Questa ricerca è stata finanziata dal fondo di avvio della Simon Fraser University.

1. Harvest Membrane <ol><li> Aggiungere tampone ipotonico (10 mM Tris-HCl, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, pH 8,0) con cocktail inibitore di proteasi su un pellet di cellule (~ 10 8 cellule) e incubare per 15-30 min in ghiaccio. Lisare le cellule di passare il campione attraverso aghi da siringa (5-10 passaggi) o omogeneizzare il campione da un omogeneizzatore Dounce (15-30 colpi). Utilizzare un emocitometro e trypan colorazione blu per controllare l&#39;efficienza della lisi. </li><li> Ottenere la frazione microsomiale da una centrifugazione differenziale del lisato a 3.000 gx 15 min e poi a 100.000 gx 2 hr. La prima centrifugazione ottiene un pellet che è la frazione nucleare, e la successiva centrifugazione del supernatante genera una seconda pellet, che è la frazione microsomiale che contiene la membrana plasmatica e membrana organelli 8. Il supernatante finale è la frazione citosolica. Conservare le frazioni microsomiali a -80 ° C freezer per ulteriori analysè come di seguito indicato. </li></ol> 2. Sciogliere, Denaturare, e digerire proteine ​​di membrana <ol><li> Sciogliere la frazione microsomiale nel buffer di denaturazione (Tris 40 mM, EDTA 10 mM, TCEP 10 mM, 0,5% Rapigest, pH 8) e poi incubare la soluzione a 100 ° C per 10 min. </li><li> Raffreddare la soluzione riscaldata a temperatura ambiente, aggiungere ultra-elevata purezza urea polvere nella soluzione 8 M concentrazione finale e incubare il campione a 37 ° C per 30 min. </li><li> Aggiungere iodoacetamide soluzione madre al campione di 15 mM concentrazione finale, e incubare la soluzione al buio per 30 minuti a temperatura ambiente per alchilare i tioli liberi nel campione. Aggiungere soluzione madre DTT al campione a una concentrazione finale 10 mM e incubare la soluzione per altri 10 min a temperatura ambiente per estinguere l&#39;eccessiva iodoacetamide. </li><li> Diluire la soluzione 10x ottenuto con tampone Tris 40 mM a pH 8, e successivamente aggiungere tripsina al campione con un rapporto 1:20 trypsin di proteine ​​totali. Mantenere la reazione di digestione a 37 ° C per una notte forno per garantire la reazione è completa. </li><li> Terminare la digestione acidificando la soluzione del campione a pH 1 con HCl, una condizione che rompe anche il detersivo, cioè Rapigest. Degradare la Rapigest a 37 ° C per 1 ora, e rimuovere la precipitazione sviluppato da centrifugazione. </li><li> Pulire il surnatante contenente peptidi campione da una cartuccia di estrazione C-18 in fase solida (SPE) e asciugare il campione ottenuto da speedvac. </li><li> Effettuare una analisi SDS-PAGE di campioni prima e dopo digestione con tripsina per confermare