Questo lavoro è stato in parte sostenuto da sovvenzioni dal Agence Nationale pour la Recherche, programma PIRIbio Dynabiofilm e dal CNRS programma di Risk interdisciplinare. Ringraziamo Philippe Thomen per la sua lettura critica del manoscritto e Christophe Beloin per fornire la E. coli ceppo utilizzato in questo lavoro.

1. Batteri, Cultura e sospensione Preparazione <ol><li> Scegliere la colonia appena cresciuta da una piastra di agar lisogenia Broth (LB), inoculare in 5 ml di terreno LB liquido contenente 100 μ g / ml ampicillina e 7,5 μ g / ml di tetraciclina e incubare per 5 a 6 ore a 37 ° C su una piattaforma di agitazione. </li><li> Poi, aggiungere 100 μ l di coltura batterica in 5 ml di terreno minimo (M63B1) supplementato con 0,4% di glucosio e le stesse concentrazioni di antibiotico. Incubare questa coltura durante la notte appena diluito a 37 ° C su una piattaforma di agitazione. </li><li> Dopo 16 ore di incubazione, aggiungere 100 microlitri della cultura durante la notte per 5 ml M63B1, 0,4% di glucosio. Mantenere il tubo a 37 ° C per la piattaforma di agitazione fino a 0,5 OD è raggiunto. La sospensione è quindi pronto per l&#39;iniezione nel canale esperimento per la formazione di biofilm. </li></ol> 2. Preparazione particelle magnetiche <ol><li> Prendere 10 particelle magnetiche microlitri -2,8 μ m di diametro - dal magazzino e lavarli 3x in 190 microlitri terreno minimo con l&#39;aiuto di un rack campioni magnetico. </li><li> Regolare la concentrazione di particelle a 5 x 10 6 perline / ml. Tipicamente 50 microlitri della soluzione di sfere lavato viene miscelato con un ulteriore 950 μ l di M63B1 con 0,4% di glucosio. </li></ol> Preparazione Canale 3. Biofilm e crescita <ol><li> Montaggio del canale <ol><li> Tagliate due quadrati (800 μ m di lunghezza per lato) capillari in vetro borosilicato lunghi 10 centimetri avere due lunghi otto centimetri pezzi. </li><li> Incollate i due pezzi capillari su due vetrini - tagliate a metà prima - 2 cm di distanza con 1 centimetro sbalzo su entrambe le estremità come in figura 1 utilizzando un collante cianoacrilato ad azione rapida (la cosiddetta super-colla). </li><li> Sterilizzare l&#39;intera configurazione e il tubo richieste per un ulteriore canale di connessione. </li><li> Raccogliere tutti i materiali sterili sottouna cappa a flusso laminare: i) il canale montato e trappola 1, ii) il tubo e connettori, iii) le due trappole per bolle - filtro bolla comunemente usato per fissare bambini-gocciolamento alimentazione (trappola 1) e la bolla trappola fatta in casa come 4 cm tubo di diametro maggiore (trap 2), iv) morsetti, v) 30 ml siringhe riempito con M63B1, 0,4% di glucosio, e vi) la bottiglia degli scarti. </li><li> Collegare l&#39;intero setup con connettori Luer Lock o giunzioni nel seguente ordine: 50 ml M63B1 siringa controllata dalla pompa a siringa, il filtro bolla pediatrica, trappola per bolle in casa, capillare (Figura 1, pannello B), e il tubo per la bottiglia degli scarti. Poi riempire il setup con M63B1 sterile, 0,4% di glucosio, accendendo la pompa a siringa ad una velocità di circa 10 ml / h, superiore ai tassi sperimentali. Monitorare con attenzione ed eliminare tutte le bolle nel circuito. </li><li> Fluire il mezzo attraverso il sistema per 10-15 minuti; mescolare contemporaneamente 1 ml di sospensione batteri a OD 0.5 dalla sezione1.3 con 1 ml di soluzione tallone lavato preparata nella sezione 2.2. </li><li> Attaccare (ma non chiudere) morsetti per il tubo in due posizioni: prima e dopo i capillari. Spegnere il flusso. </li><li> Introdurre la miscela batterico-tallone nel capillare dopo il gorgogliatore fatto in casa utilizzando una siringa da 1 ml, avendo cura di tenere il tubo finisce per impedire l&#39;entrata di aria. Ricollegare il tubo e chiudere i morsetti. </li><li> Ripetere la stessa procedura per il secondo capillare e visualizzate tutte le provette per bolle. </li><li> Trasferire l&#39;apparecchio al microscopio e lasciare riposare per 15-20 minuti per consentire ai batteri di insediarsi e attaccare alla superficie del capillare. Installare il capillare sul palco microscopio con il contenitore di rifiuti ad un livello leggermente superiore. Posizionare la pompa a siringa sul piano di lavoro accanto al microscopio. Elevare il gorgogliatore prima del capillare leggermente superiore rispetto al piano capillare per catturare bolle. </li></ol></li><li> Biofilm Growth <ol><li> Regolare la portata della pompa siringa e avviare il flusso, il biofilm ora svilupparsi sulla superficie capillare nel periodo necessario - di solito 24 o 48 ore in questi esperimenti. </li><li> Focus sul piano di base capillare e avviare la registrazione time-lapse delle immagini di esempio - di solito una frequenza di acquisizione di 2 immagini / min adeguatamente segnalare la crescita biofilm. Questo monitor video biofilm crescita post-controllo (vedi estratti in Video 1, 2 e 3). </li></ol></li></ol> 4. Pinzette magnetiche installazione <ol><li> Avvitare le pinzette magnetiche sulla micromanipolatori XYZ controllati manualmente e avvitare i micromanipolatori sul palco microscopio per regolare la posizione delle pinzette relativamente al capillare. Collocare le pinzette come in Figura 2 per garantire l&#39;adeguato gradiente di campo magnetico è generato nella zona di osservazione. </li><li> Collegare le pinzette to il generatore di funzioni tramite l&#39;amplificatore di potenza per generare un periodo di 40 secondi di tempo in 24 sec segnale zero e 16 sec di 4 A corrente continua con un trigger inviato al campo luminoso luce otturatore dopo 20 sec per la sincronizzazione del segnale fornire una sequenza di eventi come in Figura 3. Nota: Queste due operazioni possono essere realizzati in qualsiasi momento tra installazione capillare e misurazione inizio. Vedere esperimento schizzo panoramica nella Figura 4. </li></ol> 5. Creep Curve di acquisizione <ol><li> Utilizzare il controllo del movimento xy al palco microscopio a portare il bordo del polo magnetico sinistro e il bordo sinistro del capillare nello stesso campo di osservazione. Prendere l&#39;origine del referenziale analisi all&#39;incrocio tra xey assi definiti dal bordo del capillare e il bordo del polo, rispettivamente (vedere la Figura 2). </li><li> Regolare la posizione verticale del capillare con messa a fuoco fine cmanopola ontrol della posizione microscopio. Aereo genere il primo esame si trova tra 4 a 7 μ m sopra il fondo capillare. Video 1 corrisponde al campo xy che ha il suo angolo superiore sinistro all&#39;origine della referenziale spaziale. </li><li> Innescare la sequenza 40 sec di eventi descritti nel paragrafo 4.2 e Figura 3 accendendo il generatore di corrente e, allo stesso tempo, attivare manualmente l&#39;immagine sequenza di acquisizione video 1. </li><li> Spostare il capillare nel campo destro vicino da un μ m traduzione 250 del palco microscopio a fianco e operare come al punto 5.3 per generare Video 2 di fetta 2 e così via per ottenere i video richiesti. Tipicamente 3 a 4 campi di 250 x 250 μ m 2 sono raccolti lungo l&#39;asse x prima del cambio di aereo e ripetendo le stesse operazioni per il nuovo piano. </li></ol> 6. Calibrazione Forza <ol><li> Preparare una soluzione di glicerolo mescolando 39,8 g di glicerolo con 190 μ l di acqua bi-distillata e 10 ml di particelle magnetiche in un 2 x 10 9 particelle / ml e riempire un canale sperimentale con questo composto e mettetelo sul palco microscopio come descritto per il campione biofilm. </li><li> Dopo aver installato le pinzette magnetiche come indicato al punto 4, applicare la forza magnetica come indicato nella sezione 5.4 e creare immagini time-lapse per estrarre ogni velocità della particella singola (v) e la sua posizione nel capillare per ricavare il file di calibrazione. Questo file deve contenere la forza applicata in funzione della sua posizione nella zona di analisi del capillare secondo la legge di Stokes, F = 6πRηv (R: raggio della particella). </li></ol> 7. Analisi <ol><li> Utilizzare un software &quot;particella tracker&quot; per ottenere i file di testo con le posizioni delle particelle in ogni fotogramma per tutte le pile di immagini acquisite, come indicato al punto 5. Uso dig dell&#39;immagine frequenza di acquisizione pila, calcolare lo spostamento delle particelle in funzione del tempo (ad esempio la figura 5 e Video 4). </li><li> Utilizzo del file di calibrazione forza, convertire le curve spostamento a curve compliance (conformità totale del materiale - J (t) - in funzione del tempo) secondo la formula conformità: <img alt="" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/50857/50857eq1.jpg" width="106" /> che dà il rapporto tra deformazione del materiale e lo stress applicare una particella sonda di raggio R incorporato in un, mezzo viscoelastico omogeneo incomprimibile come precedentemente stabilito dal Schnurr e collaboratori 19. </li><li> Regolare le curve di conformità scorrimento al Burgers modello generale per i materiali viscoelastici e ricavare i parametri viscoelastici, J 0, J 1, η 0, η 1 per ogni particella ( <strong&gt; Figura 6) secondo la formula dei Burgers: <img alt="" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/50857/50857eq2.jpg" width="169" /> Nota: Questa analisi fenomenologica è già stato impiegato per una vasta gamma di materiali, tra cui materiali biologici come il biofilm per interpretare i dati reologici macroscopici 20-22. </li></ol>

