Gli autori riconoscono il contributo della stazione Hammond Bay biologica, Great Lakes Science Center, US Geological Survey. Ringraziamo anche il Dott. Melinda frame presso il Centro di Microscopia Avanzata presso la Michigan State University per il suo supporto tecnico nella scansione laser microscopia confocale. Questo studio è sostenuto da finanziamenti della Commissione Grandi Laghi per la pesca a YWCD e WML.

1. Preparazione Solution <ol><li> Rendere 1 L 10x 0.1 M salina tampone fosfato (PBS, pH 7,4): Pesare 26,2 g di fosfato di sodio (monobasico), 115 g di fosfato di sodio (bibasico), e 87,66 g NaCl. Sciogliere in circa 800 ml di acqua distillata H 2 O, regolare il pH, e portare al volume di 1 litro con acqua distillata H 2 O. <ol><li> Rendere 1 L 0.1 M tampone fosfato salino (pH 7.4): Prendete 100 ml 10x PBS e aggiungere 900 ml di acqua distillata H 2 O. </li><li> Rendere 1 L 0.1 M tampone fosfato salino (pH 7.4) con 0.1% Triton X-100: Prendete 100 ml 10x PBS, aggiungere 1 ml di Triton X-100, e portare al volume di 1 litro con acqua distillata H 2 O. </li></ol></li><li> Rendere 1 L 10x 0.1M tampone fosfato (PB, pH 7,4): Pesare 26,2 g di fosfato di sodio (monobasico) e 115 g di fosfato di sodio (bibasico). Sciogliere in circa 800 ml di acqua distillata H 2 O, regolare il pH, e portare al volume di 1 litro con acqua distillata H 2 O. <ol><li> Rendere 1 L 0.1 M tampone fosfato (pH 7.4): Prendete 100 ml 10x PB,e aggiungere 900 ml di acqua distillata H 2 O. </li><li> Rendere 1 L 0.1 M tampone fosfato (pH 7.4) con 0.1% Triton X-100: Prendete 100 ml 10x PB, aggiungere 1 ml di Triton X-100, e portare al volume di 1 litro con acqua distillata H 2 O. </li></ol></li><li> Preparare la soluzione di 400 ml di idrogel monomero (4% acrilammide, 0,25% bis-acrilammide, 4% paraformaldeide, 0,0075% persolfato di ammonio, 0,0005% saponina in 0.1 M PBS): Pesare 0,3 g di persolfato di ammonio e 0,2 g saponina. Aggiungere 210 ml di H 2 O distillata, 40 ml 40% di acrilammide, 10 ml 2% bis-acrilammide, 40 ml 10x PBS (pH 7.4), 100 ml 16% paraformaldeide, e mescolare bene. </li><li> Preparare la soluzione di compensazione 4 L (4% SDS in acido borico 0.2 M): Pesare 49,464 g di acido borico e 160 g SDS. Sciogliere in circa 3,5 L H 2 O distillata, aggiustare il pH a 8.5 con NaOH, e portare il volume fino a 4 L. </li><li> Rendere 1 L soluzione di glicerolo 80%: Misurare 800 ml di glicerolo, aggiungere 200 ml di acqua distillata H 2 O, e mescolare bene. </li></ol> 2. Preparazione Tissue <ol><li> Preparare la soluzione di monomero idrogel e un&#39;aliquota di 10 ml per ogni provetta da centrifuga 15 ml. </li><li> Sezionare tutto il tessuto e fissare l&#39;idrogel per 2 giorni a 4 ° C. Assicurarsi che la soluzione idrogel è almeno 10 volte il volume del tessuto. </li><li> Portare il tessuto fissato idrogel (nella provetta da centrifuga 15 ml) ad una cappa aspirante. </li><li> Polimerizzare il tessuto fissato idrogel con l&#39;aggiunta di 5 ml TEMED, mescolare bene e lasciar riposare nella cappa a temperatura ambiente per 2-3 ore. </li><li> Rimuovere accuratamente il gel in eccesso. Nota: gel Extra ostacolerà il processo di compensazione e la penetrazione degli anticorpi durante la colorazione. </li><li> Incubare il tessuto fissato in 10 ml di soluzione di compensazione in un agitatore incubatore a 70 rpm e 50 ° C per diversi giorni finché il tessuto diventa trasparente. Cambiare soluzione compensazione almeno una volta al giorno e rimuovere il gel in eccesso dal tessuto quando si cambia la soluzione di compensazione. </li><li> Risciacquare il tessuto in 10 ml di 0,1 M PB con 0.1% Triton X-100 a 70 rpm e 37 ° C durante la notte. Ripetere questo passaggio 3 volte e rimuovere il gel in eccesso dal tessuto quando si cambia la soluzione tampone. </li><li> Incubare il tessuto chiarito nella soluzione di anticorpo primario in PB con 0.1% Triton X-100 a 70 rpm e 37 ° C per 2 giorni. Nota: soluzione di anticorpo primario sufficiente a sommergere tutto il tessuto. </li><li> Risciacquare il tessuto in 10 ml PB con 0.1% Triton X-100 a 70 rpm e 37 ° C durante la notte. Ripetere questo passaggio 3 volte e rimuovere il gel in eccesso dal tessuto quando si cambia la soluzione tampone. </li><li> Effettuare le seguenti operazioni in una stanza buia o sotto la luce fioca. Coprire i campioni con un foglio per evitare foto sbiancamento. </li><li> Incubare il tessuto chiarito con la soluzione di anticorpo secondario fluorescente in PB con 0.1% Triton X-100 e il siero di blocco a 70 rpm e 37 ° C per 1 giorni. </li><li> Risciacquare il tessuto in 10 ml PB con 0.1% Triton X-100 a 70 rpm e 37 ° C durante la notte. Ripetere questa operazione 3 volte e rimuovere il gel in eccesso fROM il tessuto quando si cambia la soluzione tampone. </li><li> Risciacquare il tessuto in 10 ml di PBS a 70 rpm e 37 ° C durante la notte. Ripetere questo passaggio 3 volte e rimuovere il gel in eccesso dal tessuto quando si cambia la soluzione tampone. </li><li> Incubare il tessuto chiarito in 80% glicerolo a 70 rpm e 37 ° C durante la notte. </li><li> Conservare il tessuto tinto fluorescente a 4 ° C prima di microscopia confocale. </li></ol>