l&#39;efficienza digestione. </li></ol> 3. Glycopeptide Capture <ol><li> Sciogliere i peptidi puliti nel buffer di accoppiamento (acetato di sodio 100 mM, pH 5,5). Aggiungere periodato di sodio nella soluzione peptide ad una concentrazione finale di 10 mM per 30 minuti al buio, a temperatura ambiente. Questo si ossida i gruppi cis-diolo nei glicani ad aldeidi, Che permettono ai glicani ad accoppiarsi con la resina attraverso la chimica idrazide. Quench l&#39;eccessiva periodato da solfito di sodio ad una concentrazione finale di 20 mM e pH 5 per 10 min a temperatura ambiente. </li><li> Introdurre resina idrazide derivatizzato nella soluzione peptide ad un rapporto di 1:4 (resina di soluzione) per accoppiare glicopeptidi alla resina. Incubare la reazione a 37 ° C per 1-2 giorni con rotazione end-to-end per l&#39;accoppiamento completo. </li><li> Rimuovere i peptidi non legati mediante lavaggio della resina due volte con 1 ml di ciascuno dei seguenti: acqua deionizzata, 1,5 M NaCl, metanolo e 80% acetonitrile. Infine, lavare la resina con 3x 1 ml di 100 mM NH 4 HCO 3 a pH 8 per scambiare il buffer del sistema a 100 mM NH 4 HCO 3. <ol><li> Raccogliere il surnatante e lavaggi per l&#39;analisi dei peptidi non legati (opzionale). </li></ol></li><li> Rilasciare N-glicopeptidi dalla resina mediante PNGase F in una notte di incubazione a 37 ° C con unn end-to-end di rotazione. Raccogliere i peptidi rilasciati da centrifugazione e lavaggio acetonitrile 80%. Essiccare la soluzione ottenuta nello speedvac per l&#39;analisi LC-MS. </li></ol> 4. Ulteriore frazionamento (facoltativo) Per semplificare ulteriormente la complessità dei campioni, frazionare N-glicopeptidi ottenuti. Ad esempio, i peptidi ridisciogliere secchi in 10 mM ammonio formiato, pH 3 con 20% acetonitrile e utilizzare forte scambio cationico (SCX) cromatografia di frazionare i peptidi. Essiccare il eluente ottenuto, e quindi analizzare le frazioni peptidiche ottenute dalla fase inversa LC-MS 8,17,18. 5. Pulizia di N-glicopeptidi Rilasciato (facoltativo) Se preoccupazioni aumentano per il potenziale contaminazione dei peptidi, scioglierla peptidi secchi in 0,1% di acido formico e utilizzare una colonna MCX SPE per pulire ulteriormente i peptidi prima fase inversa analisi LC-MS. <strong&gt; Nota: parametri di ricerca del database. Durante la scissione selettiva di N-glicopeptidi largo della resina, PNGase F converte l&#39;asparagina collegato N-glicani di un acido aspartico. Pertanto, vi è una massa 0,9840 Da spostamento dei liberate N-glicopeptidi. Per identificare accuratamente questi peptidi, questa modifica deve essere aggiunto ai parametri di ricerca insieme con modifiche comuni come il carbamidometilazione della cisteina e ossidazione della metionina.

