Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health di Grant NS-024572 (da RSW).

1. Colorare la preparazione con sopravitale Coloranti <ol><li> Per il protocollo dissezione serpente giarrettiera vedere Stewart et al. 5 e Teng et al. 6 tessuto Reptilian resta fisiologica per tempi più lunghi, e con meno contaminazione batterica, conservato a basse temperature (vedi sotto). Tessuti di mammiferi, di solito è mantenuta a temperatura ambiente o superiore. </li><li> Per lisosomiale colorante vitale colorazione, sciogliere il colorante in rettili freddi 1:5.000 soluzione Ringers (0,2 micron). Incubare a 4 ° C per 15 min. Lavare più volte con Ringers freddi. Immagine appena possibile. </li><li> Per FM1-43 colorazione utilizzando la stimolazione KCl, diluire il colorante in alto KCl Ringers 1:500 (7 micron). Incubare a 4 ° C per 30-60 sec massimo. Lavare rapidamente tre volte con Ringers fredde, ~ 1 min / risciacquo. Immagine appena possibile. </li><li> Per FM1-43 colorazione utilizzando la stimolazione ipertonica (saccarosio), diluire il colorante in 0,5 M Ringers saccarosio come sopra. Incubare a 4 &amp; #176, C per 2-5 min. Lavare come al punto 1.3 con Ringers freddi. Immagine appena possibile. </li><li> Per FM1-43 colorazione tramite stimolazione elettrica, vedere Teng et al. 6 Brevemente, la preparazione è posto un recipiente contenente soluzione salina fisiologica e il colorante. Il nervo viene stimolato con un treno programmato di 200 msec impulsi rettangolari (~ 7 V, 30 Hz, 18 msec). Lavare come al punto 1.3 con Ringers freddi. Immagine appena possibile. </li></ol> 2. Configurare la preparazione di Imaging <ol><li> Orientare la preparazione in modo che le strutture di interesse siano il più vicino possibile all&#39;obiettivo microscopio. </li><li> Se viene utilizzato un microscopio invertito, utilizzare una camera il cui fondo contiene un sottile giro copertura di slittamento. Tipicamente, la camera di imaging dovrebbe avere un fondo sottile in acciaio inossidabile con un diametro # 1 vetro spessore copertura antiscivolo 25 mm a centro. Se viene utilizzato un microscopio verticale, un coprioggetto inferiore non è necessaria ma è utileper consentire di imaging con luce trasmessa (ad esempio il contrasto di interferenza differenziale, DIC) per orientare il campione e localizzare oggetti di interesse. </li><li> Scegliere un obiettivo appropriato per ottenere la massima risoluzione 3D possibile. Ci sono dei compromessi tra apertura numerica (na), distanza di funzionamento, l&#39;ingrandimento e il tipo di lente (a secco, ad immersione in olio-acqua). Per i preparati sottili come colture di tessuti, gli obiettivi del petrolio sono i migliori. Utilizzando un microscopio verticale, mobile un vetrino sul bagno acquoso, e utilizzare olio per immersione tra la parte superiore del vetrino e l&#39;obiettivo. </li><li> Se si utilizza il software di deconvoluzione, il venditore potrebbe fornire funzioni di punto di spread predeterminati (PSF) per determinati obiettivi. Se tale informazione è fornita, o se si sceglie un obiettivo non supportato determinare il PSF da imaging di micropunti fluorescenti o oggetti di diffrazione limitata analoghi 7,8. </li></ol> 3. Stabilire la profondità di campo desiderata e numero di Images desiderati per Time-lapse con cornice <ol><li> Selezionare la profondità totale del campo in modo che lo spostamento o interagendo strutture di interesse non scompaiono o andare fuori fuoco, come si muovono nella direzione z. La z-campo dovrebbe superare leggermente la dimensione verticale del processo cellulare o la cellula viene esposta. Per i terminali del motore vertebrati, 15-20 micron è tipico. </li><li> Calcolare il passo asse z necessaria per ogni incremento di messa a fuoco. Risoluzione lungo l&#39;asse z varia a seconda proprietà del obiettivo; è circa un quarto della risoluzione piano xy. Se viene utilizzato sia confocale o software di deconvoluzione, risoluzione z è migliorata. Migliorare la risoluzione finale oversampling deliberata nella direzione z 5, ma si veda anche passo 3.3. Un intervallo tipico passo è nell&#39;intervallo da 400-1,500 nm per obiettivi 40-100X. Luce dovrebbe essere coperto off tra ogni immagine z-step. </li><li> Selezionare il numero di immagini per z-stack, cioè la profondità di campo desiderata divisodall&#39;intervallo passo. Tempo per completare una tipica z-stack è 1-10 sec. Oggetti in rapido movimento (100 nm / sec) possono apparire sfocata in una pila di immagini 3D perché ogni piano dell&#39;immagine corrisponde ad un punto temporale leggermente diverso. Inoltre, ogni immagine aggiuntiva contribuisce al photobleaching e fototossicità possibile (vedi discussione). Se una situazione riguarda, sceglierebbe una più grande z-passo per raccogliere un minor numero di immagini per stack. Compensare successivamente utilizzando il software di interpolazione dell&#39;immagine (fase 6.3). </li></ol> 4. Selezionare il Frame Rate Time-lapse Scegli sperimentazione un tasso che è appena sufficiente per risolvere agevolmente cambia con il tempo come il movimento, interazioni o eventi di fusione 9. Sotto il campionamento può produrre artefatti da movimento (errori di campionamento), mentre sovracampionamento aumenta inutilmente l&#39;esposizione alla luce. Raccogliere una singola sequenza lunga o più sequenze ripetute della stessa preparazione, ciascuno con un intervallo relativamente piccolo tempo totale ( <em&gt; eg 10 punti temporali x 30 sec intervallo = 5 min). Se possibile, vista la preparazione con la continua illuminazione epifluorescenza a circa stima velocità del movimento, tra cui deriva l&#39;intera preparazione, se presente. 5. Completa tutte le immagini dal vivo per una preparazione particolare Preparazioni Rettiliani in genere rimangono robusto per ~ 1-2 ore, più a lungo se raffreddato. 6. Analizzare i dati in base all&#39;uso desiderato <ol><li> Conservare tutti i file di dati grezzi. Mentre memorizzazione digitale di solito non è un problema, tempo di elaborazione è significativo anche con personal computer o workstation veloci. Per questo motivo, ritagliare le immagini in una regione di interesse [ROI]. Assicurare che l&#39;intera regione di interesse nella finestra ritagliata durante l&#39;intero corso del tempo. </li><li> Deconvolve immagine pile utilizzando il software appropriato e la funzione di punto di diffusione corretta. Verificare che la risoluzione è migliorata e che nessun manufatto è stato generato dallaalgoritmo di deconvoluzione. Figura 3 mostra immagini di esempio. </li><li> Utilizzare un algoritmo di interpolazione per espandere z risoluzione apparente. Un&#39;espansione 6X da un immagine reale di 1,5 micron piano di separazione di un apparente separazione 0,25 micron è suggerito. In alternativa, utilizzare una combinazione di sovracampionamento (punto 3.2) e l&#39;interpolazione. </li><li> Eseguire il contrasto, la luminosità, il filtraggio del rumore, fotoscolorimento e altre regolazioni tipiche di elaborazione delle immagini, se lo desideri. Norme di manipolazione della fotografia impongono che per la maggior parte lavoro scientifico, è opportuno che le stesse correzioni da applicare a tutte le immagini, sia all&#39;interno di uno stack e in diversi momenti. La conseguenza di una rettifica specifica dovrebbe essere valutata fra tutte le immagini 9. </li><li> Selezionare una modalità di visualizzazione particolare per l&#39;esportazione dei dati. Il display più semplice è video stereo utilizzando sia anaglifi rosso-verde o rosso-blu (esempi in figura 3), coppie stereo, o alternando sinistra / right occhio fotogrammi con occhiali. Anaglifi sono limitati a un solo colore. Migliorare la profondità dell&#39;immagine evidente se lo si desidera migliorare z risoluzione visiva. </li><li> Esperimento con varie filtraggio e di immagine tecniche di miglioramento. Ad esempio, il filtro laplaciano è utile per aumentare il contrasto di piccole strutture sopra sfondo. La luminosità del pixel al centro di una finestra di esecuzione è migliorata mentre la luminosità delle zone circostanti è ridotto. Nota che alcuni metodi di filtraggio non funzionano bene in combinazione. </li><li> Applicare correzione della deriva se vi è sostanziale movimento della preparazione nel tempo. Tale movimento è comune nel muscolo vivente, anche con farmaci aggiunti per sopprimere potenziali d&#39;azione e potenziali sinaptici. Un algoritmo di registrazione pixel (ad es. Imaris, Adobe AfterEffects, plug TurboReg per ImageJ) allinea le immagini time-lapse e può ridurre, ma di solito non eliminare completamente, tale movimento. </li></ol>

