Questo lavoro è stato supportato da una borsa di studio di Ipazia da Radboud University Medical Center, il Career Development Award da Human Frontier Science Program, il programma di gravitazione 2013 dall'organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO; ICI-024.002.009), un VIDI concedere da NWO (ALW VIDI 864.14.001) e una sovvenzione a partire dal Consiglio europeo della ricerca (CER) nell'ambito settimo programma dell'Unione europea quadro (Grant contratto numero 336479).

1. preparazione dei campioni microscopio
<ol>
	<li>Espressione di Qa-SNARE sintaxina 4 fuso a mCitrine (sintaxina 4-mCitrine; fluoroforo donatore) e il R-rullante VAMP3 fusa a mCherry (VAMP3-mCherry) Nota: Altri Rullanti con proteine fluorescenti fuse a loro eliche transmembrane del C-terminale possono essere utilizzati anche. Invece di mCitrine-mCherry, altre coppie donatore-accettore di fluorofori spettralmente separati possono anche essere usato (ad es., CFP-YFP).<ol>
		<li>Cellule HeLa di crescere e dividersi 900.000 cellule HeLa sopra tre 35 mm-diametro vetro fondo piatti per microscopia. Nota: In linea di principio, questo protocollo può essere adattato per altri tipi di cellule eucariotiche e piatti di microscopia.<ol>
			<li>Mantenere le colture delle cellule HeLa in T75 boccette con 10 mL di glucosio elevato Dulbecco di medium dell'Aquila per volta (DMEM), supplementato con 10% siero fetale di vitello (FCS) e 1% antibiotico antimicotico (contenente amfotericina B, penicillina e streptomicina) a 37 ° C e 5% CO 2 in un'incubatrice di coltura cellulare.</li>
			<li>Ricostituire il mezzo due volte a settimana e dividere le celle 01:10, una volta a settimana o quando le cellule raggiungono 85-90% confluenza al nuovo T75 boccette (500.000 cellule/boccetta, in media).</li>
			<li>Rimuovere il DMEM e lavare i monostrati di HeLa due volte con 8 mL di sterile tampone fosfato salino (PBS) per 3 min.</li>
			<li>Rimuovere il PBS e aggiungere 2 mL di PBS con acido etilendiamminotetracetico 2mm (ed).</li>
			<li>Incubare le cellule per 5 min a 37 ° C e 5% di CO2 in incubatrice della coltura cellulare e successivamente leggermente agitare la beuta per separare le cellule HeLa dalla parte inferiore del pallone.</li>
			<li>Lavare le cellule con 10 mL di medium, trasferire la sospensione in una provetta da 15 mL e rimuovere un'aliquota di 10 µ l per il conteggio.</li>
			<li>Diluire l'aliquota 1:1 con 0,4% trypan blu macchia e contare le celle con un emocitometro di Bürker9. Nota: Contare due 4x4 piazze e più il numero di cellulare di 10.000 per il numero di cellule/mL.</li>
			<li>Dopo cella contando, prendere 900.000 cellule dal tubo da 15 mL, li divide sopra i piatti di fondo di 3 vetro (Vedi punto 1.1.1) e preparare per la transfezione.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Transfect le cellule di elettroporazione10 (Vedi Tabella materiali) con sintaxina 4-mCitrine costrutto (donatore solo, campione n. 1), sintaxina 4-mCitrine insieme VAMP3-mCherry (esempio n. 2) e sintaxina 3 fuso a sia mCitrine e mCherry ( Esempio n. 3). Nota: Altri metodi di transfezione delle cellule possono anche essere usato11. Il costrutto di tandem in campione #3 è un controllo positivo per stimare la durata più breve si presenterebbe (cioè, massima si presenterebbe FRET).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cultura che delle cellule durante la notte in alto glucosio DMEM fornito con 10% FCS e 1% antibiotico antimicotico a 37 ° C con 5% CO2 in un'incubatrice di coltura cellulare.</li>
	<li>DMEM di aspirare e lavare le cellule una volta con live cell imaging medio (140 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 1mm MgCl2, 20mm HEPES, pH = 7,4, mOsm = 300; Vedi Tabella materiali) per 2 min e successivamente posizionare le cellule nel fresco imaging medio.</li>
</ol>
2. registrazione dei dati FLIM
<ol>
	<li>Posto n. 2 di campione sotto un microscopio confocale FLIM di dominio del tempo con una sorgente di eccitazione pulsato per il fluoroforo donatore (cioè, mCitrine) e acquisizione dati risolta nel tempo. Mantenere le cellule a 37 ° C con un piatto riscaldato. Nota: Il microscopio confocale utilizzato nel presente protocollo è dotato di un obiettivo a immersione in acqua NA 63 X 1,20, un laser a luce bianco (80 MHz pulsare, &#60; durata impulso 100 ps), un tubo di fotomoltiplicatore (PMT) di fotoni e un Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC ) sistema (Vedi Tabella materiali per installazione specifico utilizzato). Altri microscopi FLIM possono anche essere usato (ad es., diodi di valanga del singolo-fotone (SPAD) invece di PMTs, singolo-lunghezza d'onda laser pulsati invece di un laser pulsato a luce bianca).</li>
	<li>Selezionare una cella con espressione visibile della mCitrine e mCherry-etichettato proteine SNARE e registrare un'immagine confocale di 256 × 256 pixel con eccitazione simultanea dei due fluorofori prima di ogni misurazione di FLIM. Un passo del pixel di circa 2 volte più piccola di quanto la diffrazione limitata risoluzione spaziale del microscopio (~ 200 nm) dovrebbe essere usato. Per mCitrine, eccitare a 516 nm e raccogliere emissione da 521-565 nm; per mCherry, eccitare 610 nm e raccogliere emissione da 613-668 nm. Nota: Non non posizione l'imaging aereo troppo vicino alla parte inferiore del piatto (all'interno di ~ 2 µm di distanza), come questo si tradurrà in un picco di riflessione nell'istogramma di corso della vita di fluorescenza. Simultanea eccitazione del donatore e accettore fluorophores è preferito, come questo permette di superare il potenziale problema di movimento del campione. Tuttavia, eccitazione sequenziale può essere utilizzato come bene.</li>
	<li>Record registrata un'immagine FLIM facendo Eseguire FLIM con l'immagine FLIM registrata con le stesse dimensioni e la risoluzione spaziale dell'immagine confocale al punto 2.2. Registrare i fotoni immagine almeno 50.000 per analisi FLIM di cellule intere, o almeno 400 fotoni/pixel. Solo eccitare il fluoroforo donatore di mCitrine e non il fluoroforo accettore di mCherry e così eccitare 516 nm e raccogliere emissione da 521-565 nm.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 2.1-2.3 per più celle e per le altre campione n. 1 (solo donatore) e campione n. 3 (il costrutto di tandem mCitrine-mCherry).</li>
	<li>Registrare una funzione di risposta dello strumento (IRF). Sintonizzare il monocromatore del rivelatore di emissione alla lunghezza d'onda di eccitazione (ad esempio, registrare emissioni da 510-550 nm) e quindi registrare un'immagine FLIM con dispersione indietro da un vetrino coprioggetto vetro pulito facendo clic sul pulsante Esegui FLIM. Utilizzare la stessa lunghezza d'onda di eccitazione (516 nm) e laser di potenza come utilizzato per registrare i dati di cella a passi 2.1-2.4. Nota: Se picchi multipli sono visibili in IRF o se il monocromatori di emissione non possono essere ottimizzato, l'IRF può anche essere misurata con una soluzione di colorante fluorescente con durata ultraveloce, per esempio estiguendo fluorescenza di un colorante organico in una satura acquoso soluzione di ioduro di potassio. Inoltre, non è strettamente necessario per registrare un IRF, perché la pendenza di decadimento degli istogrammi fluorescenza può anche essere montata senza deconvoluzione dell'IRF. Tuttavia, un IRF consente di correggere per le caratteristiche di temporizzazione del rivelatore del fotone utilizzato e quindi rende gli accoppiamenti degli istogrammi durata più accurato.</li>
</ol>
3.Conversione delle registrazioni del fotone a FLIM immagini
<ol>
	<li>Scaricare e installare il software di conversione PT32ICS5. Nota: I dati di durata possono essere analizzati anche da altri software, tra cui software di diversi fornitori di microscopio.</li>
	<li>Configurare il software di PT32ICS.<ol>
		<li>Impostare la dimensione per dimensione 256 × 256 pixel tramite impostazioni | Dimensioni.</li>