<ol>
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N., Roepstorff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+strategy+for+identification+of+N-glycosylated+proteins+and+unambiguous+assignment+of+their+glycosylation+sites+using+HILIC+enrichment+and+partial+deglycosylation.">A new strategy for identification of N-glycosylated proteins and unambiguous assignment of their glycosylation sites using HILIC enrichment and partial deglycosylation.</a> J Proteome Res. 3, 556-566 (2004).</li><li>Bond, M. R., Kohler, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+methods+for+glycoprotein+discovery.">Chemical methods for glycoprotein discovery.</a> Current opinion in chemical biology. 11, 52-58 (2007).</li><li>Pasini, E. 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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Qui vi presentiamo una strategia glicopeptide-capture per il profiling di proteine ​​della superficie cellulare. Il metodo può essere applicato per studiare le proteine ​​secrete, come quelle presenti nel sangue, così come in altri fluidi corporei o in cellule di coltura. Il successo del metodo si basa sulla digestione completa di campioni; Pertanto, una caratterizzazione SDS-PAGE dell&#39;efficienza digestione è necessario, in particolare per l&#39;analisi prima volta di un campione. Un digestione completa può essere difficile per proteine ​​di membrana, e può essere possibile solo dopo solubilizzazione completa della frazione di membrana. Il processo di solubilizzazione inizia quando viene introdotto il detersivo e termina dopo l&#39;incubazione di urea. Pertanto, se nuvolosità presenta nel campione prima dell&#39;aggiunta di urea ma scompare dopo urea incubazione, la solubilizzazione è sufficiente. Se la frazione di membrana è difficile da sciogliere, aumentare la quantità di detersivo utilizzato. Per i campioni di tessuto ricco di membranaquali i tessuti cerebrali e adiposi, 5% Rapigest può essere utilizzato. A volte, precipitazione può apparire durante la diluizione dei campioni prima della digestione tripsina, che è più frequentemente osservate in campioni di siero umano. La causa di questa precipitazione è principalmente le riduzione delle concentrazioni di urea e detergente. Questa precipitazione sarà generalmente rimosso dalla tripsina durante la digestione e non è una preoccupazione. Tuttavia, quando le forme di precipitazione, è importante ruotare la fiala del campione durante la fase di digestione per assicurare una buona miscelazione. Il pH della fase glycocapture è importante perché le ammine primarie peptidi, come quelli da N-terminali e lisine, reagiscono con le aldeidi neoformati dopo l&#39;ossidazione periodato. Pertanto, è importante protonare queste ammine regolando il pH della soluzione cattura di sotto di 6,0 utilizzando tampone acetato, per evitare che interferisca con la cattura. Utilizzando un rapporto di resina per catturare una soluzionetondo 1:03-01:04 assicura miscelazione sufficiente durante la fase di acquisizione. È necessario sulla base della nostra esperienza un minimo di 50 ml di resina; quantitativi inferiori renderanno la successiva serie di lavaggi difficili da eseguire e introdurranno perdita campione grave a causa della perdita di resina. Abbiamo ottenuto buoni risultati con 100-300 ml di resina di 0,5-2 mg di proteine ​​totali. Tuttavia, il rapporto tra la quantità di proteine ​​e resina può essere di esempio dipendente, ti consigliamo di ottimizzare questa condizione per i vostri campioni e applicazioni specifiche. La chimica hydrazide cattura entrambi gli O-e glicopeptidi N-linked sul substrato; a causa della mancanza di un enzima efficace per rilasciare tutti i glicopeptidi O-linked, abbiamo usato solo PNGase F per studi N-glicopeptidi 8,12. La possibilità di studiare il O-tipo di glicopeptidi può richiedere la scoperta o bioingegneria di idrolasi appropriati. Questo metodo può essere messo in pausa in vari placci compresi: 1) dopo aver ottenuto la frazione di membrana, 2) dopo digestione con tripsina e pulizia dei peptidi, e 3) dopo liberazione di N-glicopeptidi. Ulteriori procedure potranno essere introdotte in questi intervalli. Ad esempio, i peptidi digeriti possono essere differenzialmente etichettati da N-isotags come indicato nella figura 1, per l&#39;analisi quantitativa. Utilizzando un metodo chiamato gagQP, in cui i peptidi non modificati vengono analizzati in parallelo con i glicopeptidi, la precisione di quantificazione può essere significativamente migliorata come abbiamo dimostrato in una recente pubblicazione 18. Glicopeptide cattura si può efficacemente diminuire la complessità dei campioni, e non è generalmente necessario frazionare ulteriormente le arricchita N-glicopeptidi. Le eccezioni si applicano a situazioni in cui i campioni sono abbondanti, ma con dinamiche di concentrazione consistenti, e le proteine ​​di interesse sono in condizioni di scarsa abbondanza, come nella scoperta dei biomarcatori proteici sangue oper l&#39;elenco completo di proteine ​​di superficie cellulare. In queste circostanze ulteriore frazionamento può essere implementata per N-glicopeptidi catturati per fornire una migliore penetrazione del glycoproteome. Poiché il fondo del glycoproteome viene affrontato attraverso frazionamento, l&#39;identificazione dei non glicopeptidi introdotte dal legame non specifico aumenterà. Un decremento di glicopeptidi e selettività glicoproteina (a ~ 85%) saranno tipicamente osservati dopo un ulteriore frazionamento di N-glicopeptidi 17. Pertanto, i ricercatori devono soppesare i pro ei contro quando si progetta la procedura più adatta. Per i ricercatori che non hanno mai usato un metodo di N-glicopeptidi-capture, è meglio praticare il metodo con un paio di puro N-glicoproteina (s) aver conosciuto siti di glicosilazione come indicato in precedenza 8. Questo metodo è robusto e la selettività a N-glicopeptidi è alto. Un inconveniente di questo metodo risiede nella scarsa abbondanza inerente surfaccia N-glicoproteine; per una caratterizzazione completa del campione, di grandi quantitativi è generalmente richiesto di quello di proteomica citosolici. Tuttavia, se le cellule coltivate possono essere espanse in vitro o tessuti di interesse sono abbondanti, questo inconveniente è trascurabile.

