era 06:00-13:00. Abbiamo usato anche un Handh digitaleeld videocamera collegata da firewire per testare animali in condizioni di scarsa illuminazione 5. Questo ha permesso la sperimentazione di visione notturna o scotopica, in cui l&#39;animale utilizza i bastoncelli vedere. Condizioni sono stati modificati semplicemente trovando la minor quantità di luce necessaria per l&#39;animale per eseguire il test di visione guidata. Il saggio qui presentato test di visione fotopica, in cui l&#39;animale utilizza principalmente suoi fotorecettori cono di vedere. Combinando questi approcci, entrambi i tipi di visione scotopica e fotopica, possono essere testati. Abbiamo usato questo test per testare la funzione visiva degli animali con un occhio ectopica cresciuto da cellule pluripotenti che iperesprimono i fattori di eye campo di trascrizione intrinsecamente espresse e il fattore estrinseco, Noggin. Occhi generati da questi tessuti erano funzionali 4,11. Noggin gioca anche un ruolo nella anterior sviluppo del sistema nervoso centrale 12 ma da questo test visione guidata in combinazione con tr tappo animaletest ansplant, il suo ruolo nello sviluppo dell&#39;occhio è stato scoperto. Altri fattori estrinseci che influenzano la formazione dell&#39;embrione precoce, ma non hanno ancora dimostrato di avere un ruolo nello sviluppo dell&#39;occhio può indotto la formazione di cellule progenitrici della retina in cellule pluripotenti protezione degli animali 4,11. Da questo test comportamentale, studi futuri potrebbero determinare la funzione visiva di questi occhi appena generati.

Xenopus laevis sono stati utilizzati come organismo modello per studiare la formazione dell&#39;occhio. Gli occhi si sviluppano rapidamente, crescita verso la maturità in meno di una settimana per i geni di prova o percorsi che hanno un effetto sullo sviluppo visivo e la funzione. Per testare funzione visiva, la risposta optocinetico e optomotor è stato usato in zebrafish e girini Xenopus rispettivamente 1,2. Perché gli occhi dei girini di Xenopus sono relativamente più piccolo di zebrafish, questo test richiede l&#39;uso di attrezzature specializzate e personale addestrato per rilevare la coda-flip e movimenti oculari comportamento sottile in Xenopus. Un comportamento più robusto in Xenopus è la preferenza per il nuoto in un serbatoio con uno sfondo bianco, che viene qui descritto 3. Quando si posiziona un girino in mezzo serbatoio nero / mezzo bianco, il girino pre-metamorfica nuota rapidamente al lato bianco del serbatoio. Abbiamo già usato questo test per determinare se pluripotenti cellule derivategli occhi erano funzionali 4. Qui riportiamo una versione dettagliata di questo saggio, che può essere utilizzato per testare la funzione visiva di premetamorphic girini Xenopus. Questo test è più semplice del saggio risposta optomotor, dal momento che richiede solo una videocamera montata digitale, software fotocamera digitale e dotazione standard trovata nella maggior parte dei laboratori di Xenopus. Inoltre, la risposta registrata richiede alcuna formazione specifica ai risultati ottenuti. I nostri risultati rappresentativi mostrano che lo stesso gruppo di girini, che hanno subito doppio assotomia retinica, nuotano attorno al serbatoio. Abbiamo anche incluso i risultati del test comportamento di un girino rappresentante, mostrando come un occhio può essere testato per la risposta visiva. Un foglio di lavoro è stato incluso in modo che i numeri acquisiti durante il dosaggio possono essere inseriti e analizzati. Questo foglio può essere utilizzato per determinare se i girini testati hanno una risposta visiva.