<ol>
	<li>Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+biofilms:+from+the+natural+environment+to+infectious+diseases.">Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases.</a> Nat Rev Microbiol. 2, 95-108 (2004).</li><li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+microbial+life+on+surfaces.">Biofilms: microbial life on surfaces.</a> Emerg Infect Dis. 8, 881-890 (2002).</li><li>Costerton, J. W., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Battling+biofilms.">Battling biofilms.</a> Scientific American. 285, 74-81 (2001).</li><li>Branda, S. 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B., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+properties+of+a+mixed+culture+biofilm+from+rheometer+creep+analysis.">Viscoelastic properties of a mixed culture biofilm from rheometer creep analysis.</a> Biofouling. 19, 279-285 (2003).</li><li>Lau, P. C., Dutcher, J. R., Beveridge, T. J., Lam, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantitation+of+bacterial+biofilm+adhesion+and+viscoelasticity+by+microbead+force+spectroscopy.">Absolute quantitation of bacterial biofilm adhesion and viscoelasticity by microbead force spectroscopy.</a> Biophysical journal. 96, 2935-2948 (2009).</li><li>Poppele, E. H., Hozalski, R. 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W., Cunningham, A., Stoodley, P., McKittrick, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+fluid-biofilm+interaction+using+a+Burger+material+law.">A model of fluid-biofilm interaction using a Burger material law.</a> Biotechnol Bioeng. 96, 259-271 (2007).</li><li>Jones, W. L., Sutton, M. P., McKittrick, L., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+antimicrobial+treatments+change+the+viscoelastic+properties+of+bacterial+biofilms.">Chemical and antimicrobial treatments change the viscoelastic properties of bacterial biofilms.</a> Biofouling. 27, 207-215 (2011).</li><li>Apgar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-particle+tracking+measurements+of+heterogeneities+in+solutions+of+actin+filaments+and+actin+bundles.">Multiple-particle tracking measurements of heterogeneities in solutions of actin filaments and actin bundles.</a> Biophysical journal. 79, 1095-1106 (2000).</li></ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Questa particella magnetica semina e tirando attivato in situ mappatura 3D dei parametri viscoelastici di un biofilm cresce nel suo stato originale esperimento. Questo approccio ha rivelato l&#39;eterogeneità meccanica del E. coli biofilm cresciuto qui e ha dato indizi per precisare le componenti del biofilm che sostengono i biofilm proprietà fisiche, suggerendo fortemente una implicazione fondamentale della matrice extracellulare e più precisamente il grado di reticolazione. Il riconoscimento delle proprietà meccaniche modelli in biofilm batterico è cruciale per la costruzione di una rappresentazione esauriente di tali materiali complessi. Questi risultati aprono la strada a chiarire le relazioni causali che legano i modelli meccanici e eterogeneità biologici come microniches di espressione genica, che dovrebbero contribuire a chiarire le forze motrici alla base dello sviluppo di biofilm. Fino ad ora, la questione del mecha biofilmproprietà nici erano stati indirizzati principalmente da un punto di vista macroscopico e spesso raschiando biofilm dal suo sito iniziale 8,9,12,13, che rappresenta un importante rischio di perdita di informazioni. Il nostro metodo non invasivo determina la prima caratterizzazione in situ del profilo meccanico 3D biofilm nel suo ambiente originale. L&#39;approccio ancora ha una limitazione risiede nelle caratteristiche del azionamento magnetico remoto di sonde colloidali. Infatti, visualizza una gamma intrinseca di forze accessibili data dalla distanza pole-particelle, le proprietà dei materiali polari e prestazioni bobina. L&#39;attuale configurazione del set-up ha permesso di sondare i valori di rigidità fino a 200 Pa, che era sufficiente per i biofilm qui esaminate. Tuttavia, ulteriore ingegnerizzazione del nostro set-up - coinvolge, per esempio, il raffreddamento dell&#39;elettromagnete - dovrebbe consentire spostamento di forza e termini di un fattore da 2 a 3. We stanno attualmente lavorando in relazione le proprietà fisiche e dinamiche in un biofilm indagare la relazione che lega i parametri viscoelastici locali segnalati dallo spostamento passivo della sonda su una scala temporale più ampia. Inoltre, stiamo esplorando l&#39;impatto dei vari prodotti chimici destinati a diversi componenti del biofilm sul suo profilo meccanico. Questo nuovo approccio rivela i dettagli di batteri biofilm meccanica interna e contribuisce ad una migliore comprensione di queste strutture viventi, cruciale dal punto di un ingegnere di vista ai fini del controllo biofilm ma anche dal punto di vista fondamentale per chiarire la relazione tra le proprietà architettoniche e la specifica biologia di queste strutture.