		<li>Impostare il canale a 2 via impostazioni | Dimensioni. Nota: Il canale dell'emissione mCitrine dipende esclusivamente dalla configurazione del microscopio. Un canale sbagliato si tradurrà in un'immagine FLIM con nessun fotoni (cioè, nero immagine) e di conseguenza un vuoto 'LifetimeTable.txt'-file. Il canale corretto può essere identificato da trial-and-error.</li>
		<li>Impostare l'uscita di ImageJ (xyz) (o TRI2 (xyt)) per generare immagini FLIM (punto 3.4).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Premere convertire e caricare una o più tracce di fotone (file .pt3). Per selezionare più tracce di fotone, tenere premuto il tasto Ctrl . Nota: Il formato di .ptu 64 bit più recente può anche essere convertito.</li>
	<li>Assicurarsi che il software di PT32ICS genera i seguenti file nella stessa cartella dove vengono salvati i file pt3: uno stack di fotone per .pt3 traccia di fotone in formato di immagine cytometry standard (ICS), file di una bitmap per la traccia di .pt3 fotone (BMP), un file di testo per conversione (_Report.txt) contenente le informazioni sulle statistiche di fotone (cioè, il numero totale di fotoni in ogni traccia del fotone di .pt3, la risoluzione di tempo del rivelatore) e un secondo file di testo per conversione (_LifetimeTable.txt) contenente il totale istogrammi di corso della vita di fluorescenza in formato delimitato da tabulazioni per ogni traccia del fotone di .pt3. Nota: Il file con estensione ICS può essere utilizzato per singolo pixel montaggio al fine di generare immagini FLIM, per esempio con TRI2 software12,13 o la curva sottile montaggio libreria in FIJI ImageJ14,15. Questo file può anche essere utilizzato per fasore analisi16, per esempio con il plugin di tempo Gated fasore per FIJI da Spechron. Il file bitmap non contiene nessuna informazione di vita. Il secondo file di testo viene utilizzato per l'analisi FLIM di cellule intere nel passaggio 4.</li>
</ol>
4. raccordo di istogrammi di vita di fluorescenza per l'analisi di cellule intere FLIM
Nota: Questo passaggio (riconducibili raccordo dell'IRF) richiede software in grado di raccordo riconducibili. Le piste degli istogrammi fluorescenza senza deconvoluzione dell'IRF di montaggio può essere fatto con altri software, come pure.
<ol>
	<li>Aprire il programma di software analisi di dati in grado di montare con deconvoluzione (Tabella materiali) e importare il file di testo contenente l'istogramma per ogni traccia di fotone (_LifetimeTable.txt) via File | Importazione | Singola ASCII.</li>
	<li>Riorganizzare la tabella tale che l'IRF è nella seconda colonna della tabella (mediante copia e Incolla). Posizionare l'IRF nella seconda colonna B accanto ai valori di tempo nella prima colonna A.</li>
	<li>Determinare la qualità delle tracce registrate fotone selezionando tutte le colonne premendo Ctrl + A e selezionando trama | Multi-pannello | 9 pannello. Non analizzare le tracce di fotone con un picco di alta riflessione (Figura 4F).</li>
	<li>Selezionare tutte le colonne contenenti gli istogrammi di qualità controllata vita che saranno montati così come l'IRF nella colonna B usando Ctrl chiave e caricare il montaggio non lineare tramite analisi | Montaggio | Curva non lineare Fit | Aprire la finestra di dialogo.</li>
	<li>Caricare la funzione di forma deconvoluted (disponibile in 1 File supplementari) aggiungendo questa funzione al software di analisi (tramite categoria | Definito dall'utente | Funzione | Aggiungi). Selezionare il file di forma funzione 'FLIM_convoluted_IRF.fdf'. Questa funzione si inserisce gli istogrammi di corso della vita di fluorescenza con una funzione mono-esponenziale decadimento riconducibili con IRF (cioè, la seconda colonna B della tabella) (equazione 1): 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56745/56745eq1.jpg">(Equazione 1) con t il tempo, τ la fluorescenza apparente vita, all'ampiezza e il y0 l'offset. Nota: Un'altra opzione è per adattare gli istogrammi di vita con una funzione di forma bi-esponenziale (equazione 2): 
	<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56745/56745eq2.jpg">(Equazione 2) Fissando la durata del componente lenta (τ1) per l'unica condizione di donatore (punto 1.1.2: esempio n. 1) e che del componente veloce (τ2) per il costrutto di tandem (esempio n. 3), questo permette la stima della frazione di Proteine SNARE in complesso (F) le ampiezze del lento (A1) e dei componenti veloce (A2; si veda discussione; L'equazione 3): 
	<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56745/56745eq3.jpg">(Equazione 3) Il file di funzione adatta per montaggio bi-esponenziale riconducibili 'FLIM_convoluted_IRF_biexp.fdf' è disponibile in 2 File supplementari.</li>
	<li>Selezionare montato curve | X tipo di dati come stesso come dati di Input. Nota: Questo si tradurrà in appropriato x-scala degli assi delle curve componibile.</li>
	<li>Montare le curve premendo Fit. Nota: Questo convertirà la vestibilità e generare un 'foglio di relazione' nella matrice con una tabella contenente i corsi della vita di fluorescenza, offset e ampiezze. Genererà inoltre un foglio di dati con le curve di misura e i residui del fit.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jahn, R., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNAREs+-+engines+for+membrane+fusion.">SNAREs - engines for membrane fusion.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (9), 631-643 (2006).</li><li>Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNAREs+and+traffic.">SNAREs and traffic.</a> Biochim Biophys Acta. 1744 (2), 120-144 (2005).</li><li>van den Bogaart, G., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+the+SNAREs+needed+for+membrane+fusion.">Counting the SNAREs needed for membrane fusion.</a> J Mol Cell Biol. 3 (4), 204-205 (2011).</li><li>Bethani, I., Werner, A., Kadian, C., Geumann, U., Jahn, R., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+fusion+upon+SNARE+knockdown+is+maintained+by+residual+SNARE+activity+and+enhanced+docking.">Endosomal fusion upon SNARE knockdown is maintained by residual SNARE activity and enhanced docking.</a> Traffic. 10 (10), 1543-1559 (2009).</li><li>Verboogen, D. R. J., Gonz&#225;lez Mancha, N., Ter Beest, M., van den Bogaart, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+reveals+rerouting+of+SNARE+trafficking+driving+dendritic+cell+activation.">Fluorescence lifetime imaging microscopy reveals rerouting of SNARE trafficking driving dendritic cell activation.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Degtyar, V., Hafez, I. M., Bray, C., Zucker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dance+of+the+SNAREs:+assembly+and+rearrangements+detected+with+FRET+at+neuronal+synapses.">Dance of the SNAREs: assembly and rearrangements detected with FRET at neuronal synapses.</a> J Neurosci. 33 (13), 5507-5523 (2013).</li><li>Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+imaging.">FRET imaging.</a> Nat Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).</li><li>Wallrabe, H., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+protein+molecules+using+FRET+and+FLIM+microscopy.">Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy.</a> Curr Opin Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).</li><li>JoVE Science Education Database Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+Hemacytometer+to+Count+Cells.">Using a Hemacytometer to Count Cells.</a> JoVE. , (2017).</li><li>Thermo Fisher Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NEON transfection system cell protocols HeLa. , (2017).</li><li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell+transfection:+the+present+and+the+future.">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Anal Bioanal Chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li><li>Barber, P. R., Ameer-Beg, S. M., Gilbey, J. D., Edens, R. J., Ezike, I., Vojnovic, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+pixel+kinetic+data+analysis+for+FRET+detection+by+multi-photon+time-domain+FLIM.">Global and pixel kinetic data analysis for FRET detection by multi-photon time-domain FLIM.</a> Proc. SPIE. 5700, 171 (2005).</li><li>Barber, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+time-domain+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy:+practical+application+to+protein-protein+interactions+using+global+analysis.">Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis.</a> J R Soc Interface. 6 (Suppl 1), S93-S105 (2009).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Hinde, E., Digman, M. A., Welch, C., Hahn, K. M., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensor+F&#246;rster+resonance+energy+transfer+detection+by+the+phasor+approach+to+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy.">Biosensor F&#246;rster resonance energy transfer detection by the phasor approach to fluorescence lifetime imaging microscopy.</a> Microsc Res Tech. 75 (3), 271-281 (2012).</li><li>Stein, A., Weber, G., Wahl, M. C., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helical+extension+of+the+neuronal+SNARE+complex+into+the+membrane.">Helical extension of the neuronal SNARE complex into the membrane.</a> Nature. 460 (7254), 525-528 (2009).</li><li>Barstow, B., Ando, N., Kim, C. U., Gruner, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+citrine+structure+by+hydrostatic+pressure+explains+the+accompanying+spectral+shift.">Alteration of citrine structure by hydrostatic pressure explains the accompanying spectral shift.</a> PNAS. 105 (36), 13362-13366 (2008).</li><li>Shu, X., Shaner, N. C., Yarbrough, C. A., Tsien, R. Y., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+chromophores+and+buried+charges+control+color+in+mFruits.">Novel chromophores and buried charges control color in mFruits.</a> Biochemistry. 45 (32), 9639-9647 (2006).</li><li>Veale, K. J., Offenh&#228;user, C., Lei, N., Stanley, A. C., Stow, J. L., Murray, R. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VAMP3+regulates+podosome+organisation+in+macrophages+and+together+with+Stx4/SNAP23+mediates+adhesion,+cell+spreading+and+persistent+migration.">VAMP3 regulates podosome organisation in macrophages and together with Stx4/SNAP23 mediates adhesion, cell spreading and persistent migration.</a> Exp Cell Res. 317 (13), 1817-1829 (2011).</li><li>G&#243;mez-Jaramillo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syntaxin-4+is+implicated+in+the+secretion+of+antibodies+by+human+plasma+cells.">Syntaxin-4 is implicated in the secretion of antibodies by human plasma cells.</a> J Leukoc Biol. 95 (2), 305-312 (2014).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo protocollo viene illustrato l'utilizzo del FLIM in apprensione per la visualizzazione delle interazioni SNARE sintaxina 4 e VAMP3 in cellule HeLa vive. Sintaxina 4 è una proteina di Qa-rullante localizzare prevalentemente sulla membrana plasmatica dove media esocitosi1,2,20,21. VAMP3 è un R-rullante che principalmente è descritto per individuare a riciclare endosomal scomparti e media il traffico ad altri gli endosomi pure per quanto riguarda la membrana plasmatica1,2,20. Tuttavia, il dosaggio di FRET-FLIM può essere facilmente adattato per lo studio di altre proteine SNARE. L'unica condizione è che queste trappole contengono un'elica transmembrana del C-terminale, che è il caso per la maggior parte delle proteine SNARE da lontano1,2. Inoltre, il protocollo descritto qui può essere adattato per la visualizzazione dei complessi SNARE in qualsiasi tipo di cellula eucariotica, comprese piante e lievito. In questo protocollo, abbiamo usato l'accorciamento della vita di fluorescenza del fluoroforo donatore come una misura di FRET. Come un approccio complementare, della durata del fluoroforo accettore potrebbe essere esaminata, che fornisce la prova inequivocabile che trasferimento di energia di risonanza si verifica perché l'emissione sensibilizzato provoca una fase di netto aumento.
Attualmente, la tecnica FLIM FRET può non essere in grado di visualizzare complessi SNARE in compartimenti lisosomiale. Per il costrutto di 3-mCitrine-mCherry tandem sintaxina, la fluorescenza di mCherry si trovano spesso più accumulata in una zona di juxtanuclear, che probabilmente corrisponde ai compartimenti lisosomiale, considerando che il segnale di mCitrine è più abbondante nei cellulari periferia5. È stato osservato un accumulo di juxtanuclear simili di mCherry rispetto a mCitrine, quando le stesse proteine SNARE fuse a queste proteine fluorescenti erano co-espressi5. I lisosomi sono caratterizzati da un pH estremamente basso (&#60; 4) e un'elevata attività degli enzimi proteolitici. L'accumulo di juxtanuclear di mCherry è probabilmente causato da una maggiore resistenza del fluoroforo mCherry a degradazione lisosomiale rispetto al fluoroforo mCitrine. Non è a causa di pH-tempra di mCitrine, come juxtanuclear accumulo di mCherry si verifica anche al momento della fissazione delle cellule5. Così, la tecnica FRET-FLIM sottovaluta la quantità di apprensione nelle regioni juxtanuclear (lisosomiali) e questo richiederebbe altre proteine reporter fluorescenti che sopravvivono ai termini duri all'interno dei lumen dei lisosomi.
FRET-FLIM in linea di principio permette di ottenere una stima quantitativa (semi-) della frazione di insidie nel complesso5. Come abbiamo spiegato in questo protocollo, ciò richiede il montaggio degli istogrammi di corso della vita di fluorescenza con funzioni di decadimento doppio-esponenziale (equazione 2), dove l'ampiezza della componente veloce è proporzionale alla frazione di insidie nel complesso ( L'equazione 3). Tuttavia, tale accessorio con un modello bi-componente è tecnicamente impegnativo. Raccordo con più parametri di forma gratuiti (due corsi della vita di fluorescenza e due ampiezze) richiede un numero molto grande di fotoni, soprattutto perché i parametri influenzano a vicenda e piccoli errori nel corso della vita influenzerà le ampiezze e vice versa. Per superare questi problemi di montaggio, le durate di fluorescenza del componente lenta possono essere fissate per la durata della condizione unico donatore (cioè, non FRET; solo mCitrine presenti) e quella del componente veloce alla durata del tandem costruire ( massima si presenterebbe FRET). Tuttavia, questo dovrebbe anche essere interpretato con cautela, perché le durate di fluorescenza non possono essere lo stesso come in questi stati di controllo e potrebbero deviare a causa di diverse ragioni (self-tempra, orientamento del dipolo, variazioni nel microambiente). Più complessi SNARE nelle immediate vicinanze (&#60; 10 nm) può risultato in distanza-dipendente FRET, lo stesso principio che permette FRET essere utilizzato come un "righello molecolare", ma in questo caso, oscura la quantificazione di complessi SNARE. Inoltre, una stima quantitativa non è sempre significativa, perché le insidie con etichettate competono con endogeno SNAREs (senza etichetta). Di conseguenza, il livello di espressione di mCherry-labeled rullante è un determinante principale per la percentuale FRET5. A causa di tutti questi avvertimenti, si consiglia di montare gli istogrammi di vita fluorescente con una funzione di decadimento mono-esponenziale (equazione 1). Questo ha il vantaggio che non richiede alcuna conoscenza a priori dei tempi di vita e la vita fluorescente media apparente risultante fornisce una misura tinta per rullante complessanti5.
Tuttavia, si prevede che imaging FRET-FLIM quantitativo di modelli del due-componente raccordo avrà potenti applicazioni future. RULLANTE-codifica geni all'interno del cromosoma possono essere fuso con proteine reporter fluorescenti, ad esempio da CRISPR/CAS9. Questo provoca l'etichettatura fluorescente delle proteine SNARE endogene, con livelli di proteina endogena e senza sfondo delle insidie senza etichetta e quindi consente una stima quantitativa significativa della frazione di complessi SNARE di FRET-FLIM. Mentre i livelli di espressione delle insidie endogeni potrebbero essere piuttosto basso e dare relativamente basse segnali fluorescenti, si prevede che un numero sufficiente di fotoni possa essere ottenuto, soprattutto per l'intera cellula FLIM (che richiede solo pochi 1, 000s di fotoni). Inoltre, queste misurazioni FRET-FLIM possono essere eseguite con rivelatori di fotodiodo valanga più sensibili che comporterà anche i segnali di fluorescenza elevata e migliori statistiche di fotone.