<ol>
	<li>Applegate, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+history+of+the+sea+lamprey+(Petromyzon+marinus)+in+Michigan.">Natural history of the sea lamprey (Petromyzon marinus) in Michigan.</a> US Fish and Wildlife Service Special Science Report on Fishery Service. (55), (1950).</li><li>Hardisty, M. W., Potter, I. C., Hardisty, M. W., Potter, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+general+biology+of+adult+lampreys.">The general biology of adult lampreys.</a> The biology of lampreys. 1, 127-206 (1971).</li><li>Youson, J. H., Potter, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+description+of+the+stages+in+the+metamorphosis+of+the+anadromous+sea+lamprey,+Petromyzon+marinus+L.">A description of the stages in the metamorphosis of the anadromous sea lamprey, Petromyzon marinus L.</a> Can. J. Zool. 57, 1808-1817 (1979).</li><li>Boomer, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholangiocyte+apoptosis+is+an+early+event+during+induced+metamorphosis+in+the+sea+lamprey,+Petromyzon+marinus+L.">Cholangiocyte apoptosis is an early event during induced metamorphosis in the sea lamprey, Petromyzon marinus L.</a> J. Pediatr. 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Surg. 42, 1555-1560 (2007).</li><li>Sidon, E. W., Youson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+changes+in+the+liver+of+the+sea+lamprey,+Petromyzon+marinus+L.,+during+metamorphosis:+I.+Atresia+of+the+bile+ducts.">Morphological changes in the liver of the sea lamprey, Petromyzon marinus L., during metamorphosis: I. Atresia of the bile ducts.</a> J. Morphol. 177, 109-124 (1983).</li><li>Yeh, C. -. Y., Chung-Davidson, Y. -. W., Wang, H., Li, K., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+synthesis+and+secretion+of+bile+salts+as+an+adaptation+to+developmental+biliary+atresia+in+the+sea+lamprey.">Intestinal synthesis and secretion of bile salts as an adaptation to developmental biliary atresia in the sea lamprey.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 109, 11419-11424 (2012).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li><li>Alarc&#243;n, V. B., Filosa, M. F., Youson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokeratins+in+the+liver+of+the+sea+lamprey+(Petromyzon+marinus)+before+and+after+metamorphosis.">Cytokeratins in the liver of the sea lamprey (Petromyzon marinus) before and after metamorphosis.</a> Cell Tissue Res. 287, 365-374 (1997).</li><li>Youson, J. H., Ogilvie, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+features+of+degeneration+of+the+gallbladder+during+lamprey+biliary+atresia.">Ultrastructural features of degeneration of the gallbladder during lamprey biliary atresia.</a> Tissue and Cell. 22, 477-492 (1990).</li><li>Morii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+of+apoptosis+in+the+cystic+duct+during+metamorphosis+of+a+Japanese+lamprey,+Lethenteron+reissneri.">Onset of apoptosis in the cystic duct during metamorphosis of a Japanese lamprey, Lethenteron reissneri.</a> Anat. Rec. 293, 1155-1166 (2010).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo è modificato da un nuovo metodo chiamato &quot;chiarezza&quot; 12, che reticola tessuto intatto con poliacrilammide per formare un idrogel nanoporoso, e poi strappa via la membrana plasmatica del tessuto per ottenere la trasparenza ottica e permeabilità macromolecolare. &quot;CHIAREZZA&quot; permette l&#39;imaging intatto tessuto di lungo raggio di proiezione e il cablaggio del circuito locale nel sistema nervoso. Questo nuovo metodo può essere usato per visualizzare l&#39;intero sistema biliare in lamprey mare fegato durante la