Biofilm batterici sono comunità di batteri associati con superfici biologiche o artificiali 1-3. Essi formano da un meccanismo di adesione crescita accoppiato con la produzione di matrice extracellulare ricca di polisaccaride che protegge e stabilizza l&#39;edificio 4,5. Questi biofilm non sono assemblaggi semplicemente passivi di cellule attaccati alle superfici, ma organizzati e complessi sistemi biologici dinamici. Quando i batteri passano da planctoniche allo stile di vita biofilm, cambiamenti nell&#39;espressione genica e fisiologia cellulare sono stati osservati, nonché una maggiore resistenza agli antimicrobici e ospitare le difese immunitarie essere all&#39;origine di molte infezioni persistenti e croniche 6. Tuttavia, lo sviluppo controllato di queste strutture viventi offrono anche opportunità per applicazioni industriali e ambientali, come biorisanamento dei siti di rifiuti pericolosi, bio-filtrazione di acqua industriale o formazione di bio-barriere per la protezione del suolo e delle acque sotterranee da Contaminzione. Mentre caratteristiche molecolari specifiche per modo biofilm della vita sono sempre descritti, i meccanismi che guidano lo sviluppo della comunità e la persistenza rimangono poco chiari. Usando i recenti progressi sulle misurazioni microscala utilizzando elettrochimica scansione o microscopia a fluorescenza, questi organismi viventi hanno dimostrato di presentare una notevole strutturale, chimica e biologica eterogeneità 7. Tuttavia, fino ad ora, meccanica biofilm sono state principalmente esaminati macroscopicamente. Ad esempio, l&#39;osservazione di stelle filanti biofilm deformazioni dovute a variazioni dei tassi di flusso del fluido 8,9, compressione monoassiale di pezzi biofilm risalita dal terreno di agar o coltivate sul coperchio scorre 10,11, taglio del biofilm raccolti dall&#39;ambiente e poi trasferito in un parallelo Piastra reometro 12,13, spettroscopia a forza atomica con una perla di vetro e rivestito con un biofilm batterico collegato a un cantilever AFM 14 o MICR dedicatoocantilever metodo per misurare la resistenza alla trazione di frammenti biofilm staccati 15,16 sono state attuate negli ultimi dieci anni, fornendo informazioni utili sulla natura viscoelastica del materiale 17. Tuttavia, sembra probabile che le informazioni sul biofilm in situ proprietà meccaniche è perso quando il materiale viene rimosso dal suo ambiente nativo, che è spesso il caso in questi approcci. Inoltre, il trattamento del biofilm come materiale omogeneo trova la informazioni sulla possibile eterogeneità delle proprietà fisiche all&#39;interno della comunità. Pertanto, le esatte implicazioni della meccanica della struttura nella formazione di biofilm e le caratteristiche biologiche come l&#39;espressione genica patterning o gradienti chimici possono difficilmente essere riconosciuti. Per progredire verso una descrizione microscala dei biofilm proprietà fisiche, sono necessari nuovi strumenti dedicati. Dettagli Questo documento un approccio originale concepito per raggiungeremisurazione dei parametri meccanici locali in situ, senza disturbare il biofilm e consentendo disegno della distribuzione spaziale delle proprietà del materiale microscala e poi l&#39;eterogeneità meccanica. Il principio dell&#39;esperimento poggia sul drogaggio di un biofilm cresce con microparticelle magnetiche seguita dalla loro carico a distanza usando pinzette magnetiche nel biofilm maturo. Spostamento delle particelle in applicazione della forza magnetica controllata ripreso sotto il microscopio permette locale derivazione parametro viscoelastico, ogni particella di reporting proprio ambiente locale. Da questi dati, il profilo meccanica 3D del biofilm può essere disegnato, rivelando territoriali e ambientali condizione dipendenze. L&#39;intero esperimento verrà mostrato qui su E. biofilm coli fatta da un ceppo geneticamente modificato che trasporta una derepressi plasmide F-like. I risultati dettagliati in un recente articolo 18 forniscono una visione unica degli interni della meccanica biofilm intatti.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1258">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td colspan="5" height="21" style="height:21px;width:1257px;">Table 1: Reagents and cells</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="20" rowspan="2" style="height:22px;width:216px;">Magnetic particles</td>
			<td rowspan="2" style="width:323px;">Life technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:224px;">14307D</td>
			<td colspan="2" rowspan="2" style="width:496px;">Micrometric magnetic particle, 2.8 &#181;m diameter</td>
		</tr>
		<tr height="2">
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">Ampicillin (Antibiotic)</td>
			<td style="width:323px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:224px;">A9518</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tetracycline (Antibiotic)</td>
			<td style="width:323px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:224px;">87128</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bacterial strain MG1655gfpF</td>
			<td style="width:323px;">UGB, Institut Pasteur, France</td>
			<td style="width:224px;"></td>
			<td colspan="2" style="width:496px;">produces F pili at its surface, resistant to Ampicilllin and tetracycline</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="5" height="21" style="height:21px;width:1257px;">Table 2:&#160; Capillaries and tubing</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:216px;">Filters for pediatric perfusion</td>
			<td style="width:323px;">Prodimed-Plastimed</td>
			<td style="width:224px;">6932002</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Hollow Square Capillaries</td>
			<td style="width:323px;">Composite Metal Scientific</td>
			<td style="width:224px;">8280-100</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;">Manufactured in Borosilicate glass. Square 0.8mm x0.8mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tubing silicone peroxyde</td>
			<td style="width:323px;">VWR international</td>
			<td style="width:224px;">228-0512</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;">Diameter 1mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tubing silicone peroxyde</td>
			<td style="width:323px;">VWR international</td>
			<td style="width:224px;">228-0700</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;">Diameter 3mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Table 3: Biofilm growth</td>
			<td style="width:323px;"></td>
			<td style="width:224px;"></td>
			<td style="width:495px;"></td>
			<td style="width:1px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lysogeny Broth (LB) solution</td>
			<td style="width:323px;">Amresco-VWR</td>
			<td style="width:224px;">J106-10PK</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;">standard medium used to grow bacteria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">M63B1 solution</td>
			<td style="width:323px;">Home-made</td>
			<td style="width:224px;"></td>
			<td colspan="2" style="width:496px;">Standard minimum&#160; medium used to grow bacteria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:323px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:224px;">G8270</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;">Used to make M63B1 medium with 0.4% glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="5" height="21" style="height:21px;width:1257px;">Table 4: Electronics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Camera EMCCD&#160;&#160;</td>
			<td style="width:323px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:224px;">C9100-02</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">Heater controller</td>
			<td style="width:323px;">World precision instruments</td>
			<td style="width:224px;">300354</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Function generator</td>
			<td style="width:323px;">Agilent technologies</td>
			<td style="width:224px;">33210A</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Power amplifier</td>
			<td style="width:323px;">Home-made</td>
			<td style="width:224px;"></td>
			<td colspan="2" style="width:496px;">It gives a current signal with amplitudes up to 4 A.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringe pumps</td>
			<td style="width:323px;">Kd Scientific</td>
			<td style="width:224px;">KDS-220</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Shutter</td>
			<td style="width:323px;">Vincent Associates</td>
			<td style="width:224px;">Uniblitz T132</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;"></td>
		</tr>
		<tr height="125">
			<td height="125" style="height:125px;width:216px;">Magnetic tweezers</td>
			<td style="width:323px;">Home-made</td>
			<td style="width:224px;"></td>
			<td colspan="2" style="width:496px;">Two electromagnetic poles, each made of a copper coil with 2,120 turns of 0.56 mm in diameter copper wire and soft magnetic alloy cores (Supra50-Arcelor Mittal, France) square shaped according to the blueprint shown in Fig. 10. The two cores are mounted north pole facing south pole, in order to generate a magnetic force in one direction along the length of the capillary. See coil wiring details in Figure 11.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="5" height="21" style="height:21px;width:1257px;">Table 5: Optics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Inverted microscope&#160;</td>
			<td style="width:323px;">Nikon</td>
			<td style="width:224px;">TE-300</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">S Fluor x40 Objective (NA 0.9, WD0.3)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td style="width:224px;"></td>
			<td>This a long working distance ojective enabling observation of the biofilm in the depth</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Epifluorescence filters: 1) for green fluorescence: Exc 480/20 nm; DM 495; Em 510/20&#160; 2) for Red fluorescence: Exc 540/25 nm; DM 565; Em 605/55</td>
			<td style="width:323px;">Chroma</td>
			<td style="width:224px;">1)#49020 2)#31002</td>
			<td>Particle displacement upon force application is recorded using the red fluoresecnce filter block.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="5" height="21" style="height:21px;width:1257px;">Table 6: Image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ImageJ</td>
			<td style="width:323px;">NIH - particle tracker plugin</td>
			<td style="width:224px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