Traffico di membrana è una caratteristica centrale delle cellule eucariotiche, dove vescicole di membrana bud fuori da un organello donatore e quindi spostarsi e fusibile con una destinazione organello1,2. Fatta eccezione per i mitocondri, tutti questi passaggi di fusione della membrana vengono catalizzati dai membri della proteina SNARE famiglia1,2. Famiglia delle proteine SNARE è costituito da circa 36 membri in cellule di mammiferi e circa 20 membri in lievito2. Proteine SNARE contengono uno o due ~ 52 residui-lungo, in modo nativo non strutturate aree denominate SNARE-motivi. Proteine SNARE sono spesso legati alle membrane di un C-terminale dell'elica del transmembrane1,2. Insidie possono essere classificati basato sui residui centrali che contribuiscono per il complesso SNARE in arginina (R) e glutammina (Q) insidie1,2. Fusione della membrana è guidato dall'interazione di 3 o 4 insidie cognate che insieme contribuiscono 4 SNARE-motivi e sono distribuiti sopra il donatore e accettore della membrana1,2. Un complesso SNARE è costituito da un motivo di R-rullante e tre motivi di Q-rullante (chiamati Qa, Qb e Qc). La formazione del complesso inizia alla N-termini di rullante-motivi, formando un cosiddetto trans-rullante-complessi e procede verso la C-termini, formando un fascio di arrotolato-arrotola α-elica stretto chiamato un cis-rullante-complesso. La formazione del complesso di persino un singolo complesso SNARE trascina le membrane donatore e accettore insieme e supera la barriera di energia per membrana fusion3.
Assegnazione di distinti complessi SNARE a vie di trasporto specifici all'interno delle cellule è spesso tecnicamente impegnativo. Sebbene insidie chiaramente contribuiscono alla specificità del traffico di membrane, sono promiscua, funzionalmente ridondanti e le loro funzioni si sovrappongono1,2. Per questo motivo, esperimenti di perturbazione targeting insidie, come per knockout del gene, l'interferenza del RNA, l'introduzione del blocco anticorpi o con frammenti di rullante solubili che agiscono come dominanti negativi, spesso non risultano in fenotipi chiari come gli altri Insidie compensano2,4. Inoltre, è difficile da differenziare passaggi fusione specifiche della membrana da eventi di traffici a Monte, perché insidie possono essere coinvolti in più percorsi di trasporto2. Studi di localizzazione delle insidie di approcci di microscopia, utilizzando immunolabeling o fusione genetica di proteine reporter fluorescenti, soffrono di problemi che: (i) insidie individuare al più organelli come mediano spesso più traffici passi e (ii) loro localizzazioni non significano automaticamente che funzionalmente sono impegnati nella formazione del complesso SNARE. Infine, complessi SNARE possono essere identificati mediante esperimenti di immunoprecipitazione utilizzando una delle insidie come esca e altre insidie come obiettivi, ma questo non consente l'assegnazione di questi complessi di organelli specifici o rotte del narcotraffico. Così, attualmente, non esiste nessuna tecnica alternativa per visualizzare complessi SNARE con risoluzione organellari. Immunofluorescenza non è in grado di dimostrare le interazioni di rullante, ma può mostrare solo la presenza o l'assenza di co-localizzazione, mentre immunoprecipitazione può mostrare solo rullante interazioni in tutta la popolazione di cella ma non assegnare gli organelli dove questi verificarsi di interazioni.
Per superare queste limitazioni, un nuovo metodo che consente la visualizzazione quantitativa dei complessi SNARE all'interno di cellule vive con risoluzione organellari recentemente è stato sviluppato da Verboogen et al. 5 questo metodo è basato sull'espressione di paia di lacci con proteine fluorescenti spettralmente spostate fuse C-terminale a loro eliche transmembrane. Dopo il completamento della fusione della membrana e la formazione di un cis-rullante complesso, questi fluorofori alla C-termini delle eliche transmembrane immediatamente vengono accostate a vicenda. I fluorofori sono quindi ben all'interno della distanza di Förster (in genere &#60; 5 nm), con conseguente FRET dal fluoroforo donatore verde-spostato al fluoroforo accettore rosso-spostato5,6. FRET risultati nell'estinzione del fluoroforo donatore e un'aumentata emissione del fluoroforo accettore che può essere misurato dai rapporti dell'emissione donatore e accettore (raziometrici FRET). Tuttavia, raziometrico FRET tra due diverse molecole è impegnativo, a causa di livelli di cross-talk e diversi di fluorescenza del donatore e accettore insidie a diversi organelli e tra cellule7,8. FRET può anche essere misurata dalla durata di fluorescenza, che è il tempo tra l'eccitazione e l'emissione di un fotone. Se il fluoroforo donatore può liberare la sua energia di FRET, questo risultato di processo concorrenti in un apparente accorciamento del ciclo di vita di fluorescenza. Ciò può essere misurata da FLIM7,8. Durata FRET è molto più robusto di raziometrici FRET per misurare le interazioni tra due molecole diverse, come la durata di fluorescenza è una proprietà intrinseca di un fluoroforo ed è insensibile alla sua concentrazione. Inoltre, FRET è da approssimazione quantitativa, perché l'efficienza della FRET è inversamente proporzionale alla sesta potenza della distanza tra il donatore e accettore fluorofori (essenzialmente una funzione di passaggio). Quindi, montando gli istogrammi di vita di fluorescenza registrati da FLIM con un modello di decadimento doppio componente, FRET-FLIM consente la stima quantitativa (semi-) della frazione di molecole di rullante impegnati, la formazione del complesso SNARE5.
Recentemente, è stato utilizzato questo metodo di FLIM FRET da Verboogen et al. per visualizzare la formazione del complesso SNARE in cellule dendritiche primarie del sistema immunitario5. È stato dimostrato che, incontrando uno stimolo patogeno, cellule dendritiche reindirizzare loro traffico di membrane accompagnato da un complessante aumentata della proteina di membrana della vescicola-collegata di R-rullante (VAMP) 3 con il Qa-SNARE sintaxina 4 specificamente alla membrana del plasma. Questa maggiore formazione del complesso SNARE è probabilmente necessaria per soddisfare la maggiore capacità secretiva per la secrezione di citochine infiammatorie quali l'interleuchina-65. Questo protocollo descrive le fasi sperimentali necessarie per l'acquisizione di FRET-FLIM dati per la visualizzazione e (semi-) misurazione quantitativa dei complessi SNARE.Viene spiegato come adattare gli istogrammi di vita di fluorescenza di cellule intere con mono - e bi-esponenziale funzioni di decadimento, conseguente la durata apparente fluorescenza come una stima quantitativa alle interazioni di rullante. In questo protocollo, la linea delle cellule HeLa ampiamente usato è utilizzata come esempio, ma il metodo può essere facilmente esteso per studiare complessi SNARE in altre cellule eucariotiche.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA &#39;syntaxin 4-mCitrine&#39;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>ID 92422</td>
			<td>Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA &#39;VAMP3-mCherry&#39;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>ID 92423</td>
			<td>Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA &#39;syntaxin 3-mCitrine-mCherry&#39;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>ID 92426</td>
			<td>Positive control for maximum achievable FRET.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hela cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes&#160;</td>
			<td>Willco Wells</td>
			<td>HBST-3522</td>
			<td>Other live cell imaging chambers will work as a substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>758093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic solution</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>Pen/Strep will work as a substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live cell imaging medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td>Any other live cell imaging solution will work, as long as fluorescence from the medium is prevented</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 confocal microscope with a 63x 1.20 NA water immersion objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8</td>
			<td>Other confocal microscopes capable of time-domain FLIM can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulsed white light laser</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8</td>
			<td>Other pulsed laser sources can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system</td>
			<td>PicoQuant</td>
			<td>PicoHarp 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PT32ICS conversion software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available at the &#39;Software&#39;-section of www.membranetrafficking.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data analysis software programme capable of deconvolution</td>
			<td>Originlabs</td>
			<td>OriginPro 2016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-made Fiji ImageJ macro for convolution of FLIM image with Intensity</td>
			<td>Fiji ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Available at the &#39;Software&#39;-section of www.membranetrafficking.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B&#252;rker Haemocytometer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>630-1541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC&#160;CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>B Braun Melsungen&#160; AG</td>
			<td>362 3140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 2 mM</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108417</td>
			<td>CAS: 60-00-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93595</td>
			<td>CAS: 72-57-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEON cell electroporation device</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MPK5000S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing intracellular snare trafficking by fluorescence lifetime imaging microscopy