metamorfosi. È una sfida in biologia avere informazioni ad alta risoluzione e mantenere la prospettiva globale di un sistema complesso come l&#39;intero sistema biliare o del sistema nervoso centrale con incorporamento convenzionale e sezionamento metodi. Questo metodo CLARITY modificata permette un raggio laser di penetrare attraverso la intatta lampreda mare fegato larvale fino ad uno spessore di 1 a 2 mm mediante obiettivo fluorescente a bassa potenza (4x) in un normale confoca scansione laserl microscopio. Penetrazione più profonda può essere raggiunto utilizzando un più avanzato multi-fotone microscopio confocale. Immagini tridimensionali possono essere ricostruiti utilizzando il software di ricostruzione 3D. Giungere a risultati comparabili con metodi convenzionali sarebbe laborioso, coinvolgendo la ricostruzione frammentaria di molte sezioni, e sarebbe limitata a piccoli volumi di tessuto. Questo nuovo metodo fornisce preziose informazioni da intere analisi strutturali dei sistemi intatti 12, è meno, più efficiente e riproducibile ad alta intensità di manodopera. Un altro vantaggio di questo nuovo metodo è che i campioni possono essere riutilizzati più volte per la colorazione con differenti anticorpi 12. Questo rende il confronto tra i diversi marcatori molecolari nello stesso campione più affidabile e riproducibile. Il quadro stabile generato da idrogel permette la rimozione efficace di anticorpi senza fini danni alla struttura e mantiene l&#39;antigenicità per un lotempo ng 12. La soluzione di compensazione denatura anticorpi e sconvolge vincolanti, quindi agisce come una soluzione di anticorpo-strippaggio 12. Diversi giri di colorazione sono stati eseguiti nei campioni di fegato lampreda di mare e la struttura e la colorazione è rimasta ottimale. Ci sono due importanti modifiche in questo protocollo dal protocollo originale &quot;CHIAREZZA&quot; 12. (1) reagenti di radicali liberi (persolfato di ammonio e TEMED) sono stati usati per avviare e accelerare la polimerizzazione del idrogel anziché VA044. VA044 è fotosensibile e non è disponibile negli Stati Uniti (2) Nessuna camera di elettroforesi su misura viene utilizzato. Nel metodo CLARITY 12, a causa delle dimensioni dei tessuti (cervello di topo contro lampreda fegato), compensazione tessuto elettroforetica è necessario per accelerare l&#39;estrazione della membrana plasmatica. Per evitare il costo iniziale di una camera di elettroforesi su misura, in primo luogo abbiamo usato existing dispositivi gel elettroforesi nel nostro laboratorio. Questo si è rivelato essere molto inefficiente. Tuttavia, incubazione nella soluzione di compensazione con temperatura aumentata (50 ° C) è molto efficace nell&#39;eliminare la membrana plasmatica. Anche se per &quot;CHIAREZZA&quot; gli autori in guardia contro l&#39;uso della saponina in idrogel, migliora la trasparenza nel tessuto lampreda di mare nella nostra procedura. Uno svantaggio per l&#39;imaging confocale è che il tessuto lampreda di mare ha una forte auto-fluorescenza. La scelta di fluorofori deve essere verificata confrontando le immagini prima e dopo immunofluorescenza. Durante la lampreda di mare metamorfosi, la regressione dell&#39;epitelio cistifellea inizia tra gli stadi metamorfici 2 e 3. By stadio metamorfico 4, la cistifellea scompare del tutto dal lampreda di mare, fegato 14. La degenerazione del dotto biliare è più dramatic tra gli stadi metamorfici 3 e 4 15. Questo metodo modificato è un potente strumento per studiare i meccanismi cellulari e molecolari della degenerazione dell&#39;intero sistema biliare, che può fornire spunti per atresia biliare umana.