remote magnetic actuation of micrometric probes for in situ 3d mapping of bacterial biofilm physical properties

Adesione batterica e crescita su interfacce portano alla formazione di strutture tridimensionali eterogenei cosiddetti biofilm. Le cellule vive in queste strutture sono tenute insieme da interazioni fisiche mediate da una rete di sostanze polimeriche extracellulari. Biofilm batterici impatto molte attività umane e la comprensione delle loro proprietà è fondamentale per un migliore controllo del loro sviluppo - mantenimento o l&#39;eradicazione - a seconda del loro esito avverso o benefico. Questo documento descrive una nuova metodologia che mira a misurare in situ le proprietà fisiche locali del biofilm che era stato finora esaminato solo dal punto di vista macroscopico e materiale omogeneo. L&#39;esperimento qui descritto comporta l&#39;introduzione di particelle magnetiche in un biofilm cresce a seme sonde locali che possono essere azionati a distanza senza disturbare le proprietà strutturali del biofilm. Pinzette magnetiche dedicati sono stati svipato per esercitare una forza definita su ciascuna particella incorporato nel biofilm. La configurazione è montato sulla scena di un microscopio per consentire la registrazione di immagini intervallati di periodo particella tirando. Le traiettorie delle particelle vengono estratti dalla sequenza e tirando i parametri viscoelastici locali sono derivati ​​da ciascuna curva spostamento particella, fornendo così la distribuzione 3D-spaziale dei parametri. Acquisendo informazioni sul profilo meccanico biofilm è essenziale dal punto di vista di un ingegnere per scopi di controllo biofilm ma anche dal punto di vista fondamentale per chiarire la relazione tra le proprietà architettoniche e la biologia specifica di queste strutture.