Proteine ​​di superficie cellulare interagiscono con l&#39;ambiente extracellulare e trasmettere i segnali dall&#39;esterno verso l&#39;interno di una cella. Così, queste proteine, incluse le proteine ​​della matrice extracellulare, giocano ruoli critici in tutti gli aspetti della biologia e fisiologia vanno dalla proliferazione, crescita, migrazione, differenziazione all&#39;invecchiamento e così via cellulare. Proteine ​​di superficie funzionano interagendo con altre cellule, proteine ​​e piccole molecole 1-3. Caratterizzazione molecolare di proteine ​​della superficie cellulare è di grande interesse non solo per i biologi ma anche per le aziende farmaceutiche, come più del 60% dei farmaci sono mirati alle proteine ​​della superficie cellulare 4. Spettrometria di massa tandem (MS), con la sua straordinaria sensibilità, precisione e velocità per l&#39;identificazione di proteine ​​e peptidi, è stato un potente strumento per studi di proteomica globali 5,6. Eppure, proteine ​​di superficie pongono sfide significative proteomica basati su MS, comeesistono maggior parte delle proteine ​​di superficie in piccole quantità e con modifiche pesanti. Le regioni membrane-spanning delle proteine ​​di superficie li rende idrofobo; questo è particolarmente il caso per le proteine ​​transmembrana multipass. Perciò è difficile da sciogliere proteine ​​di membrana in soluzione acquosa senza l&#39;aiuto di un detersivo; tuttavia l&#39;uso di detergenti generalmente sopprime le prestazioni di HPLC e MS 1,7,8 nella identificazione delle proteine. Pertanto, proteine ​​di membrana sono stati mal caratterizzato proteomica diretti basati LC-MS. La glicosilazione è una delle più importanti e abbondanti modificazioni post-traduzionali che avvengono nelle proteine ​​della superficie cellulare 9. L&#39;enorme complessità e l&#39;eterogeneità dei glicani ostacolano segnale peptidi &#39;MS 10. Tuttavia, diversi metodi di proteomica hanno utilizzato questa modifica unica per arricchire proteine ​​di superficie e per rimuovere le frazioni di zucchero da proteine ​​prima analisi LC-MS. Questi metodos comprendono basato lectina affinità cattura 11 e acido borico-based o basati hydrazide-capture chimica 12 così come separazioni cromatografiche idrofili 8,13. La rimozione di glicani trasforma proteine ​​di membrana alle proteine ​​regolari e semplifica drasticamente la caratterizzazione MS. Poiché glicosilazione avviene anche in proteine ​​secrete che hanno elevata solubilità in contrasto con proteine ​​di membrana, molti metodi glicoproteomica sono ottimizzati per le proteine ​​solubili, e tendono ad avere minore selettività glicopeptidi e sensibilità quando viene distribuito proteine ​​di membrana 8,14. Esistono anche altri metodi per arricchire, in particolare, le proteine ​​di superficie cellulare, come quelli che usano ultracentrifugazione 15 e strategie di etichettatura 16. Un confronto dettagliato tra il nostro metodo e altri metodi esistenti per la caratterizzazione di proteine ​​di membrana è stata condotta recentemente 17, ei risultati hanno indicato che il metodo può eseguire altrettanto bene, se nonmeglio, di tutti i metodi rispetto proteomica membrana, ma con una maggiore semplicità. Per aiutare i ricercatori utilizzano questo metodo, i dettagli qui un protocollo generale. Questo metodo integra diversi vantaggi di strategie glycoproteomics esistenti ed è stato ideato specificamente per glicoproteine ​​di membrana, ma il metodo funziona ugualmente bene per proteine ​​secrete. Le caratteristiche di questo metodo includono: 1) una completa solubilizzazione delle proteine ​​di membrana, 2) un arricchimento di glicopeptidi invece di glicoproteine ​​per eliminare il potenziale sterico quando si usa un substrato solido cattura, 3) l&#39;uso della chimica idrazide per formare legami covalenti tra glicopeptidi e il substrato di cattura, in modo che i glicopeptidi legati possono tollerare lavaggi stringenti per alta glycoselectivity, e 4) la capacità di condurre l&#39;intera procedura di cattura in una provetta per la perdita di campione ridotto e durata procedura abbreviata. Dopo aver implementato questo metodo per studiare una variabileety di campioni biologici comprese le cellule e tessuti, abbiamo osservato una selettività elevata (&gt; 90%) di glicoproteine ​​8,17,18.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="701">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DTT</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">646563</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TCEP</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Iodoacetamide</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A3221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rapigest SF</td>
			<td style="width:199px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">186001860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium periodate</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">311448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PNGase F</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">P0704S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Affi-Gel Hz Hydrazide gel</td>
			<td style="width:199px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">153-6047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin</td>
			<td style="width:199px;">Worthington Biomedical</td>
			<td style="width:119px;">LS02115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sep-Pak C-18 cartridge</td>
			<td style="width:199px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">WAT054955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oasis MCX cartridge</td>
			<td style="width:199px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">186000252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Protease inhibitor coctail</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Urea</td>
			<td style="width:199px;">Amersco</td>
			<td style="width:119px;">568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium sulphite</td>
			<td style="width:199px;">Caledon</td>
			<td style="width:119px;">8360-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Invertase</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I0408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alpha-1 trypsin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ribonulease B</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R7884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Avidin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ovalbumin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A5503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Conalbumin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C0755</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