<table><tbody><tr><td>1/2 Gallon Flex-Tank with Cover</td><td>eNasco</td><td>SB19271M</td><td>Size: 5-3/8&quot; x 7&quot; x 3-3/4&quot;</td></tr><tr><td>Black electrical tape</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>White tissue paper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Large inoculating turntable</td><td>VWR</td><td>50809-022</td><td>Size: Dia 114.3 x&amp;nbsp; H 76.2 mm (4 1/2&amp;nbsp; x&amp;nbsp; 3&quot;)</td></tr><tr><td>Durasorb underpad</td><td>VWR</td><td>82004-836</td><td>Size: 43.2 x 60.1 cm (17 x 24&quot;)</td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>1945-34155-CS</td><td></td></tr><tr><td>Standard tripod</td><td></td><td>Various</td><td></td></tr><tr><td>iSight camera or webcam</td><td>Apple</td><td>M8817LL/A</td><td>Good for larger tadpoles but small ones are difficult to see</td></tr><tr><td>Portable computer</td><td>Apple/PC</td><td>Various</td><td>We used a 13&quot; MacBook, 2 GHz Intel Core 2 Duo running MacOSX Lion 10.7.5</td></tr><tr><td>MiniDV handycam camcorder</td><td>SONY</td><td>DCR-HC42</td><td>Connected by firewire to the computer with a 6-conductor and 4-conductor alpha FireWire 400&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Handycam station</td><td>SONY</td><td>DCRA-C121</td><td>This can be used for connecting firewire to camera</td></tr><tr><td>QuickTime Player software</td><td>Quicktime</td><td>Version 10.1</td><td></td></tr><tr><td>26 G Needle (5/8&quot; length)</td><td>VWR</td><td>BD305115</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disposables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin sulfate [50 mg/ml]</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-528Z</td><td>Stored at RT</td></tr><tr><td>Sylgard 184 silicone elastomer</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9644388</td><td></td></tr><tr><td>Instant ocean</td><td>Doctors Foster and Smith</td><td>CD-116528</td><td>Stock solution = 100 g/L stored at RT</td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0876</td><td>Stock solution = 0.4 M stored at RT</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;In vitro&lt;/em&gt; fertilized embryos</td><td>eNasco</td><td>LM00490MX</td><td>100 embryos/unit</td></tr></tbody></table>

a simple behavioral assay for testing visual function in xenopus laevis

Misurazione della funzione visiva nei girini di rana, Xenopus laevis, consente lo screening per la cecità di animali vivi. La risposta optocinetico è una visione-based, un comportamento riflessivo che è stato osservato in tutti i vertebrati esaminati. Occhi girino sono piccole quindi la risposta vibrazione coda è stato usato come misura alternativa, che richiede un tecnico addestrato per registrare la risposta sottile. Abbiamo sviluppato un saggio comportamento alternativo basato sul fatto che girini preferiscono nuotare sul lato bianco di un serbatoio quando posto in una vasca con lati sia in bianco e nero. Il saggio qui presentato è un poco costoso, semplice alternativa che crea una risposta che può essere facilmente misurata. L&#39;installazione consiste in un cavalletto, webcam e serbatoi di prova nidificati, facilmente reperibili nella maggior parte dei laboratori di Xenopus. Questo articolo include un filmato che mostra il comportamento dei girini, prima e dopo aver tagliato il nervo ottico. Al fine di testare la funzione di un occhio, includiamo anche rappresentantirisultati rappresentative di un girino in cui ogni occhio ha subito assotomia retinica in giorni consecutivi. Studi futuri potrebbero sviluppare una versione automatizzata di questo test per verificare la visione di molti girini in una volta.