Un&#39;analisi tipica fornirà la distribuzione spaziale dei parametri viscoelastici in scala micron su un biofilm vivere senza disturbare l&#39;arrangiamento originale. I risultati tipici sono mostrati in figura 7 dove i valori di J 0 - la cedevolezza elastica - sono date in funzione del l&#39;asse z lungo la profondità e l&#39;asse y lungo una dimensione laterale del biofilm. Ogni punto corrisponde a una sfera che l&#39;analisi della curva di creep ha fornito un valore di J 0. I dati hanno rivelato che il rispetto locale varia lungo la profondità del biofilm su quasi tre ordini di grandezza, ma anche che la forte eterogeneità laterale ha avuto luogo a tutte le altezze biofilm. I dati anche dato accesso alla distribuzione dei valori di compliance che esibivano qui una forma diffusa e asimmetrica (Figura 8), che fornisce indicazioni forti che le proprietà meccaniche del biofilm sono state supportate daaltamente reticolato gel polimerici. Infatti, comportamento analogo è stato precedentemente dimostrato su gel di actina e concentrati altamente reticolato 23. Inoltre, queste misure in situ di biofilm proprietà locali eseguite in diverse condizioni ambientali, come portata minore consentono di dimostrare l&#39;effetto di tale variazione l&#39;organizzazione interna biofilm. In figura 9, i valori di compliance di un biofilm cresciuto a 0.1 ml / hr esprimevano un profilo meccanico ancora altamente eterogeneo ma non superiore rigidità dello strato di biofilm più profondo rispetto al biofilm cresciuto a 1 ml / hr. Questi risultati hanno dimostrato l&#39;impatto significativo delle condizioni esterne sull&#39;organizzazione biofilm. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50857/50857fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50857/50857fig1.jpg" /> <st<html> rong&gt; Figura 1. schizzo di montaggio capillare. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50857/50857fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50857/50857fig2.jpg" /> Figura 2. Posizionamento della pinzetta magnetico rispetto al capillare sul palco microscopio e definizione del referenziale spaziale. La vista superiore indica la posizione della zona di misurazione nel capillare. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50857/50857fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50857/50857fig3.jpg" /> Figura 3. Sincronizzazione dei segnali nel periodo di tempo di 40 sec. 857/50857fig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4. Esperimento schizzo panoramica. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50857/50857fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50857/50857fig5.jpg" /> Figura 5. Estratti particella analisi traiettoria. Pannello A mostra a sinistra l&#39;immagine di una particella tipica nella sua posizione iniziale prima dell&#39;applicazione forza magnetica (tempo 23.79 sec del periodo di 40 sec) e sulla destra la posizione della particella tempo di 30 sec con la visualizzazione della traiettoria trovati usando ImageJ particella inseguitore Pannello B mostra il grafico della curva di cilindrata derivato da questi dati.; Qui vi mostriamo un estratto traiettoria a partire da tempo 23.79 sec fino al tempo t = 31,29 sec del periodo di 40 sec. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" fo:src= &quot;/ Files/ftp_upload/50857/50857fig6highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50857/50857fig6.jpg&quot; /&gt; Figura 6. Parametro viscoelastico derivazione sulla base del modello fenomenologico di Burger. (A) hamburger modello meccanico che consiste in una combinazione di molla elastica Hookean (J 0) e dashpot newtoniano (η 0) in serie con un elemento di Maxwell (molla ( J 1) e dashpot (η 1) in parallelo). (B) Creep traccia sperimentale in blu insieme alla curva (in verde) rettificato per l&#39;equazione di Burgers. <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50857/50857fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50857/50857fig7.jpg" /> Figura 7. Distribuzione spaziale di cedevolezza elastica in un biofilm cresciuto 24 ore a 37 ° C in 1 ml / hr nutrienti flusso. I valori di conformità riportati da ciascuna particella<html> sono qui rappresentata come una proiezione su un (yz) aereo utilizzando un luogo fresco per riscaldare mappa colore personalizzato. Valori conformità segnalati da particelle situate nello strato inferiore del biofilm sono tutti inferiori a 0,2 m 2 / N mentre particelle trovate nei valori 15 μ m relazione strato superiori sopra 1 m 2 / N. <img alt="Figura 8" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50857/50857fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50857/50857fig8.jpg" /> Figura 8. Distribuzioni normalizzate dei parametri viscoelastici ottenuti in biofilm (A) e in glicerolo (B), un liquido viscoso omogeneo. Biofilm esposto distribuzione asimmetrica e larga (skewness di 3.6 e varianza normalizzata 2.4) indica materiale eterogeneità. Per contro, simmetrica e distribuzione stretta caratterizzare un mezzo omogeneo è stato ottenuto in glicerolo (skewness di 0,23 e normalizzato varianza 0,03). ONTENUTO &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50857/50857fig9highres.jpg" width="500" /> Figura 9. Distribuzione spaziale di cedevolezza elastica in un biofilm cresciuto 24 ore a 37 ° C sotto flusso inferiore di 0,1 ml / hr nutrienti flusso. Valori conformità sono rappresentate in funzione della profondità biofilm. Colori dei simboli forniscono gli intervalli di conformità. <img alt="Figura 10" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50857/50857fig10highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50857/50857fig10.jpg" /> Figura 10. Pole progetto magnetica. Le dimensioni sono espressi in cm. <img alt="Figura 11" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50857/50857fig11highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50857/50857fig11.jpg" /> Figura cablaggio pinzette magnetiche 11.. </strong&gt; A sostegno di ottone - vista laterale con dimensioni in Pannello A - viene utilizzato per avvolgere strettamente i 2120 giri di filo di rame e costruire la bobina magnetica (pannello B) prima di inserire il morbido polo magnetico lega nel suo centro. La corrente continua viene fornito in bobina definizione di polarità magnetica come mostrato in pannello C. Vedi anche sperimentare schizzo panoramica nella Figura 4. Video 1: Questo film mostra la fase iniziale del biofilm appena dopo l&#39;iniezione della miscela di cellule particella nel capillare. Frequenza di acquisizione è 1 image / sec e il filmato viene riprodotto a 10 fotogrammi / sec. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50857/JoVE_Video1.avi" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare questo video.</a> Video 2: Questo film mostra il biofilm dopo 4 ore di crescita. Le particelle si liberano dalla superficie da distribuire nel b<html> il volume iofilm, frecce blu indicano gli eventi di distacco. Frequenza di acquisizione è 2 image / min e il filmato viene riprodotto a 15 fotogrammi / sec. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50857/JoVE_Video2.avi" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare questo video.</a> Video 3: biofilm dopo 20 ore di crescita. Il film è preso in un piano medio si trova a 20 micron sopra la parte inferiore capillare. Le immagini sono state acquisite a 2 images / min frequenza e il filmato viene riprodotto a 15 fotogrammi / sec. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50857/JoVE_Video3.avi" target="_blank">Cliccate qui per vedere il video.</a> Video 4: particle tracking tipica utilizzando ImageJ. Il film mostra un estratto di tutta la sequenza di partenza al momento 23 sec e termina al tempo 30 sec. Traiettoria giallo indica lo spostamento delle particelle su azionamento magnetico. Frequenza di acquisizione è di 30 immagini / sec e il filmato viene riprodotto a 30 fotogrammi / sec.https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50857/JoVE_Video4.avi &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per visualizzare questo video.

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Remote Magnetic Actuation of Micrometric Probes for in situ 3D Mapping of Bacterial Biofilm Physical Properties

Questo documento mostra un metodo originale basato sul comando a distanza di particelle magnetiche seminate in un biofilm batterico e lo sviluppo di pinzette magnetiche dedicate per misurare in situ le proprietà meccaniche locali del materiale vivente complesso costruito dai microrganismi alle interfacce.