glycopeptide capture for cell surface proteomics

Proteine ​​di superficie delle cellule, tra cui proteine ​​della matrice extracellulare, partecipano a tutti i principali processi e le funzioni cellulari, come la crescita, la differenziazione e la proliferazione. Una caratterizzazione completa di queste proteine ​​fornisce informazioni ricche per la scoperta di biomarcatori, identificazione del tipo cellulare, e la selezione della droga-obiettivo, oltre a contribuire ad avanzare la nostra comprensione della biologia e fisiologia cellulare. Proteine ​​di superficie, tuttavia, presentano notevoli difficoltà analitiche, a causa della loro intrinsecamente bassa abbondanza, elevata idrofobicità e pesanti modificazioni post-traduzionali. Approfittando della glicosilazione prevalente sulle proteine ​​di superficie, vi presentiamo qui un approccio glicopeptide-capture high-throughput che integra i vantaggi di diversi esistenti mediante N-glycoproteomics. Il nostro metodo può arricchire i glicopeptidi derivati ​​da proteine ​​di superficie e rimuovere i loro glicani per proteomica facili con LC-MS. La N-glycoproteome risolto comprende le informazione di identità proteine ​​e quantità nonché i loro siti di glicosilazione. Questo metodo è stato applicato a una serie di studi in settori quali cancro, cellule staminali, e tossicità da farmaci. La limitazione del metodo risiede nella scarsa abbondanza di proteine ​​di membrana di superficie, tale da richiedere una relativamente grande quantità di campioni per questa analisi rispetto agli studi centrati sulle proteine ​​citosoliche.