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Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.

L&#39;aspetto più critico dell&#39;imaging 4D è la gestione della durata e intensità di esposizione alla luce. Fotoscolorimento diminuisce immagine rapporto segnale-rumore e può essere problematico o meno a seconda di vari fattori, tra cui la scelta di fluorofori. Danni aspecifica di tessuto vivente (fototossicità) è legato alla photobleaching, e talvolta può essere identificato utilizzando sonde fluorescenti progettati per lo scopo 2,12 o di un esame della morfologia con opportune ottiche chiaro, come il contrasto di interferenza differenziale (DIC). È possibile, tuttavia, per indurre un effetto fisiologico che si verifica a livelli luminosi ben al di sotto della grandezza di quelli associati con photobleaching e fototossicità. Ad esempio, nei primi esperimenti utilizzando più preparati, ciascuno fissato ad un momento diverso dopo stimolazione, il tasso al quale ME scomparse con il tempo dopo una stimolazione breve è stato misurato 6. Come è prassi normale to minimizzare dissolvenza, i preparativi sono stati tenuti all&#39;oscuro fino a quando non sono state visualizzate. Quando esperimenti simili sono stati eseguiti utilizzando 4D imaging dal vivo, molti altri ME rimasti per tutto l&#39;esperimento (~ 20-60 min) e non scompaiono. Uso dello stesso protocollo di imaging in tempo reale, tranne non effettivamente la registrazione e limitando l&#39;esposizione alla luce per un singolo fotogramma 3D all&#39;inizio e un singolo fotogramma alla fine quindi, ripristinato il tasso complessivo atteso di endosomi scomparsa a quello dei preparati fissi. Ulteriore risoluzione dei problemi indicava che il tasso di scomparsa fu in parte, inversamente e monotonicamente correlata all&#39;esposizione alla luce totale durante un esperimento. Dopo tentativi infruttuosi di ridurre l&#39;esposizione attraverso l&#39;ottica confocale convenzionali e multiphoton, il problema è stato finalmente risolto con l&#39;acquisto di una fotocamera più sensibile ~ 3x (Tabella 1). Si raccomanda confronti analoghi essere effettuate se possibile, in funzione dell&#39;applicazione dell&#39;utente. Se alcuni process o transizione è documentata nel tempo, confermare che non vi è alcuna modifica attribuibile a intensità o la durata totale di illuminazione. Fototossicità e photobleaching sono specifici-dye. Ad esempio, abbiamo visto alcuna significativa dissolvenza 4D dopo ripetute di un terminale (350 singole esposizioni di luce oltre 30 min) con FM1-43. Lo stesso protocollo di imaging utilizzando un colorante simile, SGC5 (Tabella 1), tuttavia, ha portato in alcuni sbiadimento e, presumibilmente, fototossicità e (dati non mostrati). Con l&#39;eccezione di miglioramenti forniti dalla deconvoluzione digitale (ottica e confocale, se usati; non mostrati), il metodo diretto descritto fornisce alcuna soluzione &quot;super&quot;. Tuttavia, il metodo ha il vantaggio di migliorare la risoluzione pratica o intuitivo durante la visualizzazione di strutture viventi, in particolare quelli in movimento, la cui dimensione è pari o leggermente superiore al limite di diffrazione. La possibilità di visualizzare gli oggetti da varie prospettive, includipresentazione ng in ciascuno dei tre piani ortogonali, guida il ricercatore se una struttura esiste effettivamente sopra del livello del rumore e se è etichettato da uno o più fluorofori. Ad esempio, in esperimenti volti a quantificare il numero e la dimensione di MI e AES, è stato possibile confermare che la struttura era visibile da vari punti di vista e che ogni dimensione (e quindi il suo volume tridimensionale) è stata nel range tipico per tale struttura. La posizione di una struttura è anche meglio definito, ad esempio, all&#39;interno di un assone, terminale nervoso etc. piuttosto che al di sopra o al di sotto di esso. Al contrario, quando il campo di vista era limitata a una singola piano dell&#39;immagine 2D o ad un singolo proiezione di dati 3D, strutture putativi spesso rivelati &quot;rumore&quot;. Analogamente, strutture doppie marcato putativi spesso rivelati due strutture che apparivano coincidente da una prospettiva di visione (o due) ma non da tutti. Visualizzazione da tre direzione ortogonalezioni fornisce uno standard e un criterio di routine per valutare le caratteristiche di esistenza, di dimensioni e di etichettatura degli endosomi o strutture similari per l&#39;uso in analisi quantitative e statistiche. La metodologia descritta è pratico in quanto può essere utilizzato un video microscopio convenzionale del tipo che si trova in molti laboratori. La strumentazione è versatile e non specializzato, e relativamente poco costoso. Mentre il software specifico di un particolare microscopio è stato utilizzato qui, il software open-source sia per l&#39;acquisizione delle immagini e l&#39;elaborazione dei dati in grado di produrre risultati simili 13. Tecniche (compresi deconvoluzione) sono applicabili all&#39;imaging singolo e multiphoton confocale con vantaggi simili, purché l&#39;esposizione alla luce è tollerato dalla preparazione vivente utilizzato. In futuro, miglioramenti del design rafforzerà ulteriormente l&#39;imaging dal vivo utilità 4D. Questi includono, in primo luogo, l&#39;hardware che migliora la velocità di messa a fuoco e filtro di eccitazione / emissione changing, e la disponibilità di ancora più sensibile videocamere.