Lampreda di mare si sviluppano attraverso tre distinte fasi di vita di 1,2. Larvale lampreda di mare (L) trascorrono più tempo in tane come filtratori bentonici. Dopo aver attraversato sette stadi metamorfici di drammatici cambiamenti nella morfologia e riorganizzazione in organi interni 3 esterni, il novellame risultanti (JV) entrano in una fase parassitaria nel corso della quale si nutrono di sangue e fluidi tissutali di pesce ospitante, l&#39;aumento della massa corporea più di 100 volte . Dopo la 1.0 to 1,5 anni di alimentazione sul pesce ospite in mare o grandi laghi, adulti cessano alimentazione durante la primavera e migrano nei fiumi per deporre le uova e poi muoiono 1,2. Durante la metamorfosi, il fegato lampreda di mare perde la cistifellea e l&#39;intero albero biliare, un fenotipo mutante evolutivo che imita la malattia neonato umano atresia delle vie biliari. Infant atresia biliare è una rara malattia del fegato pediatrico a gravi complicazioni mediche 4,5,6,7, 8,9,10, ma la patogenesi ed eziologia di atresia biliare sono in gran parte sconosciuti 4. I pazienti con atresia biliare muoiono entro due anni dopo la nascita se non viene eseguito l&#39;intervento chirurgico (procedura Kasai) 5. Successivamente, questi pazienti richiedono una gestione clinica e spesso trapianto di fegato 6. Molte teorie di atresia biliare eziopatogenesi sono stati proposti, come l&#39;infezione virale, malformazione congenita, malattia autoimmune, e insulto tossico. Tuttavia, il contributo di ciascuno allo sviluppo di atresia biliare rimane inconcludente 7,8,9,10. A differenza dei bambini che soffrono patologico atresia delle vie biliari, lampreda di mare che formano oggetto evolutivamente programmato atresia delle vie biliari senza una necroinfiammazione, fibrosi o cirrosi 10. Gli animali possono soffrire colestasi transitorio durante questo processo 10, ma adattarsi a questa condizione dello sviluppovia de novo sintesi e secrezione di sali biliari nell&#39;intestino dopo sviluppo atresia biliare, oltre ai meccanismi noti come la riduzione della sintesi di sali biliari nel fegato 11. Questo processo di sviluppo in lampreda di mare offre l&#39;opportunità unica nota di esaminare la progressione di atresia biliare. Un metodo di nuova concezione denominato &quot;CHIAREZZA&quot; permette di imaging ad alta risoluzione in complessi sistemi nervosi dei mammiferi trasformando tessuto intatto in un idrogel nanoporosa otticamente trasparente 12. Utilizzando mare fegato lampreda e un protocollo CLARITY modificato, imaging intatto tessuto della degenerazione biliare può essere documentata in tutta metamorfosi fegato.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="702">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">40% acrylamide&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0140</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2% bis-acrylamide&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TEMED</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ammonium persulfate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3678-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7901-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">saponin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium dodecyl sulfate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L337-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium phosphate (monobasic)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>04269-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium phosphate (dibasic)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5136-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glycerol&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9012-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">16% paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaOH pellets&#160;</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0590-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15 ml centrifuge tubes</td>
			<td style="width:200px;">Any brand</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dissecting tools&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Any brand</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a new clarification method to visualize biliary degeneration during liver metamorphosis in sea lamprey (petromyzon marinus)