Solubile N- ethylmaleimide sensibile della proteina (NSF) allegato proteina recettore (rullante) proteine di fusione sono la chiave per il traffico di membrana, come essi catalizzano la fusione della membrana all'interno delle cellule eucariotiche. Famiglia delle proteine SNARE è costituito da circa 36 diversi membri. Rotte di trasporto intracellulare specifico vengono catalizzate da specifici gruppi di 3 o 4 proteine SNARE che quindi contribuiscono alla specificità e fedeltà del traffico di membrana. Tuttavia, studiando la funzione precisa di proteine SNARE è tecnicamente impegnativo, perché le insidie sono molto abbondanti e funzionalmente ridondanti, con la maggior parte delle insidie avendo multipli e funzioni di sovrapposizione. In questo protocollo, è descritto un nuovo metodo per la visualizzazione della formazione del complesso SNARE in cellule vive. Questo metodo si basa su che esprimono le proteine SNARE C-terminale fuse a proteine fluorescenti e loro interazione di misura di energia di risonanza di Förster transfer (FRET) durata di fluorescenza impiegando imaging microscopia (FLIM). Montando gli istogrammi di corso della vita di fluorescenza con un modello di decadimento multicomponente, FRET-FLIM permette (semi-) stima quantitativa della frazione della formazione del complesso SNARE alle diverse vescicole. Questo protocollo è stato applicato con successo per prevedere la formazione del complesso SNARE alla membrana del plasma e alle endosomal scomparti in linee cellulari di mammifero e cellule del sistema immunitario primarie e può essere facilmente esteso per studiare funzioni rullante presso altri organelli in animale, pianta e cellule fungine.