Un diagramma di flusso rappresentante della procedura sperimentale è riassunto nella Figura 1. L&#39;etichettatura e ulteriori fasi di frazionamento sono opzionali e dettagli sono descritti in una recente pubblicazione 18. Un&#39;altra opzione è quella di analizzare i peptidi modificati, che non reagiscono con la resina. I vantaggi di analisi dei peptidi modificati includono una possibile identificazione di peptidi e proteine ​​non glicosilati, come claudine in giunzioni strette; Un ulteriore vantaggio è la quantificazione più precisa. Sulla base di questi vantaggi, abbiamo chiamato questo metodo g ssisted-g lobal q roteomics p uantitative (gagQP) a lycocapture-e dettagliata l&#39;analisi in recenti pubblicazioni 18. Un tipico spettro glicopeptidi taken dopo il metodo di arricchimento è mostrato in Figura 2. Nel glicopeptidi ottenuto, la N-glicani è stato rimosso e l&#39;asparagina-glicani divisoria (N) wcome convertito in un acido aspartico (D) da PNGase F; quindi, lo spettro può essere facilmente cercati utilizzando qualsiasi motore di ricerca proteomica contro database di sequenze proteiche comune. Il metodo di cattura può essere valutato in commercio modello glicoproteine ​​prima della sua applicazione con campioni biologici complessi e di valore. Alcune glicoproteine ​​modello di uso frequente includono avidina (pollo), ovalbumina (pollo), invertasi (lievito), α-1 antitripsina (umana), conalbumina (pollo), e ribonucleasi B (bovina) (tutti possono essere ottenute da Sigma). I glicopeptidi frequentemente identificati da queste proteine ​​possono essere trovati in una pubblicazione precedente 8. Un database FASTA proteina-sequenza personalizzata che è adatto per la ricerca automatica dei risultati LC-MS generati da queste proteine ​​modello può essere scaricato dal seguente link (http://www.sfu.ca/chemistry/groups/bingyun_sun/tools.html ), che comprende le suddette proteine ​​modello quotate nonché un riv<html> ersed database di lievito-sequenza, contaminanti comuni e PNGase F. Un risultato tipico LC-MS di N-glicopeptidi catturati è mostrato in Figura 3, in cui più di 100 glicoproteine ​​possono essere identificati da una singola analisi LC-MS di una frazione microsomiale cella. La selettività arricchimento per entrambe le glicoproteine ​​e glicopeptidi è generalmente superiore al 90%. Un&#39;analisi efficace può avere una selettività arricchimento del 95%. Utilizzando una colonna SCX e passo gradiente di frazionare ulteriormente i campioni prima LC-MS analizza solito raddoppiare il numero di identificazioni glicoproteina 17. A volte, quando la quantità dei glicopeptidi ottenuti è basso, l&#39;impurità accumulata dai flaconcini può essere osservato nel campione finale. Questi contaminanti possono essere rimossi mediante il metodo fornito nella fase 5. . Jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51349/51349fig1.jpg &quot;width =&quot; 350 &quot;/&gt; Passi e diamanti Figura 1. Diagramma di flusso della procedura sperimentale. Rettangoli sono tenuti sono passaggi facoltativi. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51349/51349fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51349/51349fig2.jpg" /> Figura 2. Collision indotta dissociazione (CID) spettro di AEPIL N ISNAGPWSR dal lievito del panettiere dopo il metodo glicopeptidi cattura. L&#39;asparagina sottolineata (N) viene convertito in acido aspartico (D), come evidenziato in rosso nella sequenza peptidica in figura . <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51349/51349fig1h3ghres.jpg" src="/files/ftp_upload/51349/51349fig3.jpg" /> Figura 3. Trama 2D del risultato LC-MS della N-glycopeptides ottenuti da cellule staminali embrionali di topo (E14.Tg2a). I punti sono i peptidi identificati, e il colore del punto rappresenta la fiducia identificazione ottenuti statisticamente (cioè probabilità peptide).

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Glycopeptide Capture for Cell Surface Proteomics

Proteine ​​di superficie cellulare sono biologicamente importante e ampiamente glicosilata. Vi presentiamo qui un approccio glicopeptide-capture per solubilizzare, arricchire, e deglycosylate queste proteine ​​per facili analisi proteomica basati LC-MS.

Glicopeptide Capture per Proteomica cellulari di superficie

Cell surface proteins, including extracellular matrix proteins, participate in all major cellular processes and functions, such as growth, ...

glycopeptide-capture-for-cell-surface-proteomics

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

11.2K Views.  Simon Fraser University.  Proteine ​​di superficie cellulare sono biologicamente importante e ampiamente glicosilata. Vi presentiamo qui un approccio glicopeptide-capture per solubilizzare, arricchire, e deglycosylate queste proteine ​​per facili analisi proteomica basati LC-MS. 

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Cell Capture Using a Microfluidic Device

Cattura cellula Utilizzando un dispositivo a microfluidi

Ricerca

Biologia

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

Purificazione delle proteine ​​ortogonali Facilitato da una piastrina Affinity Bispecific