Atresia biliare è una rara malattia dell&#39;infanzia, con una stima di 1 a 15.000 frequenza nel sud-est degli Stati Uniti, ma più comune nei paesi dell&#39;Asia orientale, con una frequenza riportata di 1 su 5.000 in Taiwan. Anche se si sa molto circa la gestione di atresia biliare, la sua patogenesi è ancora sfuggente. La lampreda di mare (Petromyzon marinus) offre un&#39;opportunità unica per esaminare il meccanismo e la progressione della degenerazione biliare. Lampreda di mare sviluppare attraverso tre fasi della vita distinte: larve, parassiti, e adulti. Durante la transizione da larve di parassiti giovanile, lampreda di mare subiscono metamorfosi con la riorganizzazione drammatica e rimodellamento in morfologia esterna e gli organi interni. Nel fegato, l&#39;intero sistema biliare è perso, compresa la cistifellea e l&#39;albero biliare. Un metodo di nuova concezione denominato &quot;CHIAREZZA&quot; è stata modificata per chiarire l&#39;intero fegato e il bivio con l&#39;intestino in metamorfico lampreda di mare. Ilprocesso di degenerazione biliare è stato visualizzato e discernimento durante la lampreda di mare metamorfosi mediante scansione laser microscopia confocale. Questo metodo fornisce un potente strumento per studiare atresia biliare in un modello animale unico.