Time-lapse imaging di tessuto vivente fornisce l&#39;accesso visivo dinamici relazioni struttura-funzione che non può essere apprezzato in preparazioni fissi o che vivono impressi in un unico punto nel tempo. Spesso, tuttavia, il compromesso per l&#39;accesso alle informazioni temporali è una diminuzione della risoluzione ottica. Obiettivi ad immersione in olio ad alta apertura numerica sono impraticabili nel tessuto vivo a causa della loro ristretta gamma di messa a fuoco, lasciando immersione in acqua o obiettivi a secco come le uniche alternative. Inoltre, la maggiore risoluzione ottenibile con ottica confocale non può essere utilizzato in alcune preparazioni vivere a causa della fototossicità dai livelli relativamente alti di illuminazione richiesti 1,2. Infine, mentre diverse real-time o time-lapse tecniche ottiche sono disponibili che offrono una maggiore risoluzione, la loro applicabilità è limitata a preparazioni in cui le strutture di interesse possono essere posizionati a poche centinaia di nanometri dell&#39;obiettivo 1. Il metodo descritto, a strumenti relativamente a basso costo, è versatile, ma offre una migliore risoluzione rispetto alle tecniche time lapse più comunemente usati. Esso è destinato all&#39;uso nei laboratori individuali nonché strutture di imaging. Il metodo utilizza epifluorescenza convenzionale, combinato con una fotocamera digitale sensibile e con hardware progettato per acquisire rapidamente gruppi di immagini a leggermente differenti piani focali (Z-stack). Ogni z-stack è digitalmente deconvolved per aumentare la risoluzione. Una caratteristica del 3D time-lapse (4D) imaging è tracciamento preciso di organelli o altre strutture in movimento. Se correttamente impostato, strutture impressi non vanno fuori fuoco, e il movimento in tutte e tre le direzioni possono essere osservati e quantificati. Così è impossibile per una struttura macchiato eliminata nell&#39;arco di uno o più frame time lapse semplicemente alla deriva sopra o al di sotto di un piano focale stretta. Il metodo serve anche come strumento sensibile per valutare le interazioni e possibile fusione di piccole strutture. Epifluorescenza convenzionale o immagini confocali di strutture in prossimità del limite di diffrazione (a poche centinaia di nm) non confermano la fusione anche se le immagini mostrano unite sovrapposizione delle rispettive etichette 3. Fusion è suggerito, ma rimane la possibilità che gli oggetti sono separati orizzontalmente o verticalmente da una distanza che è inferiore al limite di diffrazione. Tre o immagini quadridimensionale, al contrario, consente la visualizzazione degli oggetti in ciascuna delle tre direzioni ortogonali. L&#39;aspetto della fusione in tutte e tre le viste aumenta il livello di certezza. E, in alcune preparazioni viventi, diretto o moto browniano di oggetti ipoteticamente fuse fornisce un&#39;ulteriore prova quando entrambi i marchi si muovono insieme nel tempo. Naturalmente, quando in prossimità del limite di diffrazione il livello di certezza in strutture esigenti da sfondo, o mostrando che esse contengono due coloranti (fusione), non è assoluto. Se, tecniche specializzate, ad esempio la risonanza di fluorescenza trasferimento di energia (FRET)4, sono più appropriato.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SGC5</td><td>Biotium, Hayward, CA</td><td>70057</td><td>Final conc: 10 mM</td></tr><tr><td>FM1-43FX</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>F35335</td><td>Final conc: 7 mM</td></tr><tr><td>LysoTracker Red</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>L7528</td><td>Final conc: 0.2 mM</td></tr><tr><td>Reptilian Ringers pH 7.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td>145 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td>2.5 mM</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td>3.6 mM</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td>1.8 mM</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (Dibasic)</td><td></td><td></td><td>1.0 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td></td><td></td><td>5.0 mM</td></tr><tr><td>High KCl Reptilian Ringers pH 7.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td>86 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td>60 mM</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td>3.6 mM</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td>1.8 mM</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (Dibasic)</td><td></td><td></td><td>1.0 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td></td><td></td><td>5.0 mM</td></tr><tr><td>High Sucrose Ringers pH 7.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td>145 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td>2.5 mM</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td>3.6 mM</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td>1.8 mM</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (Dibasic)</td><td></td><td></td><td>1.0 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td></td><td></td><td>5.0 mM</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td></td><td></td><td>0.5 M (17.1 g/50 ml)</td></tr><tr><td>Axioplan 200 inverted microscope</td><td>Carl Zeiss, Thornwood, NY</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.zeiss.com/&quot;&gt;www.zeiss.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>N-Achroplan 63X water objective; n.a.=0.9; Working distance=2.4 mm&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss, Thornwood, NY</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.zeiss.com/&quot;&gt;www.zeiss.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>DG4 combination light source/excitation filterwheel switcher</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td>175W Xenon arc lamp</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sutter.com/&quot;&gt;www.sutter.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Lambda 10-2&amp;nbsp; emission filterwheel switcher</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sutter.com/&quot;&gt;www.sutter.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Sensicam CCD camera</td><td>Cooke Instruments, Tonawanda, NY</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.cookecorp.com/&quot;&gt;www.cookecorp.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Cascade 512 CCD camera</td><td>Photometrics, Tucson, AZ</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.photometrics.com/&quot;&gt;www.photometrics.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Imaging dishes- made in-house-11 cm dia.; 25 mm dia. #1 coverslip embedded; magnetic pins</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slidebook 5.0</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Denver, CO</td><td>Deconvolution; Drift correction;3D and 4D data presentation</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.intelligent-imaging.com/&quot;&gt;www.intelligent-imaging.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>IMARIS 7.5.2</td><td>Bitplane, South Windsor, CT</td><td>Drift correction; 3D and 4D data presentation</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.bitplane.com/&quot;&gt;www.bitplane.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>AfterEffects CS6</td><td>Adobe, San Jose, CA</td><td>Drift correction</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.adobe.com/&quot;&gt;www.adobe.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>ImageJ 1.46</td><td>National Institutes of Health, Bethesda, MD</td><td>Multiple plugins available; Stereo pair construction</td><td>&lt;a href=&quot;http://rsbweb.nih.gov/ij&quot;&gt;http://rsbweb.nih.gov/ij&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Zeiss LSM</td><td>Carl Zeiss, Thornwood, NY</td><td>Stereo pair construction</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.zeiss.com/&quot;&gt;www.zeiss.com&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

visualization of endosome dynamics in living nerve terminals with four-dimensional fluorescence imaging

Quadridimensionale (4D) immagini poco è stato utilizzato per studiare il comportamento di piccole strutture nel raggio di terminali dei nervi motori del sottile trasverso dell&#39;addome muscolo del serpente giarrettiera. I dati grezzi comprende sequenze time-lapse di 3D z-stack. Ogni stack contiene 4-20 immagini acquisite con ottica epifluorescenza a piani focali separati da 400-1,500 nm. Passi nella acquisizione di pile di immagini, quali la regolazione della messa a fuoco, la commutazione di lunghezze d&#39;onda di eccitazione, e il funzionamento della fotocamera digitale, sono automatizzate per quanto possibile per massimizzare la velocità di immagine e minimizzare danni ai tessuti da esposizione alla luce. Dopo l&#39;acquisizione, una serie di pile di immagini è deconvolved per migliorare la risoluzione spaziale, convertito nel formato 3D desiderato, e utilizzato per creare un &quot;film&quot; 4D che è adatto per diverse analisi basati su computer, a seconda dei dati sperimentali richiesti. Una applicazione è lo studio del comportamento dinamico di due classi di endosomi trovati in terminali nervosi-macroendosomes (MES)e endosomi acidi (AES)-le cui dimensioni (200-800 nm per entrambi i tipi) sono in prossimità o al limite di diffrazione. L&#39;accesso alle informazioni 3D in ogni tempo offre diversi vantaggi rispetto ai tradizionali time-lapse imaging. In particolare, le dimensioni e la velocità di movimento delle strutture possono essere quantificati nel tempo senza perdita di fuoco. Esempi di dati di immagini 4D rivelano che ME avvicinano alla membrana plasmatica e scompaiono, suggerendo che essi sono exocytosed piuttosto che semplicemente spostando verticalmente distanti un unico piano di messa a fuoco. Ha anche rivelato è la fusione putativo di ME e AES, attraverso la visualizzazione di sovrapposizione tra i due strutture colorante contenente come visto in ogni tre proiezioni ortogonali.