I rapporti precedenti hanno dimostrato che premetamorphic girini Xenopus preferiscono nuotare sul lato bianco di un / serbatoio bianco e nero chiamato questo test, sullo sfondo Preferenza colore Assay 3 Abbiamo modificato questo test per testare la funzione visiva di entrambi gli occhi di girini in meno di una settimana. In questo modo, i loro occhi possono essere raccolti per l&#39;esame istologico. Mostriamo qui come la risposta è dovuta a stimoli visivi. In Movie 1, i girini nei pannelli sinistro e destro sono gli stessi animali. Sulla sinistra sono gli animali prima della chirurgia e sulla destra, gli animali dopo aver tagliato entrambi i nervi ottici. Abbiamo roteato l&#39;acqua per dimostrare che nulla viene aggiunto a respingere gli animali dal lato nero o attirarli verso il lato bianco. Nel film, forniamo una schematica dei girini negli angoli inferiori, che mostra lo stato del nervo ottico per ogni gruppo di animali. In Movie 1, il normale, ugirini n-operati rispondono al colore di sfondo in meno di 30 secondi in vasca prova, mentre i girini ciechi nuotare senza meta attorno al serbatoio. La velocità dei film è stata aumentata e il tempo effettivo registrato nell&#39;angolo superiore destro. Per testare la visione di un occhio, abbiamo incluso i risultati di un animale il cui nervo ottico è reciso in un occhio e testato nel nostro test. Il nervo ottico nell&#39;altro occhio è stato reciso, dopo due giorni di test, e il comportamento di visione guidata testato nei giorni seguenti di nuovo. In Figura 3, un grafico mostra la quantità di tempo che il girino scelto di nuotare sul lato nero del serbatoio. Questo è stato determinato per sei giorni consecutivi Figura 3A. Come descritto sopra, il nervo ottico è stato reciso destra dopo comportamento è stato testato su giorno 2 e sinistra, dopo prova di comportamento al giorno 4. L&#39;girino preferito il lato bianco del serbatoio in modo casuale al 50% della Figura 3C tempo. Si noti che l&#39;unaimal trascorso più tempo sul lato bianco del serbatoio durante gli ultimi 6 prove nei giorni da 1 a 4. La quantità di tempo speso per il lato nero era più anche nei giorni 5 e 6, quando l&#39;animale era cieco da entrambi gli occhi. I risultati di ciascuno dei due giorni sono stati mediati insieme e presentati in forma grafica Figura 3C. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51726/51726fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Set-up sperimentale della visione guidata test comportamento. (A) Il serbatoio di prova interno rimane trasparente ed è contrassegnato per indicare i livelli di acqua (linee verdi in un angolo tratteggiato). (B) Il serbatoio di prova esterno è rivestito in nero nastro elettrico su una metà e tessuto carta bianca dall&#39;altro. (C) I girini vengono visualizzati utilizzando una webcam posta su un treppiede e collegato a un computer portatile. Il serbatoio tests riposo su un giradischi inoculazione per consentire un facile svolta tra prove. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51726/51726fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51726/51726fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. Schema di come viene eseguito il test comportamento visione-guida. I rettangoli rappresentano il serbatoio di prova, mostrando come il semestre bianco / mezzo cambiamenti zona nera con ogni prova. Questo può essere usato durante il saggio comportamento per contrassegnare il numero di prova. Il serbatoio di prova sulla destra è un primo piano del girino e il suo comportamento previsto durante i due minuti dosaggio. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51726/51726fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> hin-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51726/51726fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. Un esperimento rappresentativo conteggio la percentuale di tempo nuotavano girino sul lato bianco del serbatoio di prova. (A) La quantità di sec girino trascorso sul lato nero del serbatoio è misurata e posizionato in una tabella. (B ) La tabella A viene convertito nella percentuale di tempo trascorso del lato bianco del serbatoio. Questo viene fatto sottraendo il sec trascorso sul lato nero dal tempo di prova totale (120 sec) e dividendo per 120 sec. Girini che sono stati trattati (U), ha avuto un unico assotomia (SA) e poi un doppio assotomia (DA) sono stati testati. (C) Il grafico rappresenta la percentuale media di tempo trascorso nel lato bianco (barra bianca) e lato nero ( barra nera). Di seguito si riporta la tabella utilizzata per fare il grafico.g3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Movie 1. Risposta comportamentale degli animali vedenti e non vedenti sullo sfondo bianco preferenza saggio. Girini nei pannelli destra e sinistra sono la stessa cosa, ma quelli a destra sono stati sottoposti a doppia assotomia retina. Uno schema negli angoli in basso indica se il nervo ottico è integro o tagliato (barra blu). Il timer in alto a destra indica il tempo. Il film è accelerato per facilitare la visione. Una volta nell&#39;area bianca, notate come i girini nuotano vicino al confine tra la direzione bianco e il nero e retromarcia. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51726/51726_Viczian_Movie1.mov" target="_blank">Cliccate qui per vedere il video.