Diversi importanti eventi evolutivi si verificano nel sistema epatobiliare durante la lampreda di mare metamorfosi. Il dotto biliare e la cistifellea apoptosi e degenerata (Figura 1). Combinando il metodo chiarimento modificato e colorazione con fegato marker delle cellule citocheratina 19 (CK19, presente in entrambi i colangiociti ed epatociti prima e dopo la metamorfosi 13) e anti-apoptotica Bcl2 marcatore utilizzando la microscopia confocale, l&#39;intero sistema biliare è stato catturato lungo l&#39;asse Z ( Figura 2) e la struttura 3-dimensionale è stato ricostruito (Figura 3). Scansione laser confocale è stato usato per eseguire sezione ottica attraverso il fegato intatto poiché la maggior parte del sistema biliare è incorporata nel fegato tranne giunzione in cui il dotto biliare entra nell&#39;intestino. Il processo degenerativo avviene in fasi metamorfiche 2-4, partendo da piccoli ductules biliari periferici verso il grande intrahep centraleATIC dotto biliare comune (Figura 2), in linea con studi precedenti 10. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51648/51648fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Vescica degenerazione Gallo durante la lampreda di mare metamorfosi. Lampreda di mare perde la cistifellea (frecce nere) durante la metamorfosi. I campioni sono stati prelevati da animali con morfologia esterna tra gli stadi metamorfici 2 e 3, cioè occhio tondo senza (stadio 2) o (fase 3) sharp differenziazione di iride e la pupilla, proiezioni papilla simile prominenti sulla superficie dorsale interna del orale Cappa (entrambe le fasi), labbra di cappa orale (fase 2) che formano un ingresso rettangolare nella cavità orale (fase 3), o il muso &quot;pug-like&quot; (fase 3) 3 addensato. Si noti che la cistifellea anche cambiato colore che indica le differenze di produzione di bile.I: intestino. L:. Fegato <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51648/51648fig1highres.jpg" target="_blank">cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51648/51648fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. Immagini confocale che mostrano l&#39;albero biliare in lampreda di mare epatica durante la metamorfosi. I campioni sono stati prelevati da animali con morfologia esterna tra gli stadi metamorfici 2 e 3. Torna pannelli sono prese dalla anteriori, ed i pannelli inferiori dalla fine posteriore. Immagini di fegato marker delle cellule citocheratina 19 (1:100 mouse anti-CK19, marcate con 2 mg / ml Alexa Fluor 350-capra-topo anti-IgG, blu) e indicatore anti-apoptotica Bcl2 (1:100 coniglio anti- Bcl2, macchiato con 2 mg IgG / ml Alexa Fluor 488-asino-anti-coniglio; verde) si sovrappongono per generare le immagini unite. Frecce bianche indicano la balbero Auxiliary. Frecce nere indicano il dendritiche scura, guardando cellule apoptotiche e canalicoli e ductules nel fegato circostante. I: intestino. L: fegato. Barra della scala:. 500 micron <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51648/51648fig2highres.jpg" target="_blank">cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51648/51648fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. Immagini 3D ricostruiti da unito confocale z-series. Immagini 3D sono stati ricostruiti dalla confocale z-serie di tre fegati tra fasi metamorfiche 2 e 3. Sezioni ottiche di immagini unite il fegato marker delle cellule citocheratina 19 (1:100 mouse- anti-CK19, macchiata di 2 mg / ml Alexa Fluor 350-capra-topo anti-IgG, blu) e indicatore anti-apoptotica Bcl2 (1:100 coniglio anti-Bcl2, macchiata di 2 mg / ml Alexa Fluor 488-asino -anti-IgG di coniglio; verde) sono ricostruiti con il software del produttore per generare le immagini 3D. Pannelli superiori sono prese dalla anteriori, ed i pannelli inferiori dalla fine posteriore. Frecce bianche indicano l&#39;albero biliare. Frecce nere indicano il dendritiche scura, guardando cellule apoptotiche e canalicoli e ductules nel fegato circostante. I: intestino. L: fegato. Barra della scala:. 500 micron <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51648/51648fig3highres.jpg" target="_blank">cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51648/51648fig4highres.jpg" width="500" /> .. Figura 4 Una sezione ottica confocale mostra dotti biliari con le goccioline biliari nel lume immagine unita da 3 canali fluorescenti; blu: mouse anti-c-Myc (1:100) / 2 mg / ml Alexa Fluor 350-capra-topo anti-IgG; verde: 2 mg / ml verde Nissl; Rosso: Rabbit-anti-TGFβRII (1:100) / 2 mg / ml Alexa Fluor 594-asino-anti-coniglio. Scala bar: 500 micron. Goccioline biliari sono indicati da frecce nere. Il campione di fegato è stata scattata tra lo stadio metamorfico 2 e 3. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51648/51648fig4highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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A New Clarification Method to Visualize Biliary Degeneration During Liver Metamorphosis in Sea Lamprey Petromyzon marinus