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

Cristallizzazione high-throughput di proteine ​​di membrana con il metodo lipidica Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ensuring cohesion within multicellular organisms. Proteins predicted to form extracellular interactions are encoded by approximately a quarter of human genes1, but despite their importance and abundance, the majority of these proteins have no documented binding partner. Primarily, this is due to their biochemical intractability: membrane-embedded proteins are difficult to solubilise in their native conformation and contain structurally-important posttranslational modifications. Also, the interaction affinities between receptor proteins are often characterised by extremely low interaction strengths (half-lives &lt; 1 second) precluding their detection with many commonly-used high throughput methods2. 
Here, we describe an assay, AVEXIS (AVidity-based EXtracellular Interaction Screen) that overcomes these technical challenges enabling the detection of very weak protein interactions (t1/2 &le; 0.1 sec) with a low false positive rate3. The assay is usually implemented in a high throughput format to enable the systematic screening of many thousands of interactions in a convenient microtitre plate format (Fig. 1). It relies on the production of soluble recombinant protein libraries that contain the ectodomain fragments of cell surface receptors or secreted proteins within which to screen for interactions; therefore, this approach is suitable for type I, type II, GPI-linked cell surface receptors and secreted proteins but not for multipass membrane proteins such as ion channels or transporters.
The recombinant protein libraries are produced using a convenient and high-level mammalian expression system4, to ensure that important posttranslational modifications such as glycosylation and disulphide bonds are added. Expressed recombinant proteins are secreted into the medium and produced in two forms: a biotinylated bait which can be captured on a streptavidin-coated solid phase suitable for screening, and a pentamerised enzyme-tagged (&beta;-lactamase) prey. The bait and prey proteins are presented to each other in a binary fashion to detect direct interactions between them, similar to a conventional ELISA (Fig. 1). The pentamerisation of the proteins in the prey is achieved through a peptide sequence from the cartilage oligomeric matrix protein (COMP) and increases the local concentration of the ectodomains thereby providing significant avidity gains to enable even very transient interactions to be detected. By normalising the activities of both the bait and prey to predetermined levels prior to screening, we have shown that interactions having monomeric half-lives of 0.1 sec can be detected with low false positive rates3.

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

AVEXIS is a high throughput protein interaction assay developed to systematically screen for novel extracellular receptor-ligand pairs involved in cellular recognition processes. It is specifically designed to detect transient protein interactions that are difficult to identify using other high throughput approaches.

Avidità-based Screening Interaction extracellulare (AVEXIS) per il rilevamento scalabile di bassa affinità extracellulare del recettore-ligando interazioni

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

Metabolic Etichettatura e con membrana frazionamento per proteomica comparativa Analisi del<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Culture sospensione cellulare

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis (diguanylate cyclases) and degradation (phosphodiesterases) of the second messenger c-di-GMP. In contrast, little information is available regarding the molecular mechanisms and cellular components through which this signaling molecule regulates a diverse range of cellular processes. Most of the known effector proteins belong to the PilZ family or are degenerated diguanylate cyclases or phosphodiesterases that have given up on catalysis and have adopted effector function. Thus, to better define the cellular c-di-GMP network in a wide range of bacteria experimental methods are required to identify and validate novel effectors for which reliable in silico predictions fail.
We have recently developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS) based technology as a powerful tool to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins. This technique has previously been reported to be applicable to a wide range of organisms1. Here we give a detailed description of the protocol that we utilize to probe such signaling components. As an example, we use Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic pathogen in which c-di-GMP plays a critical role in virulence and biofilm control. CCMS identified 74% (38/51) of the known or predicted components of the c-di-GMP network. This study explains the CCMS procedure in detail, and establishes it as a powerful and versatile tool to identify novel components involved in small molecule signaling.

The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.

Capture spettrometria di massa Compound - un potente strumento per identificare nuovi c-di-GMP effettori Proteine

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Cell Surface Marker Mediated Purification of iPS Cell Intermediates from a Reprogrammable Mouse Model

Mature cells can be reprogrammed to a pluripotent state. These so called induced pluripotent stem (iPS) cells are able to give rise to all cell types of the body and consequently have vast potential for regenerative medicine applications. Traditionally iPS cells are generated by viral introduction of transcription factors Oct-4, Klf-4, Sox-2, and c-Myc (OKSM) into fibroblasts. However, reprogramming is an inefficient process with only 0.1-1% of cells reverting towards a pluripotent state, making it difficult to study the reprogramming mechanism. A proven methodology that has allowed the study of the reprogramming process is to separate the rare intermediates of the reaction from the refractory bulk population. In the case of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we and others have previously shown that reprogramming cells undergo a distinct series of changes in the expression profile of cell surface markers which can be used for the separation of these cells. During the early stages of OKSM expression successfully reprogramming cells lose fibroblast identity marker Thy-1.2 and up-regulate pluripotency associated marker Ssea-1. The final transition of a subset of Ssea-1 positive cells towards the pluripotent state is marked by the expression of Epcam during the late stages of reprogramming. Here we provide a detailed description of the methodology used to isolate reprogramming intermediates from cultures of reprogramming MEFs. In order to increase experimental reproducibility we use a reprogrammable mouse strain that has been engineered to express a transcriptional transactivator (m2rtTA) under control of the Rosa26 locus and OKSM under control of a doxycycline responsive promoter. Cells isolated from these mice are isogenic and express OKSM homogenously upon addition of doxycycline. We describe in detail the establishment of the reprogrammable mice, the derivation of MEFs, and the subsequent isolation of intermediates during reprogramming into iPS cells via fluorescent activated cells sorting (FACS).