I dati riportati sono da terminali serpente neuromuscolari (vedi visite basse e alte ingrandimento nella figura 3, il colorante endocitica (FM1-43) assorbimento crea una nebbia che riempie ogni bouton) e, in particolare, macroendosomes (MES) e endosomi acidi (AES) all&#39;interno di questi terminali 5. ME sono creati da endocitosi massa durante l&#39;attività neuronale 10 e il loro numero declina esponenzialmente con il tempo dopo l&#39;attività è cessata 6. L&#39;uso di 4D imaging dal vivo era di determinare se ME muovono verso la membrana plasmatica e scomparire rapidamente, suggerendo che il loro numero diminuisce perché alcuni di loro esocitosi. Tutti questi ME erano presenti a un certo punto volta (e quelli prima) e completamente andati al successivo punto di tempo (e di quelli dopo). Così il tempo richiesto per la scomparsa era inferiore al nostro intervallo telaio (più corto 30 sec) e coerente con esocitosi. Una teoria alternativa, non avvalorati da dati 4D, è che ME lentamente dissipare tramite gemmazione di vesicles fino a che non svaniscono. Erba vescicola si verifica 6, ma almeno qualche ME sono exocytosed durante o dopo erba 5. Figura 1 e Movie S1 illustrano la scomparsa di un ME tra due fotogrammi time-lapse. ME destinati a svanire non cambiano forma o la luminosità su due o più fotogrammi (N = 16), che sarebbe stato coerente con la lenta dissipazione durante il periodo del film (che inizia diversi minuti dopo la stimolazione breve). ME scomparsa è stata osservata in precedenza in convenzionale time-lapse, ma era possibile che le strutture hanno semplicemente lasciato il piano di messa a fuoco. Inoltre, la visualizzazione da una varietà di prospettive (Movie S1) ha confermato che la scomparsa ME è stata improvvisa. Con convenzionale l&#39;imaging dal vivo (guardando da un unico punto di vista, ad esempio, il piano immagine xy) la presenza di rumori limitano la capacità del ricercatore di confermare che una struttura è rimasta invariata. Tali manufatti sono spesso presentiin una vista, ma non altri. Studi di microscopia elettronica hanno dimostrato che gli endosomi a morsetti del motore sono di piccole dimensioni, in prossimità del limite di diffrazione della luce 10. Quindi fusione di questi endosomi non può essere distinto assolutamente da stretta associazione territoriale a livello di luce. ME sono stati etichettati con FM1-43 (verde fluorescente) e AES con un colorante vitale lisosomiale (rosso fluorescente). Strutture che fluoresced in entrambi i colori (che appare giallo) sono state occasionalmente notato in 4D record di immagine. Utilizzando il software appropriato, viste queste endosomi doppio etichettati e quindi apparentemente fusi da una varietà di prospettiva sono stati generati per esaminare la coincidenza delle due etichette in voxel vicino e all&#39;interno della struttura apparente. Figura 2 mostra un putativo fuso AE-ME come visto da tre direzioni ortogonali. Un punto di vista è il piano xy; le altre viste sono ortogonali a tale piano e tra di loro. Usando questo metodo si è constatato che voxelo sovrapposti, come in questo esempio, o che evidentemente non in uno o più piani di visualizzazione. Film S2 mostra lo stesso putativo fuso AE-ME presentato come un display di realtà virtuale interattivo (completamente ruotabile in 3 dimensioni). Deconvoluzione digitale è uno strumento utile per migliorare la risoluzione di 3D e 4D immagini, sia convenzionali e microscopi confocali 11. Deconvoluzione numerica è un processo iterativo che compensa, in parte, per risoluzione spaziale limitata dell&#39;obiettivo utilizzato. Questa risoluzione è caratterizzato come punto spread funzione del volume del obiettivo 3D occupata dall&#39;immagine di un punto infinitesimale. In teoria, deconvoluzione ripristina l&#39;immagine che deriverebbe se l&#39;obiettivo fosse perfetto. Figura 3 è una vista volume 3D di due diverse serie di dati, ciascuna visualizzati come una coppia di anaglifi rosso-verde. Le immagini a destra mostrano tipica miglioramento della nitidezza dopo de digitaleconvoluzione della pila di immagini. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51477/51477fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51477/51477fig1.jpg" /> Figura 1. A macroendosome (ME) scompare dopo contatto apparente con la membrana plasmatica. Un serpente preparazione nervo-muscolo è stato stimolato elettricamente in presenza di FM1-43. I dati sono stati raccolti usando l&#39;imaging 4D, come descritto in Metodi e vengono visualizzati come &quot;viste volume 3D&quot; in sei punti (60 intervallo sec) per illustrare la Z-profondità di un singolo bouton. Un ME possono essere osservati allontanandosi dalla Y (linea rossa tratteggiata) su più fotogrammi, prima di scomparire tra i punti di tempo 5 e 6. Poco prima scomparsa, ME sembra essere situato membrana plasmatica del bouton (delineato da FM1-43 vescicola colorazione o &quot;foschia&quot;; vedi Figura 3 leggenda). La ME non ricomparve insuccessivi punti temporali (dati non mostrati; vedere film S1). Barra della scala, 2 micron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51477/51477fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> MOVIE S1:. Vista 4D time-lapse di ME scomparsa <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51477/MOVIE-S1-111913.mov" target="_blank">Clicca qui per vedere film.