Azionamento a distanza magnetica micrometrici Sonde per<em&gt; In situ</em&gt; Mappatura 3D di biofilm batterici Proprietà fisiche

Bacterial adhesion and growth on interfaces lead to the formation of three-dimensional heterogeneous structures so-called biofilms. The cells dwelling in ...

remote-magnetic-actuation-micrometric-probes-for-situ-3d-mapping

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Remote Magnetic Actuation of Micrometric Probes for in situ 3D Mapping of Bacterial Biofilm Physical Properties

9.1K Views.  Sorbonne Universités, UPMC.  Questo documento mostra un metodo originale basato sul comando a distanza di particelle magnetiche seminate in un biofilm batterico e lo sviluppo di pinzette magnetiche dedicate per misurare in situ le proprietà meccaniche locali del materiale vivente complesso costruito dai microrganismi alle interfacce. 

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Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not have been accomplished by other approaches1. With the use of the calcium- and voltage-sensitive dyes, optical mapping allows measurement of transmembrane action potentials and calcium transients with high spatial resolution without the physical contact with the tissue. This makes measurements of the cardiac electrical activity possible under many conditions where the use of electrodes is inconvenient or impossible1. For example, optical recordings provide accurate morphological changes of membrane potential during and immediately after stimulation and defibrillation, while conventional electrode techniques suffer from stimulus-induced artifacts during and after stimuli due to electrode polarization1. 
The Langendorff-perfused rabbit heart is one of the most studied models of human heart physiology and pathophysiology. Many types of arrhythmias observed clinically could be recapitulated in the rabbit heart model. It was shown that wave patterns in the rabbit heart during ventricular arrhythmias, determined by effective size of the heart and the wavelength of reentry, are very similar to that in the human heart2. It was also shown that critical aspects of excitation-contraction (EC) coupling in rabbit myocardium, such as the relative contribution of sarcoplasmic reticulum (SR), is very similar to human EC coupling3. Here we present the basic procedures of optical mapping experiments in Langendorff-perfused rabbit hearts, including the Langendorff perfusion system setup, the optical mapping systems setup, the isolation and cannulation of the heart, perfusion and dye-staining of the heart, excitation-contraction uncoupling, and collection of optical signals. These methods could be also applied to the heart from species other than rabbit with adjustments to flow rates, optics, solutions, etc.
Two optical mapping systems are described. The panoramic mapping system is used to map the entire epicardium of the rabbit heart4-7. This system provides a global view of the evolution of reentrant circuits during arrhythmogenesis and defibrillation, and has been used to study the mechanisms of arrhythmias and antiarrhythmia therapy8,9. The dual mapping system is used to map the action potential (AP) and calcium transient (CaT) simultaneously from the same field of view10-13. This approach has enhanced our understanding of the important role of calcium in the electrical alternans and the induction of arrhythmia14-16.

This article describes the basic procedures for conducting optical mapping experiments in the Langendorff-perfused rabbit heart using the panoramic imaging system, and the dual (voltage and calcium) imaging modality.

Multiparametrica mappatura ottica del Langendorff-perfuso Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Ricerca

Bioingegneria

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

Mappatura ottico dei potenziali d&#39;azione e transitori Calcio nel Cuore mouse

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Magnetically-Assisted Remote Controlled Microcatheter Tip Deflection under Magnetic Resonance Imaging

X-ray fluoroscopy-guided endovascular procedures have several significant limitations, including difficult catheter navigation and use of ionizing radiation, which can potentially be overcome using a magnetically steerable catheter under MR guidance.
	The main goal of this work is to develop a microcatheter whose tip can be remotely controlled using the magnetic field of the MR scanner. This protocol aims to describe the procedures for applying current to the microcoil-tipped microcatheter to produce consistent and controllable deflections.
	A microcoil was fabricated using laser lathe lithography onto a polyimide-tipped endovascular catheter. In vitro testing was performed in a waterbath and vessel phantom under the guidance of a 1.5-T MR system using steady-state free precession (SSFP) sequencing. Various amounts of current were applied to the coils of the microcatheter to produce measureable tip deflections and navigate in vascular phantoms.
	The development of this device provides a platform for future testing and opportunity to revolutionize the endovascular interventional MRI environment.

Current applied to an endovascular microcatheter with microcoil tip made by laser lathe lithography can achieve controllable deflections under magnetic resonance (MR) guidance, which may improve speed and efficacy of navigation of vasculature during various endovascular procedures.

Magneticamente-Assisted Remote Controlled Suggerimento Flessione Microcatetere in Risonanza Magnetica

X-ray fluoroscopy-guided  endovascular procedures have several significant limitations, including  difficult catheter navigation and use of ionizing ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide nanoparticles (IONP) (Fe3O4) to yield a magnetic bacterial nanocellulose (MBNC). The synthesis of MBNC is a precise and specifically designed multi-step process. Briefly, bacterial nanocellulose (BNC) pellicles are formed from preserved G. xylinus strain according to our experimental requirements of size and morphology. A solution of iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3&#183;6H2O) and iron(II) chloride tetrahydrate (FeCl2&#183;4H2O) with a 2:1 molar ratio is prepared and diluted in deoxygenated high purity water. A BNC pellicle is then introduced in the vessel with the reactants. This mixture is stirred and heated at 80 &#176;C in a silicon oil bath and ammonium hydroxide (14%) is then added by dropping to precipitate the ferrous ions into the BNC mesh. This last step allows forming in situ magnetite nanoparticles (Fe3O4) inside the bacterial nanocellulose mesh to confer magnetic properties to BNC pellicle. A toxicological assay was used to evaluate the biocompatibility of the BNC-IONP pellicle. Polyethylene glycol (PEG) was used to cover the IONPs in order to improve their biocompatibility. Scanning electron microscopy (SEM) images showed that the IONP were located preferentially in the fibril interlacing spaces of the BNC matrix, but some of them were also found along the BNC ribbons. Magnetic force microscope measurements performed on the MBNC detected the presence magnetic domains with high and weak intensity magnetic field, confirming the magnetic nature of the MBNC pellicle. Young&#39;s modulus values obtained in this work are also in a reasonable agreement with those reported for several blood vessels in previous studies.