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="616"><tbody><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:88px;"></td><td style="width:88px;"> Day 1 </td><td style="width:88px;"> Day 2 </td><td style="width:88px;"> Day 3 </td><td style="width:88px;"> Giorno 4 </td><td style="width:88px;"> Day 5 </td><td style="width:88px;"> Giorno 6 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> Prova 1 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Trial 2 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Trial 3 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Trial 4 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Trial 5 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 &lt;/ Td&gt; <td> 0 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Trial 6 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Trial 7 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Trial 8 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Trial 9 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Trial 10 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td colspan="3"> Rapporto tra tempo speso sul lato bianco </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Ratio 1 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Rapporto 2 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Rapporto 3 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Ratio 4 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Rapporto 5 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Rapporto di 6 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Rapporto 7 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Rapporto 8 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Rapporto 9 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> Rapporto 10 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td></tr><tr height="25"><td height="25" style="height:25px;"> Media </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td> &lt;td&gt; 1.00 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"></td><td> Giorno 1 </td><td> Day 2 </td><td> Day 3 </td><td> Giorno 4 </td><td> Day 5 </td><td> Giorno 6 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> Prova 1 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 69 </td><td> 69 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Trial 2 </td><td> 0 </td><td> 3 </td><td> 0 </td><td> 88 </td><td> 68 </td><td> 58 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Trial 3 </td><td> 7 </td><td> 0 </td><td> 28 </td><td> 0 </td><td> 58 </td><td> 47 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Trial 4 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 11 </td><td> 0 </td><td> 59 </td><td> 72 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Trial 5 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 7 </td><td> 22 </td><td> 57 </td><td> 57 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Trial 6 </td><td> 1 </td><td> 98 </td><td> 4 </td><td> 56 </td><td> 69 </td><td> 53 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Trial 7 </td><td> 0 </td><td> 13 </td><td> 33 </td><td> 24 </td><td> 44 </td><td> 57 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Trial 8 </td><td> 0 </td><td> 113 </td><td> 38 </td><td> 24 </td><td> 36 </td><td> 64 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Trial 9 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 4 </td><td> 43 </td><td> 60 </td><td> 57 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Trial 10 </td><td> 1 </td><td> 21 </td><td> 0 </td><td> 32 </td><td> 63 </td><td> 80 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td colspan="2"> Rapporto tra tempo speso sul lato bianco </td<html> &gt; <td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Ratio 1 </td><td> 100% </td><td> 100% </td><td> 100% </td><td> 100% </td><td> 43% </td><td> 43% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Rapporto 2 </td><td> 100% </td><td> 98% </td><td> 100% </td><td> 27% </td><td> 43% </td><td> 52% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Rapporto 3 </td><td> 94% </td><td> 100% </td><td> 77% </td><td> 100% </td><td> 52% </td><td> 61% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Ratio 4 </td><td> 100% </td><td> 100% </td><td> 91% </td><td> 100% </td><td> 51% </td><td> 40% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Rapporto 5 </td><td> 100% </td><td> 100% </td><td> 94% </td><td> 82% </td><td> 53% </td><td> 53% </td></tr><tr height="21">height: 21px; &quot;&gt; Rapporto di 6 </td><td> 99% </td><td> 18% </td><td> 97% </td><td> 53% </td><td> 43% </td><td> 56% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Rapporto 7 </td><td> 100% </td><td> 89% </td><td> 73% </td><td> 80% </td><td> 63% </td><td> 53% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Rapporto 8 </td><td> 100% </td><td> 6% </td><td> 68% </td><td> 80% </td><td> 70% </td><td> 47% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Rapporto 9 </td><td> 100% </td><td> 100% </td><td> 97% </td><td> 64% </td><td> 50% </td><td> 53% </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> Rapporto 10 </td><td> 99% </td><td> 83% </td><td> 100% </td><td> 73% </td><td> 48% </td><td> 33% </td></tr><tr height="24"><td height="24" style="height:24px;"> Media </td><td> 99% </td><td> 79% </td><td> 90% </td><td> 76% </td><td> 51% </td><td> 49% </td></tr></tbody></table> Foglio di lavoro 1. Sfondo bianco preferenza foglio di dosaggio. Questo foglio ha i calcoli costruiti in modo che possa essere utilizzato per immettere numeri e risultati del conteggio.