</a> lo stesso insieme di dati grezzi visualizzato in figura 1 è indicata come una &quot;vista del volume 4D&quot; con un ingrandimento minore. La sequenza di time-lapse originale comprende 8 punti temporali, separati da 60 sec; riproduzione è a 4 fotogrammi / sec. La sequenza è breve pausa all&#39;inizio di ciascuno dei 24 3D rotazione passi circa l&#39;asse y (15 gradi / step) per attirare l&#39;attenzione sul procinto di scomparire ME (freccia rossa). Si noti che la ME è visibile, si avvicina al bordo del bouton (membrana plasmatica), scompare, e non restituisce, intutte le prospettive di visualizzazione. A causa della bassa risoluzione asse z rispetto alla risoluzione xy, la forma della ME sembra allungare e accorciare seconda visione prospettica. Le immagini sono state esportate come filmato QuickTime, e annotati utilizzando QuickTime Pro. Barra della scala, 2 micron. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51477/51477fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51477/51477fig2.jpg" /> Figura 2. Vista ortogonale di un endosomi fuso putativo. Una preparazione muscolare nervo è stato sequenzialmente tinto con un colorante vitale lisosomiale (rosso) per etichettare AES e FM1-43 (verde) per etichettare ME con 0,5 M di stimolazione saccarosio come descritto nei metodi. I dati da un punto di tempo di un film 4D vengono visualizzati come viste di volume 3D in tre orientamenti. Al top (pannelli 1-3) è il punto di vista convenzionale dall&#39;alto (piano xy). A medio (pannelli 4-6) è una vista perpendicolare al piano xy enella (arbitraria) direzione della grande freccia rossa. In fondo (pannelli 7-9) è una vista reciprocamente perpendicolare entrambe le viste sopra, in direzione della freccia grande blu. Un ME (verde) è contrassegnato da una freccia verde; due eventi avversi (rosso) sono contrassegnati da frecce rosse. Un endosomi contenenti entrambi i coloranti (giallo) è contrassegnato da una freccia gialla in pannelli di 3, 6 e 9. Notare che la sovrapposizione di rosso e verde è altrettanto completo in tutte e tre le proiezioni ortogonali. Barra della scala, 2 micron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51477/51477fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> MOVIE S2:. Rotazione Interactive di un&#39;immagine contenente ME e endosomi acidi EA <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51477/MOVIE-S2-073013.mov" target="_blank">. Clicca qui per vedere film</a> Il set di dati di figura 2 è mostrata configurato come completamente ruotabile immagini 3D (QuickTime virtuale Reality formato; utilizzare il mouse per ruotare l&#39;immagine per la visualizzazione da qualsiasi direzione). I putativo ME fusi / AE rimane gialla da tutte le prospettive. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51477/51477fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51477/51477fig3.jpg" /> Figura 3. Deconvoluzione migliora la risoluzione spaziale 3D. Due terminali tipici serpente nervose, mostrato a bassa (in alto) e alto (basso) di ingrandimento rispettivamente e macchiato durante la stimolazione con FM1-43. FM1-43 di fondo &quot;foschia&quot;, a causa di etichettatura delle singole vescicole 50 nm, mostra la forma di boutons terminali, ai quali ME sono confinati. I dati vengono visualizzati come anaglifi rosso-verde di vista del volume 3D (profondità può essere visualizzato con vetri rosso-verde o rosso-blu, rosso occhio sinistro; nota assoni in alto a sinistra scende nel piano del terminale da sopra). Pannelli a sinistra: dati grezzi; Pannelli di destra: i dati dopodeconvoluzione. Si noti il ​​significativo miglioramento nella risoluzione di ME. Pannelli di testa: la stimolazione elettrica; intero terminale mostrato (~ 30 x 50 micron) (stessi dati grezzi come in figura 1 e Movie S1, barra della scala, 10 micron). Pannelli di fondo: stimolazione KCl; ingrandita per mostrare quattro boutons individuali (~ 3 x 5 micron; bar scala, 2 micron). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51477/51477fig3highres.jpg" target="_blank">cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