Lampreda di mare perde la cistifellea e vie biliari durante la metamorfosi, un processo simile a atresia biliare umano. Un nuovo metodo di fissazione e chiarificazione (CLARITY) è stato modificato per visualizzare l&#39;intero albero biliare mediante scansione laser microscopia confocale. Questo metodo fornisce un potente strumento per studiare la degenerazione biliare.

Un metodo Chiarimento Nuovo per visualizzare biliare degenerazione Durante fegato Metamorfosi in mare Lamprey ( Petromyzon marinus)

Biliary atresia is a rare disease of infancy, with an estimated 1 in 15,000 frequency in the southeast United States, but more common in East Asian ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

A New Clarification Method to Visualize Biliary Degeneration During Liver Metamorphosis in Sea Lamprey (Petromyzon marinus)

13.7K Views.  Michigan State University.  Lampreda di mare perde la cistifellea e vie biliari durante la metamorfosi, un processo simile a atresia biliare umano. Un nuovo metodo di fissazione e chiarificazione (CLARITY) è stato modificato per visualizzare l'intero albero biliare mediante scansione laser microscopia confocale. Questo metodo fornisce un potente strumento per studiare la degenerazione biliare. 

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Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pirosequenziamento: un metodo semplice per genotipizzazione accurata

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Ricerca

Biologia

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Metodo per la Cultura di Chick primi embrioni ex vivo (Nuova Cultura)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Visually Mediated Odor Tracking During Flight in Drosophila

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual stabilization of upwind tracking directly aids in odor tracking. But do olfactory signals directly influence visual tracking behavior independently from wind cues? Additionally, recent advances in olfactory molecular genetics and neurophysiology have motivated novel quantitative behavioral analyses to assess the behavioral influence of (e.g.) genetically inactivating specific olfactory activation circuits. We modified a magnetic tether system originally devised for vision experiments by equipping the arena with narrow laminar flow odor plumes. Here we focus on experiments that can be performed after a fly is tethered and is able to navigate in the magnetic arena. We show how to acquire video images optimized for measuring body angle, how to judge stable odor tracking, and we illustrate two experiments to examine the influence of visual cues on odor tracking.

Here we describe how to optimize the acquired video image for an olfactory magnetic-tether (OMT) apparatus. We also describe two sample experimental protocols for studying visuo-olfactory fusion.

Visivamente monitoraggio Odore mediata durante il volo in Drosophila

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual ...

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion rate. This method can be used to obtain a better understanding of the process of diuresis in insects and is especially useful in the study of diuresis in blood-feeding arthropods that are able to take up huge amounts of liquid in a single blood meal. 
This RNAi-mediated gene knockdown combined with an in vivo diuresis assay was developed by the Hansen lab to study the effects of RNAi-mediated knockdown of aquaporin genes on Aedes aegypti mosquito diuresis1. 
The protocol is setup in two parts: the first demonstration illustrates how to construct a simple mosquito injection device and how to prepare and inject dsRNA into the thorax of mosquitoes for RNAi-mediated gene knockdown. The second demonstration illustrates how to determine excretion rates in mosquitoes using an in vivo bioassay.

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

In this protocol we combine RNAi-mediated gene silencing with an in vivo diuresis assay to study the effects knockdown of genes of interest has on mosquito fluid excretion.

RNAi-mediato Knockdown Gene e<em&gt; In Vivo</em&gt; Saggio La diuresi in femmina adulta<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Le zanzare

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term storage of biological materials such as blood, cells and tissues 1,2. The cryogenic nature of liquid nitrogen, while ideal for sample preservation, can cause rapid freezing of live tissues on contact - known as 'cryogenic burn'2, which may lead to severe frostbite in persons closely involved in storage and retrieval of samples from Dewars. Additionally, as liquid nitrogen evaporates it reduces the oxygen concentration in the air and might cause asphyxia, especially in confined spaces2.
In laboratories, biological samples are often stored in cryovials or cryoboxes stacked in stainless steel racks within the Dewar tanks1. These storage racks are provided with a long shaft to prevent boxes from slipping out from the racks and into the bottom of Dewars during routine handling. All too often, however, boxes or vials with precious samples slip out and sink to the bottom of liquid nitrogen filled tank. In such cases, samples could be tediously retrieved after transferring the liquid nitrogen into a spare container or discarding it. The boxes and vials can then be relatively safely recovered from emptied Dewar. However, the cryogenic nature of liquid nitrogen and its expansion rate makes sunken sample retrieval hazardous. It is commonly recommended by Safety Offices that sample retrieval be never carried out by a single person. Another alternative is to use commercially available cool grabbers or tongs to pull out the vials3. However, limited visibility within the dark liquid filled Dewars poses a major limitation in their use.
In this article, we describe the construction of a Cryotolerant DIY retrieval device, which makes sample retrieval from Dewar containing cryogenic fluids both safe and easy.

Here we present a low cost, durable cryotolerant device for sample retrieval from Dewar tanks filled with liquid nitrogen. The ease of construction and modular design of the device makes the process of sample retrieval from cryogenic tanks safe and easy.

Do-It-Yourself dispositivo per il recupero di campioni crioconservati cadere accidentalmente nelle cisterne criogeniche

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA FISH) represents the most direct way to visualize the location of gene loci, chromosomal sub-regions or entire territories in individual cells. This type of analysis provides insight into the global architecture of the nucleus as well as the behavior of specific genomic loci and regions within the nuclear space. Immunofluorescence, on the other hand, permits the detection of nuclear proteins (modified histones, histone variants and modifiers, transcription machinery and factors, nuclear sub-compartments, etc). The major challenge in combining immunofluorescence and 3D DNA FISH is, on the one hand to preserve the epitope detected by the antibody as well as the 3D architecture of the nucleus, and on the other hand, to allow the penetration of the DNA probe to detect gene loci or chromosome territories 1-5. Here we provide a protocol that combines visualization of chromatin modifications with genomic loci in 3D preserved nuclei.