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A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Xenopus laevis girini preferiscono nuotare sul lato bianco di un / serbatoio bianco nero. Questo comportamento è guidato dalla loro visione. Sulla base di questo comportamento, vi presentiamo un semplice test per testare la funzione visiva dei girini.

Un test comportamentale semplice for Testing Funzione visiva in<em&gt; Xenopus laevis</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

9.8K Views.  Center for Vision Research, SUNY Eye Institute, Upstate Medical University.  Xenopus laevis girini preferiscono nuotare sul lato bianco di un / serbatoio bianco nero. Questo comportamento è guidato dalla loro visione. Sulla base di questo comportamento, vi presentiamo un semplice test per testare la funzione visiva dei girini. 

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Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Test di sensibilità visiva alla velocità e direzione del movimento in lucertole

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Ricerca

Biologia

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

Un test per misurare capacità di risposta comportamentale di Zebrafish a variazioni di intensità di luce

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

VisioTracker, an Innovative Automated Approach to Oculomotor Analysis

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, robust, and simple to manipulate. A suitable model has been found in the optokinetic response (OKR), a reflexive behavior present in all vertebrates due to its high selection value. The OKR involves slow stimulus-following movements of eyes alternated with rapid resetting saccades. The measurement of this behavior is easily carried out in zebrafish larvae, due to its early and stable onset (fully developed after 96 hours post fertilization (hpf)), and benefitting from the thorough knowledge about zebrafish genetics, for decades one of the favored model organisms in this field. Meanwhile the analysis of similar mechanisms in adult fish has gained importance, particularly for pharmacological and toxicological applications.
Here we describe VisioTracker, a fully automated, high-throughput system for quantitative analysis of visual performance. The system is based on research carried out in the group of Prof. Stephan Neuhauss and was re-designed by TSE Systems. It consists of an immobilizing device for small fish monitored by a high-quality video camera equipped with a high-resolution zoom lens. The fish container is surrounded by a drum screen, upon which computer-generated stimulus patterns can be projected. Eye movements are recorded and automatically analyzed by the VisioTracker software package in real time.
Data analysis enables immediate recognition of parameters such as slow and fast phase duration, movement cycle frequency, slow-phase gain, visual acuity, and contrast sensitivity.
Typical results allow for example the rapid identification of visual system mutants that show no apparent alteration in wild type morphology, or the determination of quantitative effects of pharmacological or toxic and mutagenic agents on visual system performance.

The VisioTracker is an automated system for the quantitative analysis of visual performance of larval and small adult fish based on the recording of eye movements. It features full control over visual stimulus properties and real-time analysis, enabling high-throughput research in fields such as visual system development and function, pharmacology, neural circuit studies and sensorimotor integration.

VisioTracker, un approccio innovativo automatizzato di analisi oculomotoria

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, ...

Neuroscienze

The Optokinetic Response as a Quantitative Measure of Visual Acuity in Zebrafish

Zebrafish are a proven model for vision research, however many of the earlier methods generally focused on larval fish or demonstrated a simple response. More recently adult visual behavior in zebrafish has become of interest, but methods to measure specific responses are new coming. To address this gap, we set out to develop a methodology to repeatedly and accurately utilize the optokinetic response (OKR) to measure visual acuity in adult zebrafish. Here we show that the adult zebrafish's visual acuity can be measured, including both binocular and monocular acuities. Because the fish is not harmed during the procedure, the visual acuity can be measured and compared over short or long periods of time. The visual acuity measurements described here can also be done quickly allowing for high throughput and for additional visual procedures if desired. This type of analysis is conducive to drug intervention studies or investigations of disease progression.

Zebrafish have been a valuable tool for many research areas. Here we demonstrate a method to elicit a visual response and calculate a functional visual acuity in the adult zebrafish.

La risposta Optokinetic come una misura quantitativa di acuità visiva in Zebrafish

Zebrafish are a proven model for vision research, however many of the  earlier methods generally focused on larval fish or demonstrated a simple  ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the development of neuronal connectivity. During establishment of the retino-tectal projection, optic axons extend from the eye and navigate through distinct regions of the brain to reach their target tissue, the optic tectum. Once optic axons enter the tectum, they elaborate terminal arbors that function to increase the number of synaptic connections they can make with target interneurons in the tectum. Here, we describe a method to express DNA encoding green fluorescent protein (GFP), and gain- and loss-of-function gene constructs, in optic neurons (retinal ganglion cells) in Xenopus embryos. We explain how to microinject a combined DNA/lipofection reagent into eyebuds of one day old embryos such that exogenous genes are expressed in single or small numbers of optic neurons. By tagging genes with GFP or co-injecting with a GFP plasmid, terminal axonal arbors of individual optic neurons with altered molecular signaling can be imaged directly in brains of intact, living Xenopus tadpoles several days later, and their morphology can be quantified. This protocol allows for determination of cell-autonomous molecular mechanisms that underlie the development of optic axon arborization in vivo.

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

This protocol aims to demonstrate how to microinject a DNA/DOTAP mixture into eyebuds of one day old Xenopus laevis embryos, and how to image and reconstruct individual green fluorescent protein (GFP) expressing optic axonal arbors in tectal midbrains of intact, living Xenopus tadpoles.