Quadridimensionale (4D) di imaging viene utilizzato per studiare il comportamento e le interazioni tra i due tipi di endosomi a vivere terminazioni nervose vertebrati. Movimento di queste piccole strutture è caratterizzata in tre dimensioni, permettendo conferma di eventi come endosomi fusione ed esocitosi.

Visualizzazione del endosome Dynamics in Vivere terminazioni nervose con quattro-dimensionale imaging di fluorescenza

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

visualization-endosome-dynamics-living-nerve-terminals-with-four

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.9K Views.  Washington University School of Medicine.  Quadridimensionale (4D) di imaging viene utilizzato per studiare il comportamento e le interazioni tra i due tipi di endosomi a vivere terminazioni nervose vertebrati. Movimento di queste piccole strutture è caratterizzata in tre dimensioni, permettendo conferma di eventi come endosomi fusione ed esocitosi. 

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In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different neurological diseases. Defects in this essential process can have detrimental effects on neuronal functioning and development. We have developed a dissection protocol that is designed to expose the Drosophila larval segmental nerves to view axonal transport in real time. We have adapted this protocol for live imaging from the one published by Hurd and Saxton (1996) used for immunolocalizatin of larval segmental nerves. Careful dissection and proper buffer conditions are critical for maximizing the lifespan of the dissected larvae. When properly done, dissected larvae have shown robust vesicle transport for 2-3 hours under physiological conditions. We use the UAS-GAL4 method 1 to express GFP-tagged APP or synaptotagmin vesicles within a single axon or many axons in larval segmental nerves by using different neuronal GAL4 drivers. Other fluorescently tagged markers, for example mitochrondria (MitoTracker) or lysosomes (LysoTracker), can be also applied to the larvae before viewing. GFP-vesicle movement and particle movement can be viewed simultaneously using separate wavelengths.

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

This protocol discusses the live dissection of Drosophila larvae for the purpose of imaging the movement of GFP tagged axonal vesicles on microtubule tracks.