La spiegazione razionale del dosaggio per interazioni di rullante di FRET-FLIM di misura è illustrato nella Figura 1. La C-termini delle eliche transmembrane delle proteine SNARE cognate sono fusi a una coppia di proteine fluorescenti spettralmente spostate (ad es., mCitrine e mCherry). La formazione di un cis-rullante complesso sopra i risultati di fusione della membrana in queste proteine fluorescenti diventando immediatamente giustapposti a vicenda e FRET. La figura 2 Mostra immagini confocal rappresentative delle cellule HeLa esprimendo fluorescente etichettato proteine SNARE. Mostrato una cella esprimono la sintaxina 4-mCitrine (fluoroforo donatore) con VAMP3-mCherry (fluoroforo accettore), così come le condizioni di controllo delle cellule che esprimono solo la sintaxina 4-mCitrine costrutto (donatore solo; non FRET) e sintaxina 3 fuso a entrambi mCitrine e mCherry in tandem (maximal expectable FRET). La figura 3 Mostra l'accompagnamento fluorescenza durata e immagini FLIM generati inserendo gli istogrammi di corso della vita di ogni pixel con funzioni di decadimento mono-esponenziale (Figura 3A–B) e funzioni (decadimento bi-esponenziale Figura 3 - D). Figura 4A Mostra l'IRF della nostra impostazione misurato dallo scattering posteriore di un vetro di copertura del microscopio. In Figura 4B–E, istogrammi vita fluorescenza rappresentativo della cella intera analisi FLIM con accompagnamento fit curve per funzioni di decadimento mono-esponenziale sono illustrate. 4F figura viene illustrato un istogramma di vita fluorescente di un esperimento imaged troppo vicino alla superficie del vetro di copertura microscopio, risultante in un picco prominente riflessione. Figura 4 Mostra un istogramma di vita con il rappresentante in forma con una funzione di decadimento bi-esponenziale.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56745/56745fig1.jpg"> 
Figura 1: schema della logica per la visualizzazione di complessi SNARE di FRET. (A) modello strutturale della proteina di membrana della vescicola-collegata di insidie (proteina database 3HD717) (VAMP) 2 neuronale (blu; R), sintaxina 1 (rosso; Qa-SNARE) e SNAP25 (verde; contiene sia un motivo di Qb - e Qc-rullante). Il C-terminale dell'elica del transmembrane di sintaxina-1 è coniugato a mCitrine (fluoroforo donatore; proteina database 3DQ118). Il C-terminale dell'elica del transmembrane di VAMP2 è coniugato a mCherry (fluoroforo accettore; proteina database 2H5Q19). (B) schema di rullante mediata fusione della membrana con conseguente FRET. Dopo la fusione della membrana dalla formazione di un cis-complesso SNARE, le insidie sono giustapposti immediatamente a vicenda conseguente FRET. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56745/56745fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56745/56745fig2.jpg"> 
Figura 2: espressione di proteine SNARE fusa a proteine fluorescenti. Prima colonna: fluoroforo donatore, eccitato a 516 nm. Seconda colonna: fluoroforo accettore, eccitato a 610 nm. (A) donatore unica condizione. Confocale immagine rappresentativa di una cella di HeLa esprimendo la sintaxina 4-mCitrine (fluoroforo donatore; verde nell'Unione). Il canale di accettore (seconda colonna) Mostra il cross-talk di fluorescenza. (B) controllo negativo (nessun tasto). Confocale immagine rappresentativa di una cella di HeLa esprimendo entrambi sintaxina 4-mCitrine con VAMP3-mCherry (fluoroforo accettore; magenta a merge). (C) controllo positivo (maximal expectable FRET). Immagine rappresentativa confocal di una cella di HeLa esprimendo il tandem 3-mCitrine-mCherry sintaxina costruire. Si noti che il segnale di fluorescenza del mCitrine e mCherry segnali non aderisce più sovrapposizione, probabilmente a causa di una minore resistenza di mCitrine a degradazione lisosomiale rispetto al mCherry (Vedi sezione discussione). BF: campo luminoso. Scala bar, 20 µm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56745/56745fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56745/56745fig3.jpg"> 
Figura 3: immagini FLIM di formazione del complesso SNARE. (A) immagini di vita di fluorescenza rappresentativo delle cellule illustrate nella Figura 2. Le immagini sono state generate da prima convertire le tracce di fotone registrate da un sistema TCSPC (.pt3) per l'immagine cytometry standard (con estensione ICS) utilizzando il software PT32ICS. Singolo pixel montato vita di fluorescenza immagini poi sono stati generati utilizzando il software TRI212,13 con soglia da 15-100% di intensità, 7 circolare Pixelbinning e monoexponential algoritmo di adattamento (Marquardt). Il colore indica la durata media di fluorescente apparente. (B), FLIM immagini dove le immagini di vita di fluorescenza (mostrato nel pannello A) erano contorto con l'intensità di fluorescenza del fluoroforo donatore di mCitrine (illustrato nella Figura 2). La convoluzione è stata effettuata con FIJI ImageJ utilizzando una macro su ordine (Vedi Tabella materiali). (C) durata di fluorescenza e FLIM immagini della cellula HeLa che esprimono sia sintaxina 4-mCitrine e VAMP3-mCherry da pannelli A-B, ma ora con raccordo con curve di decadimento bi-esponenziale (con vite fissate le condizioni di controllo; vedere passo in 4,4 Protocol). I colori dei pixel indicano le frazioni stimate F di sintaxina 4 in complesso con VAMP3 (equazione 3). (D) come pannello B, ma per il bi-esponenziale in forma. La convoluzione è stata effettuata con FIJI ImageJ utilizzando una macro su ordine (Vedi Tabella materiali). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56745/56745fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56745/56745fig4.jpg"> 
Figura 4: cellula intera analisi FLIM. (A) la funzione di risposta dello strumento (IRF) del programma di installazione. L'IRF è stata misurata utilizzando la dispersione indietro sull'interfaccia vetro-acqua (usando un piatto di microscopia di vetro pulito contenente acqua).(B–E) Complesso delle cellule gli istogrammi di vita per le cellule mostrate in Figura 2 e Figura 3. Sono stati riuniti tutti i fotoni presenti nelle immagini. Le curve erano riconducibili con IRF e dotate di funzioni di decadimento mono-esponenziale (equazione 1). Per queste cellule, i corsi della vita di fluorescenza sono stati ottenuti di 2,82 ns (le cellule che esprimono solo sintaxina 4-mCitrine; donatore solo; pannello B), 2,09 ns (cellule cheesprimono sintaxina 4-mCitrine con VAMP3-mCherry; pannello C) e 2,08 ns (le cellule che esprimono la sintaxina 3 - mCitrine-mCherry tandem costruire; controllo FRET expectable massimale; pannello D). Gli intarsi Visualizza i grafici stessi, ma ora con scala logaritmica dell'asse y. Pannello E Mostra una sovrapposizione delle curve di decadimento dei pannelli B-D. (F) esempio di un istogramma di vita fluorescente registrato troppo vicino alla superficie del microscopio vetrini coprioggetto. Ciò provoca un picco di grande riflessione (raffigurato dall'area gialla ombreggiata). (G) stessa pannello C, ma ora opportuno con una curva di decadimento bi-esponenziale con vite fissa le condizioni di controllo (vedere punto 4.4 nel protocollo). Le ampiezze di digiuno (A1) e lento (A2) componenti erano 14,42 e 0,01, rispettivamente, risultante in una frazione di stimato di insidie nel complesso F di 0,99 (equazione 3). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56745/56745fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
File supplementari 1. Funzione file FLIM_convoluted_IRF <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56745/FLIM_convoluted_IRF.FDF">per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 2. Funzione file FLIM_convoluted_IRF_biexp <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56745/FLIM_convoluted_IRF_biexp.FDF">per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy at JoVE.com