Microiniezione di DNA in boccioli di occhiali in embrioni di Xenopus lavis e imaging di GFP Expressing Optic Aboral Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

Biologia dello sviluppo

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

Determinazione del tessuto Utilizzando il trapianto Cap animali (ACT) Assay in Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the surface of the cornea, electrical activity generated in response to light can be measured and used to assess the activity of retinal cells in vivo. This manuscript describes the use of the ERG to measure visual function in zebrafish. Zebrafish have long been utilized as a model for vertebrate development due to the ease of gene suppression by morpholino oligonucleotides and pharmacological manipulation. At 5-10 dpf, only cones are functional in the larval retina. Therefore, the zebrafish, unlike other animals, is a powerful model system for the study of cone visual function in vivo. This protocol uses standard anesthesia, micromanipulation and stereomicroscopy protocols that are common in laboratories that perform zebrafish research. The outlined methods make use of standard electrophysiology equipment and a low light camera to guide the placement of the recording microelectrode onto the larval cornea. Finally, we demonstrate how a commercially available ERG stimulator/recorder originally designed for use with mice can easily be adapted for use with zebrafish. ERG of larval zebrafish provides an excellent method of assaying cone visual function in animals that have been modified by morpholino oligonucleotide injection as well as newer genome engineering techniques such as Zinc Finger Nucleases (ZFNs), Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs), and Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9, all of which have greatly increased the efficiency and efficacy of gene targeting in zebrafish. In addition, we take advantage of the ability of pharmacological agents to penetrate zebrafish larvae to evaluate the molecular components that contribute to the photoresponse. This protocol outlines a setup that can be modified and used by researchers with various experimental goals.

We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

Analisi elettroretinogramma della risposta visiva in Zebrafish larve

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the ...

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as accessibility to numerous imaging approaches, electrophysiological techniques and behavioral assays. The Xenopus tadpole olfactory system is particularly well suited to investigate the function of synapses established during normal development or reformed after injury. Here, we describe methodologies to evaluate the processing of olfactory information in living Xenopus larvae. We outline a combination of in vivo measurements of presynaptic calcium responses in glomeruli of the olfactory bulb with olfactory-guided behavior assays. Methods can be combined with the transection of olfactory nerves to study the rewiring of synaptic connectivity. Experiments are presented using both wild-type and genetically modified animals expressing GFP reporters in central nervous system cells. Application of the approaches described to genetically modified tadpoles can be useful for unraveling the molecular bases that define vertebrate behavior.

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system in vivo. We describe methodologies to evaluate the processing of olfactory information in living Xenopus larvae in normal rearing conditions or after injury.

Valutazione funzionale delle vie olfattive in girini di Xenopus vivente

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as ...

Using Optical Coherence Tomography and Optokinetic Response As Structural and Functional Visual System Readouts in Mice and Rats

Optical coherence tomography (OCT) is a fast, non-invasive, interferometric technique allowing high-resolution retinal imaging. It is an ideal tool for the investigation of processes of neurodegeneration, neuroprotection and neuro-repair involving the visual system, as these often correlate well with retinal changes. As a functional readout, visually evoked compensatory eye and head movements are commonly used in experimental models involving the visual function. Combining both techniques allows a quantitative in vivo investigation of structure and function, which can be used to investigate the pathological conditions or to evaluate the potential of novel therapeutics. A great benefit of the presented techniques is the possibility to perform longitudinal analyses allowing the investigation of dynamic processes, reducing variability and cuts down the number of animals needed for the experiments. The protocol described aims to provide a manual for acquisition and analysis of high quality retinal scans of mice and rats using a low cost customized holder with an option to deliver inhalational anesthesia. Additionally, the proposed guide is intended as an instructional manual for researchers using optokinetic response (OKR) analysis in rodents, which can be adapted to their specific needs and interests.

A detailed protocol for the assessment of structural and visual readouts in rodents by optical coherence tomography and optokinetic response is presented. The results provide valuable insights for ophthalmologic as well as neurologic research.

Tramite tomografia ottica di coerenza e risposta Optokinetic come strutturale e funzionale sistema visivo letture in topi e ratti

Optical coherence tomography (OCT) is a fast, non-invasive, interferometric technique allowing high-resolution retinal imaging. It is an ideal tool for ...

Zebrafish Avoidance and Thigmotaxis Assay: A High-Throughput Method to Examine Larval Behavior in Response to Aversive Visual Stimulus

Source: Richendrfer, H., et al. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/50622/" target="_blank">Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae</a>. &#160;J. Vis. Exp.&#160;(2013)
The video describes the avoidance and thigmotaxis assay of zebrafish larvae. The video examines the behavior of zebrafish larvae in response to visual aversive stimulus.

Saggio di evitamento e tigmotassi del pesce zebra: un metodo ad alto rendimento per esaminare il comportamento larvale in risposta a uno stimolo visivo avversivo

Source: Richendrfer, H., et al. Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae. &#160;J. Vis. Exp.&#160;(2013)
The video describes the ...

Un test comportamentale semplice for Testing Funzione visiva in

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