Nella visualizzazione in vivo delle vescicole sinaptiche In Drosophila assoni larvali segmentale

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Ricerca

Neuroscienze

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

In Vivo microscopia a due fotoni di Endings singolo nervo in pelle

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real time and dissecting the different steps of exo-endocytosis at the single-vesicle level are crucial for understanding synaptic functions in health and disease.
Genetically-encoded pH-sensitive probes directly targeted to synaptic vesicles and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM) provide the spatio-temporal resolution necessary to follow vesicle dynamics. The evanescent field generated by total internal reflection can only excite fluorophores placed in a thin layer (&#60;150 nm) above the glass cover on which cells adhere, exactly where the processes of exo-endocytosis take place. The resulting high-contrast images are ideally suited for vesicles tracking and quantitative analysis of fusion events.
In this protocol, SH-SY5Y human neuroblastoma cells are proposed as a valuable model for studying neurotransmitter release at the single-vesicle level by TIRFM, because of their flat surface and the presence of dispersed vesicles. The methods for growing SH-SY5Y as adherent cells and for transfecting them with synapto-pHluorin are provided, as well as the technique&#160;to perform TIRFM and imaging. Finally, a strategy aiming to select, count, and analyze fusion events at whole-cell and single-vesicle levels is presented.
To validate the imaging procedure and data analysis approach, the dynamics of pHluorin-tagged vesicles are&#160;analyzed under resting and stimulated (depolarizing potassium concentrations) conditions. Membrane depolarization increases the frequency of fusion events and causes a parallel raise of the net fluorescence signal recorded in whole cell. Single-vesicle analysis reveals modifications of fusion-event behavior (increased peak height and width). These data suggest that potassium depolarization not only induces a massive neurotransmitter release but also modifies the mechanism of vesicle fusion and recycling.
With the appropriate fluorescent probe, this technique can be employed in different cellular systems to dissect the mechanisms of constitutive and stimulated secretion.

This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.

TIRFM e GFP-sonde pH-sensibile per valutare Neurotransmitter Vesicle Dynamics in cellule SH-SY5Y neuroblastoma: cell imaging e analisi dei dati

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze membrane fusion within eukaryotic cells. The SNARE protein family consists of about 36 different members. Specific intracellular transport routes are catalyzed by specific sets of 3 or 4 SNARE proteins that thereby contribute to the specificity and fidelity of membrane trafficking. However, studying the precise function of SNARE proteins is technically challenging, because SNAREs are highly abundant and functionally redundant, with most SNAREs having multiple and overlapping functions. In this protocol, a new method for the visualization of SNARE complex formation in live cells is described. This method is based on expressing SNARE proteins C-terminally fused to fluorescent proteins and measuring their interaction by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) employing fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). By fitting the fluorescence lifetime histograms with a multicomponent decay model, FRET-FLIM allows (semi-)quantitative estimation of the fraction of the SNARE complex formation at different vesicles. This protocol has been successfully applied to visualize SNARE complex formation at the plasma membrane and at endosomal compartments in mammalian cell lines and primary immune cells, and can be readily extended to study SNARE functions at other organelles in animal, plant, and fungal cells.

This protocol describes a new method allowing for the quantitative visualization of complex formation of SNARE proteins, based on F&#246;rster resonance energy transfer, and fluorescence lifetime imaging microscopy.

Visualizing intracellulare rullante traffico da fluorescenza Lifetime Imaging microscopia

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

Immunologia e infezioni

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

Quantificazione delle endosomi e dei motivi di lisosomi nei neuroni coltivati ​​utilizzando sonde fluorescenti

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding environment and initiate contacts with potential synaptic partners. Although the connection between dendritic branch dynamics and synaptogenesis is well established, how developmental and activity-dependent processes regulate dendritic branch dynamics is not well understood. This is partly due to the technical difficulties associated with the live imaging and quantitative analyses of these fine structures using an in vivo system. We established a method to study dendrite dynamics using Drosophila larval ventral lateral neurons (LNvs), which can be individually labeled using genetic approaches and are accessible for live imaging. Taking advantage of this system, we developed protocols to capture branch dynamics of the whole dendritic arbor of a single labeled LNv through time-lapse live imaging. We then performed post-processing to improve image quality through drift correction and deconvolution, followed by analyzing branch dynamics at the single-branch level by annotating spatial positions of all branch terminals. Lastly, we developed R scripts (Supplementary File) and specific parameters to quantify branch dynamics using the coordinate information generated by the terminal tracing. Collectively, this protocol allows us to achieve a detailed quantitative description of branch dynamics of the neuronal dendritic arbor with high temporal and spatial resolution. The methods we developed are generally applicable to sparsely labeled neurons in both in vitro and in vivo conditions.

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Here, we describe the method we employed to image highly motile dendritic filopodia in a live preparation of the Drosophila larval brain, and the protocol we developed to quantify time-lapse 3D imaging datasets for quantitative assessments of dendrite dynamics in developing neurons.

Time-lapse Live Imaging e quantificazione delle dinamiche del ramo dendritico veloce nello sviluppo di neuroni della Drosophila

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Axonal transport maintains neuronal homeostasis by enabling the bidirectional trafficking of diverse organelles and cargoes. Disruptions in axonal transport have devastating consequences for individual neurons and their networks, and contribute to a plethora of neurological disorders. As many of these conditions involve both cell autonomous and non-autonomous mechanisms, and often display a spectrum of pathology across neuronal subtypes, methods to accurately identify and analyze neuronal subsets are imperative.
This paper details protocols to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria in sciatic nerves of anesthetized mice. Stepwise instructions are provided to 1) distinguish motor from sensory neurons in vivo, in situ, and ex vivo by using mice that selectively express fluorescent proteins within cholinergic motor neurons; and 2) separately or concurrently assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria. These complementary intravital approaches facilitate the simultaneous imaging of different cargoes in distinct peripheral nerve axons to quantitatively monitor axonal transport in health and disease.

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Using transgenic fluorescent mice, detailed protocols are described to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria within motor and sensory axons of the intact sciatic nerve in live animals.