Mouse embryonic fibroblast can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells at low efficiency by the forced expression of transcription factors Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. The rare intermediates of the reprogramming reaction are FACS isolated via labeling with antibodies against cell surface makers Thy-1.2, Ssea-1, and Epcam.

Marker cellulare superficiale Purificazione mediata di cellule iPS intermedi da un modello riprogrammabile mouse

Mature cells can be reprogrammed to a pluripotent state. These so called induced pluripotent stem (iPS) cells are able to give rise to all cell types of ...

Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without breaching the collagenous basement membrane. While DCIS is a non-obligate precursor to invasive breast cancers, the molecular mechanisms and cell populations that permit progression to invasive cancer are not fully known. To determine if progenitor cells capable of invasion existed within the DCIS cell population, we developed a methodology for collecting and culturing sterile human breast tissue at the time of surgery, without enzymatic disruption of tissue.
Sterile breast tissue containing ductal segments is harvested from surgically excised breast tissue following routine pathological examination. Tissue containing DCIS is placed in nutrient rich, antibiotic-containing, serum free medium, and transported to the tissue culture laboratory. The breast tissue is further dissected to isolate the calcified areas. Multiple breast tissue pieces (organoids) are placed in a minimal volume of serum free medium in a flask with a removable lid and cultured in a humidified CO2 incubator. Epithelial and fibroblast cell populations emerge from the organoid after 10 - 14 days. Mammospheres spontaneously form on and around the epithelial cell monolayer. Specific cell populations can be harvested directly from the flask without disrupting neighboring cells. Our non-enzymatic tissue culture system reliably reveals cytogenetically abnormal, invasive progenitor cells from fresh human DCIS lesions.

Primary cell culture using intact tissue organoids provides a model system that mimics the multi-cellular in vivo microenvironment. We developed a serum-free primary breast epithelium tissue culture model that perpetuates mixed cell culture lineages and exhibits differentiated morphology, without enzymatic tissue disruption. Breast organoids remain viable for &#62;6 months.

Non enzimatica, siero-libero Tissue Culture delle lesioni mammarie pre-invasive per la generazione spontanea di mammospheres

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein &#945;-subunit) is described in detail.

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

Reazione selezionato Monitoraggio spettrometria di massa per Absolute Protein Quantificazione

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of cell proliferation, survival, migration, etc. The ECM plays important roles in development and in diverse pathologies including cardio-vascular and musculo-skeletal diseases, fibrosis, and cancer. Thus, characterizing the composition of ECMs of normal and diseased tissues could lead to the identification of novel prognostic and diagnostic biomarkers and potential novel therapeutic targets. However, the very nature of ECM proteins (large in size, cross-linked and covalently bound, heavily glycosylated) has rendered biochemical analyses of ECMs challenging. To overcome this challenge, we developed a method to enrich ECMs from fresh or frozen tissues and tumors that takes advantage of the insolubility of ECM proteins. We describe here in detail the decellularization procedure that consists of sequential incubations in buffers of different pH and salt and detergent concentrations and that results in 1) the extraction of intracellular (cytosolic, nuclear, membrane and cytoskeletal) proteins and 2) the enrichment of ECM proteins. We then describe how to deglycosylate and digest ECM-enriched protein preparations into peptides for subsequent analysis by mass spectrometry.

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

Arricchimento della matrice extracellulare proteine ​​da tessuti e digestione in Peptidi per l&#39;analisi Spettrometria di Massa

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...