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Questo protocollo descrive un nuovo metodo che consente la visualizzazione quantitativa della formazione di complessi di proteine SNARE, basato sul trasferimento di energia per risonanza e la durata di fluorescenza imaging microscopia.

Visualizing intracellulare rullante traffico da fluorescenza Lifetime Imaging microscopia

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

visualizing-intracellular-snare-trafficking-fluorescence-lifetime

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Immunology and Infection

Unit 1

Cell Membrane Structure and Functions

SCIENTISTS IN ACTION

9.4K Views.  Radboud University Medical Center. Questo protocollo descrive un nuovo metodo che consente la visualizzazione quantitativa della formazione di complessi di proteine SNARE, basato sul trasferimento di energia per risonanza e la durata di fluorescenza imaging microscopia.

Video: Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &alpha;-actinin by Confocal Imaging

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an effective invasin for human epithelial and endothelial cells. We have identified endothelial surface-located integrins as major receptors for Opc, a process which requires Opc to first bind to integrin ligands such as vitronectin and via these to the cell-expressed receptors1. This process leads to bacterial invasion of endothelial cells2. More recently, we observed an interaction of Opc with a 100kDa protein found in whole cell lysates of human cells3. We initially observed this interaction when host cell proteins separated by electrophoresis and blotted on to nitrocellulose were overlaid with Opc-expressing Nm. The interaction was direct and did not involve intermediate molecules. By mass spectrometry, we established the identity of the protein as &alpha;-actinin. As no surface expressed &alpha;-actinin was found on any of the eight cell lines examined, and as Opc interactions with endothelial cells in the presence of serum lead to bacterial entry into the target cells, we examined the possibility of the two proteins interacting intracellularly. For this, cultured human brain microvascular endothelial cells (HBMECs) were infected with Opc-expressing Nm for extended periods and the locations of internalised bacteria and &alpha;-actinin were examined by confocal microscopy. We observed time-dependent increase in colocalisation of Nm with the cytoskeletal protein, which was considerable after an eight hour period of bacterial internalisation. In addition, the use of quantitative imaging software enabled us to obtain a relative measure of the colocalisation of Nm with &alpha;-actinin and other cytoskeletal proteins. Here we present a protocol for visualisation and quantification of the colocalisation of the bacterium with intracellular proteins after bacterial entry into human endothelial cells, although the procedure is also applicable to human epithelial cells.

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &#945;-actinin by Confocal Imaging

Neisseria meningitidis (Nm), a gram negative human-specific respiratory pathogen, can bind to human &alpha;-actinin. Here we present a protocol for visualisation of colocalisation of the bacterium with intracellular &alpha;-actinin after bacterial entry into human brain microvascular endothelial cells (HBMECs).

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Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) such investigations can take several days1,2 and are therefore not suited for a rapid diagnosis of plant virus diseases. Microwave fixation can be used to drastically reduce sample preparation time for TEM investigations with similar ultrastructural results as observed after conventionally sample preparation3-5. Many different custom made microwave devices are currently available which can be used for the successful fixation and embedding of biological samples for TEM investigations5-8. In this study we demonstrate on Tobacco Mosaic Virus (TMV) infected Nicotiana tabacum plants that it is possible to diagnose ultrastructural alterations in leaves in about half a day by using microwave assisted sample preparation for TEM. We have chosen to perform this study with a commercially available microwave device as it performs sample preparation almost fully automatically5 in contrast to the other available devices where many steps still have to be performed manually6-8 and are therefore more time and labor consuming. As sample preparation is performed fully automatically negative staining of viral particles in the sap of the remaining TMV-infected leaves and the following examination of ultrastructure and size can be performed during fixation and embedding.

This study describes a method that allows the rapid and clear diagnosis of plant virus diseases in about half a day by using a combination of microwave assisted plant sample preparation for transmission electron microscopy and negative staining methods.

Forno a microonde Assist diagnosi rapida di malattie virali piante da microscopia elettronica a trasmissione

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Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

Misure singole cellule di Rottura Vacuolar causate da patogeni intracellulari

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target cells. Inside the host cell the effector proteins manipulate cellular functions to the benefit of the bacteria. To better understand the control of type III secretion during host cell interaction, sensitive and accurate assays to measure translocation are required. We here describe the application of an assay based on the fusion of a Yersinia enterocolitica effector protein fragment (Yersinia outer protein; YopE) with TEM-1 beta-lactamase for quantitative analysis of translocation. The assay relies on cleavage of a cell permeant FRET dye (CCF4/AM) by translocated beta-lactamase fusion. After cleavage of the cephalosporin core of CCF4 by the beta-lactamase, FRET from coumarin to fluorescein is disrupted and excitation of the coumarin moiety leads to blue fluorescence emission. Different applications of this method have been described in the literature highlighting its versatility. The method allows for analysis of translocation in vitro and also in in vivo, e.g., in a mouse model. Detection of the fluorescence signals can be performed using plate readers, FACS analysis or fluorescence microscopy. In the setup described here, in vitro translocation of effector fusions into HeLa cells by different Yersinia mutants is monitored by laser scanning microscopy. Recording intracellular conversion of the FRET reporter by the beta-lactamase effector fusion in real-time provides robust quantitative results. We here show exemplary data, demonstrating increased translocation by a Y. enterocolitica YopE mutant compared to the wild type strain.

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

Analisi di<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effector traslocazione in cellule ospiti Utilizzando beta-lattamasi Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Imaging neutrofili e monociti in mesenterica Veins intravitale Microscopia su topi anestetizzati in tempo reale

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or neutralize the ingested material, or to present it as antigens and initiate adaptive immune responses. The pH of phagosomes is a critical parameter regulating fission or fusion with endomembranes and activation of proteolytic enzymes, events that allow the phagocytic vacuole to mature into a degradative organelle. In addition, translocation of H+ is required for the production of high levels of reactive oxygen species (ROS), which are essential for efficient killing and signaling to other host tissues. Many intracellular pathogens subvert phagocytic killing by limiting phagosomal acidification, highlighting the importance of pH in phagosome biology. Here we describe a ratiometric method for measuring phagosomal pH in neutrophils using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled zymosan as phagocytic targets, and live-cell imaging. The assay is based on the fluorescence properties of FITC, which is quenched by acidic pH when excited at 490 nm but not when excited at 440 nm, allowing quantification of a pH-dependent ratio, rather than absolute fluorescence, of a single dye. A detailed protocol for performing in situ dye calibration and conversion of ratio to real pH values is also provided. Single-dye ratiometric methods are generally considered superior to single wavelength or dual-dye pseudo-ratiometric protocols, as they are less sensitive to perturbations such as bleaching, focus changes, laser variations, and uneven labeling, which distort the measured signal. This method can be easily modified to measure pH in other phagocytic cell types, and zymosan can be replaced by any other amine-containing particle, from inert beads to living microorganisms. Finally, this method can be adapted to make use of other fluorescent probes sensitive to different pH ranges or other phagosomal activities, making it a generalized protocol for the functional imaging of phagosomes.