Espansione del toolkit per l'imaging in vivo del trasporto assonale

Axonal transport maintains neuronal homeostasis by enabling the bidirectional trafficking of diverse organelles and cargoes. Disruptions in axonal ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a crucial component of intracellular signaling. The visualization of subcellular Ca2+ dynamics in vivo,&#160;where neurons can be studied in their native, intact circuitry, has proven technically challenging in complex nervous systems. The transparency and relatively simple nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans enable the cell-specific expression and in vivo visualization of fluorescent tags and indicators. Among these are fluorescent indicators that have been modified for use in the cytoplasm as well as various subcellular compartments, such as the mitochondria. This protocol enables non-ratiometric Ca2+ imaging in vivo with a subcellular resolution that permits the analysis of Ca2+ dynamics down to the level of individual dendritic spines and mitochondria. Here, two available genetically encoded indicators with different Ca2+ affinities are used to demonstrate the use of this protocol for measuring relative Ca2+ levels within the cytoplasm or mitochondrial matrix in a single pair of excitatory interneurons (AVA). Together with the genetic manipulations and longitudinal observations possible in C. elegans, this imaging protocol may be useful for answering questions regarding how Ca2+ handling regulates neuronal function and plasticity.

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

The current methods describe a non-ratiometric approach for high-resolution, sub-compartmental calcium imaging in vivo in Caenorhabditis elegans using readily available genetically encoded calcium indicators.

Imaging subcellulare della manipolazione neuronale del calcio in vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

4D Microscopy of Yeast

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments in yeast are dynamic, and a full understanding of their properties requires time-lapse imaging. Multi-color 4D confocal fluorescence microscopy is a powerful method for tracking the behavior and composition of an intracellular compartment on a time scale of 5-15 min. Rigorous analysis of compartment dynamics requires the capture of thousands of optical sections. To achieve this aim, photobleaching and phototoxicity are minimized by scanning rapidly at very low laser power, and the pixel dimensions and Z-step intervals are set to the largest values that are compatible with sampling the image at full resolution. The resulting 4D data sets are noisy but can be smoothed by deconvolution. Even with high quality data, the analysis phase is challenging because intracellular structures are often numerous, heterogeneous, and mobile. To meet this need, custom ImageJ plugins were written to array 4D data on a computer screen, identify structures of interest, edit the data to isolate individual structures, quantify the fluorescence time courses, and make movies of the projected Z-stacks. 4D movies are particularly useful for distinguishing stable compartments from transient compartments that turn over by maturation. Such movies can also be used to characterize events such as compartment fusion, and to test the effects of specific mutations or other perturbations.

This protocol describes the analysis of fluorescently labeled intracellular compartments in budding yeast using multi-color 4D (time-lapse 3D) confocal microscopy. The imaging parameters are chosen to capture adequate signals while limiting photodamage. Custom ImageJ plugins allow labeled structures to be tracked and quantitatively analyzed.

Microscopia 4D del lievito

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

Biologia

<meta charset="utf8"></head><body>Miglioramento dell'analisi del trasporto assonale in C . elegans vivente utilizzando RAB-3 con tag GFP

Optimizing Visualization of Axonal Transport of Endogenous Cargo by Fluorescence Microscopy in Living Caenorhabditis elegans

Axonal transport is a prerequisite to deliver axonal proteins from their site of synthesis in the neuronal cell body to their destination in the axon. Consequently, loss of axonal transport impairs neuronal growth and function. Studying axonal transport therefore improves our understanding of neuronal cell biology. With recent improvements in CRISPR Cas9 genome editing, endogenous labeling of axonal cargos has become accessible, enabling to move beyond ectopic expression-based visualization of transport. However, endogenous labeling often comes at the cost of low signal intensity and necessitates optimization strategies to obtain robust data. Here, we describe a protocol to optimize the visualization of axonal transport by discussing acquisition parameters and a bleaching approach to improve the signal of endogenous labeled cargo over diffuse cytoplasmic background. We apply our protocol to optimize the visualization of synaptic vesicle precursors (SVPs) labeled by green fluorescent protein (GFP)-tagged RAB-3 to highlight how fine-tuning acquisition parameters can improve the analysis of endogenously labeled axonal cargo in Caenorhabditis elegans (C. elegans).

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Tecniche avanzate per la visualizzazione della dinamica del trasporto assonale endogeno

The paper describes the optimization of fluorescence microscopy acquisition parameters to visualize the axonal transport of endogenous labeled cargos at single-neuron resolution in a living nematode.

Ottimizzazione della visualizzazione del trasporto assonale del carico endogeno mediante microscopia a fluorescenza in Caenorhabditis elegans vivente

Axonal transport is a prerequisite to deliver axonal proteins from their site of synthesis in the neuronal cell body to their destination in the axon. ...

Visualizzazione del endosome Dynamics in Vivere terminazioni nervose con quattro-dimensionale imaging di fluorescenza

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Nella visualizzazione in vivo delle vescicole sinaptiche In Drosophila assoni larvali segmentale

In Vivo microscopia a due fotoni di Endings singolo nervo in pelle

TIRFM e GFP-sonde pH-sensibile per valutare Neurotransmitter Vesicle Dynamics in cellule SH-SY5Y neuroblastoma: cell imaging e analisi dei dati

Visualizing intracellulare rullante traffico da fluorescenza Lifetime Imaging microscopia

Quantificazione delle endosomi e dei motivi di lisosomi nei neuroni coltivati utilizzando sonde fluorescenti

Time-lapse Live Imaging e quantificazione delle dinamiche del ramo dendritico veloce nello sviluppo di neuroni della Drosophila

Espansione del toolkit per l'imaging in vivo del trasporto assonale

Imaging subcellulare della manipolazione neuronale del calcio in vivo

Microscopia 4D del lievito

Ottimizzazione della visualizzazione del trasporto assonale del carico endogeno mediante microscopia a fluorescenza in Caenorhabditis elegans vivente

Visualizzazione del endosome Dynamics in Vivere terminazioni nervose con quattro-dimensionale imaging di fluorescenza

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