Here we describe a protocol for simultaneous detection of histone modifications by immunofluorescence and DNA sequences by DNA FISH followed by 3D microscopy and analyses (3D immuno-DNA FISH).

Immunofluorescenza combinato e FISH DNA 3D conservato nuclei in interfase di studiare i cambiamenti in 3D Organizzazione nucleare

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

High Throughput microiniezioni di Sea Urchin zigoti

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

A Method for Extracting Pigments from Squid Doryteuthis pealeii

Cephalopods can undergo rapid and adaptive changes in dermal coloration for sensing, communication, defense, and reproduction purposes. These capabilities are supported in part by the areal expansion and retraction of pigmented organs known as chromatophores. While it is known that the chromatophores contain a tethered network of pigmented granules, their structure-function properties have not been fully detailed. We describe a method for isolating the nanostructured granules in squid Doryteuthis pealeii chromatophores and demonstrate how their associated pigments can be extracted in acidic solvents. To accomplish this, the chromatophore containing dermal layer is first manually isolated using a superficial dissection, and the pigment granules are removed using sonication, centrifugation, and washing cycles. Pigments confined within the purified granules are then extracted via acidic methanol solutions, leaving nanostructures with smaller diameters that are void of visible color. This extraction procedure produces a 58% yield of soluble pigments isolated from granules. Using this method, the composition of the chromatophore pigments can be determined and used to provide insight into the mechanism of adaptive coloration in cephalopods.

A Method for Extracting Pigments from Squid Doryteuthis pealeii

A protocol for the extraction of pigments from the nanostructured granules in squid Doryteuthis pealeii chromatophores is presented.

Un metodo per estrarre pigmenti da Squid<em&gt; Pealeii Doryteuthis</em

Cephalopods can undergo rapid and adaptive changes in dermal coloration for sensing, communication, defense, and reproduction purposes. These capabilities ...

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

This work describes the whole-mount immunohistochemistry staining method in detail, using neurofilament protein antibody to label the innervation of the biliary tract in Suncus murinus (S. murinus&#160;). First, the specimen was dissected from S. murinus and fixed in 4% paraformaldehyde (PFA). Second, an enzymatic treatment and potential endogenous peroxidase inactivation were performed. The specimen was then exposed to the primary antibody, anti-neurofilament protein antibody, for 3-6 days. It was then incubated with the secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase. The color reaction was revealed by reacting the specimen with a 3,3&#39;-diaminobenzidine (DAB) substrate. This method can be applied to analyze the innervation of all visceral organs. Furthermore, this protocol can also be adapted to test other neuronal antibodies, but optimization of the antibodies should be done first. This method was originally introduced by Kuratani and Tanaka1,2,3.

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

A whole-mount immunohistochemical approach, to visualize neurofilament protein expression in the extrahepatic biliary tract in Suncus murinus. is presented here. This protocol can be used to analyze the innervation of all visceral organs in S. murinus or other species.

Utilizzando un metodo immunohistochemico integrale per studiare l&#39;innervazione del tratto bipolare in<em&gt; Suncus murinus</em

This work describes the whole-mount immunohistochemistry staining method in detail, using neurofilament protein antibody to label the innervation of the ...

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this scenario, the search for new antifungal drugs is necessary. The protocol reported here details a method to screen peptides for their antifungal properties. It is based on the broth microdilution susceptibility test from the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 guidelines with modifications to suit the research of antimicrobial peptides as potential new antifungals. This protocol describes a functional assay to evaluate the activity of antifungal compounds and may be easily modified to suit any particular class of molecules under investigation. Since the assays are performed in 96-well plates using small volumes, a large-scale screening can be completed in a short amount of time, especially if carried out in an automation setting. This procedure illustrates how a standardized and adjustable clinical protocol can help the bench-work pursuit of new molecules to improve the therapy of fungal diseases.

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

An easy and adaptable broth microdilution method for screening antifungal compounds and extracts.