Phagosomal pH influences phagosome maturation, oxidant production, phagosomal killing as well as antigen presentation. Here we describe a ratiometric method for measuring time-course and endpoint pH changes in individual phagosomes in living phagocytes using fluorescence microscopy.

Misurare phagosome pH Raziometrico microscopia a fluorescenza

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo fluorescence optical imaging (OI), in two different mouse models of inflammation: a rheumatoid arthritis (RA) and a contact hypersensitivity reaction (CHR) model. Light with a wavelength in the near infrared (NIR) window (650 - 950 nm) allows a deeper tissue penetration and minimal signal absorption compared to wavelengths below 650 nm. The major advantages using fluorescence OI is that it is cheap, fast and easy to implement in different animal models.
Activatable fluorescent probes are optically silent in their inactivated states, but become highly fluorescent when activated by a protease. Activated MMPs lead to tissue destruction and play an important role for disease progression in delayed-type hypersensitivity reactions (DTHRs) such as RA and CHR. Furthermore, MMPs are the key proteases for cartilage and bone degradation and are induced by macrophages, fibroblasts and chondrocytes in response to pro-inflammatory cytokines. Here we use a probe that is activated by the key MMPs like MMP-2, -3, -9 and -13 and describe an imaging protocol for near infrared fluorescence OI of MMP activity in RA and control mice 6 days after disease induction as well as in mice with acute (1x challenge) and chronic (5x challenge) CHR on the right ear compared to healthy ears.

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

This paper explains the application of fluorescent imaging using an activatable optical imaging probe to visualize the in vivo activity of key matrix metalloproteinases in two different experimental models of inflammation.

Non invasivo<em&gt; In Vivo</em&gt; Fluorescenza ottica di imaging dell&#39;attività MMP infiammatoria utilizzando un agente fluorescente di imaging attivo

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte cell culture and 64Cu-antibody receptor targeting of the cells. In vitro evaluation of the radiolabel and non-invasive in vivo cell tracking in an animal model of an airway delayed-type hypersensitivity reaction (DTHR) by PET/CT are described.
In detail, the conjugation of a mAb with the chelator 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA) is shown. Following the production of radioactive 64Cu, radiolabeling of the DOTA-conjugated mAb is described. Next, the expansion of chicken ovalbumin (cOVA)-specific CD4+ interferon (IFN)-&#947;-producing T helper cells (cOVA-TH1) and the subsequent radiolabeling of the cOVA-TH1 cells are depicted. Various in vitro techniques are presented to evaluate the effects of 64Cu-radiolabeling on the cells, such as the determination of cell viability by trypan blue exclusion, the staining for apoptosis with Annexin V for flow cytometry, and the assessment of functionality by IFN-&#947; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Furthermore, the determination of the radioactive uptake into the cells and the labeling stability are described in detail. This protocol further describes how to perform cell tracking studies in an animal model for an airway DTHR and, therefore, the induction of cOVA-induced acute airway DHTR in BALB/c mice is included. Finally, a robust PET/CT workflow including image acquisition, reconstruction, and analysis is presented.
The 64Cu-antibody receptor targeting approach with subsequent receptor internalization provides high specificity and stability, reduced cellular toxicity, and low efflux rates compared to common PET-tracers for cell labeling, e.g.64Cu-pyruvaldehyde bis(N4-methylthiosemicarbazone) (64Cu-PTSM). Finally, our approach enables non-invasive in vivo cell tracking by PET/CT with an optimal signal-to-background ratio for 48 h. This experimental approach can be transferred to different animal models and cell types with membrane-bound receptors that are internalized.

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Following the preparation of a 64Cu-modified monoclonal antibody binding to a transgenic murine T cell receptor, T cells are radiolabeled in vivo, analyzed for viability, functionality, labeling stability and apoptosis, and adoptively transferred into mice with an airway delayed-type hypersensitivity reaction for non-invasive imaging by positron emission tomography/computed tomography (PET/CT).

Murino linfociti Etichettatura da<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-anticorpo recettore Targeting per<em&gt; In Vivo</em&gt; Cell Traffico da PET / CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal microscopy methods to visualize macrophage extracellular traps (METs). These extracellular traps are defined by the presence of extracellular chromatin with co-expression of other components such as granule proteases, citrullinated histones, and peptidyl arginase deiminase (PAD). The expression of METs is generally measured after exposure to a stimulus and compared to un-stimulated samples. Samples are also included for background and isotype control. Cells are analyzed using well-defined image analysis software. Confocal microscopy may be used to define the presence of METs both in vitro and in vivo in lung tissue.

Macrophage extracellular traps are a newly described entity. This article will concentrate on confocal microscopy methods and how they are visualized in vitro and in vivo from lung samples.

Visualizzazione del macrofago trappole extracellulari mediante microscopia confocale

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking

Populational analyses of the morphological and functional alteration of endocytic proteins are challenging due to the demand of image capture at a single cell level and statistical image analysis at a populational level. To overcome this difficulty, we used imaging flow cytometry and transcriptomic profiling (RNA-seq) to determine altered subcellular localization of the cluster of differentiation 1d protein (CD1d) associated with impaired endocytic gene expression in human dendritic cells (DCs), which were exposed to the common lipophilic air pollutant benzo[a]pyrene. The colocalization of CD1d and endocytic marker Lamp1 proteins from thousands of cell images captured with imaging flow cytometry was analyzed using IDEAS and ImageJ-Fiji programs. Numerous cellular images with co-stained CD1d and Lamp1 proteins were visualized after gating on CD1d+Lamp1+ DCs using IDEAS. The enhanced CD1d and Lamp1 colocalization upon BaP exposure was further demonstrated using thresholded scatterplots, tested with Mander&#39;s coefficients for co-localized intensity, and plotted based on the percentage of co-localized areas using ImageJ-Fiji. Our data provide an advantageous instrumental and bioinformatic approach to measure protein colocalization at both single and populational cellular levels, supporting an impaired functional outcome of transcriptomic alteration in pollutant-exposed human DCs.

Imaging flow cytometry provides an ideal approach to detect the morphological and functional alteration of cells at individual and populational levels. Disrupted endocytic function for lipid antigen presentation in pollutant-exposed human dendritic cells was demonstrated with a combined transcriptomic profiling of gene expression and morphological demonstration of protein trafficking.

Integrare la citometria a flusso di Imaging e trascrittomica profilatura per valutare alterata CD1d endocitico traffico

Populational analyses of the morphological and functional alteration of endocytic proteins are challenging due to the demand of image capture at a single ...