Here, we present a protocol to make a bacterial nanocellulose (BNC) magnetic for applications in damaged blood vessel reconstruction. The BNC was synthesized by G. xylinus strain. On the other hand, magnetization of the BNC was realized through in situ precipitation of Fe2+ and Fe3+ ferrous ions inside the BNC mesh.

Realizzazione di un funzionalizzato magnetico batterica Nanocellulose con nanoparticelle di Ossido di Ferro

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

In Situ mappatura delle proprietà meccaniche del biofilm da-Particle tracciamento Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

Preparazione del 3D collagene Gel e microcanali per lo studio delle interazioni 3D<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan electron-paramagnetic-resonance (RS-EPR), which can provide quantitative information under in vivo conditions on oxygen concentration, pH, redox status and concentration of signaling molecules (i.e., OH&#8226;, NO&#8226;). The RS-EPR technique has a higher sensitivity, improved spatial resolution (1 mm), and shorter acquisition time in comparison to the standard continuous wave (CW) technique. A variety of phantom configurations have been tested, with spatial resolution varying from 1 to 6 mm, and spectral width of the reporter molecules ranging from 16 &#181;T (160 mG) to 5 mT (50 G). A cross-loop bimodal resonator decouples excitation and detection, reducing the noise, while the rapid scan effect allows more power to be input to the spin system before saturation, increasing the EPR signal. This leads to a substantially higher signal-to-noise ratio than in conventional CW EPR experiments.

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

A new electron paramagnetic resonance (EPR) method, rapid scan EPR (RS-EPR), is demonstrated for 2D spectral spatial imaging which is superior to the traditional continuous wave (CW) technique and opens new venues for in vivo imaging. Results are demonstrated at 250 MHz, but the technique is applicable at any frequency.

Rapid Scan paramagnetica elettronica Risonanza apre nuove strade per l&#39;imaging Fisiologicamente parametri importanti<em&gt; In Vivo</em

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach recently explored for the development of autologous replacements involves the differentiation of stem cells into chondrocytes. To initiate this chondrogenesis, a degree of compaction of the stem cells is required; hence, we demonstrated the feasibility of magnetically condensing cells, both within thick scaffolds and scaffold-free, using miniaturized magnetic field sources as cell attractors. This magnetic approach was also used to guide aggregate fusion and to build scaffold-free, organized, three-dimensional (3D) tissues several millimeters in size. In addition to having an enhanced size, the tissue formed by magnetic-driven fusion presented a significant increase in the expression of collagen II, and a similar trend was observed for aggrecan expression. As the native cartilage was subjected to forces that influenced its 3D structure, dynamic maturation was also performed. A bioreactor that provides mechanical stimuli was used to culture the magnetically seeded scaffolds over a 21-day period. Bioreactor maturation largely improved chondrogenesis into the cellularized scaffolds; the extracellular matrix obtained under these conditions was rich in collagen II and aggrecan. This work outlines the innovative potential of magnetic condensation of labeled stem cells and dynamic maturation in a bioreactor for improved chondrogenic differentiation, both scaffold-free and within polysaccharide scaffolds.

Chondrogenesis from stem cells requires fine tuning the culture conditions. Here, we present a magnetic approach for condensing cells, an essential step to initiate chondrogenesis. In addition, we show that dynamic maturation in a bioreactor applies mechanical stimulation to the cellular constructs and enhances cartilaginous extracellular matrix production.

3D Stem magnetica cellulare Aggregazione e bioreattore maturazione per la cartilagine Regeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both cartilage and skin analogs were fabricated after bioink pre-cellularization utilizing a novel passive mixing unit technique. This technique was developed with the aim to simplify the steps involved in the mixing of a cell suspension into a highly viscous bioink. The resolution of filaments deposited through bioprinting necessitates the assurance of uniformity in cell distribution prior to printing to avoid the deposition of regions without cells or retention of large cell clumps that can clog the needle. We demonstrate the ability to rapidly blend a cell suspension with a bioink prior to bioprinting of both cartilage and skin analogs. Both tissue analogs could be cultured for up to 4 weeks. Histological analysis demonstrated both cell viability and deposition of tissue specific extracellular matrix (ECM) markers such as glycosaminoglycans (GAGs) and collagen I respectively.

Cartilage and skin analogs were bioprinted using a nanocellulose-alginate based bioink. The bioinks were cellularized prior to printing via a single step passive mixing unit. The constructs were demonstrated to be uniformly cellularized, have high viability, and exhibit favorable markers of differentiation.

Multimateriali di cartilagine e pelle tessuto analoghi utilizzando un romanzo passivo unità tecnica di miscelazione per Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Optimized Setup and Protocol for Magnetic Domain Imaging with In Situ Hysteresis Measurement

This paper elaborates the sample preparation protocols required to obtain optimal domain patterns using the Bitter method, focusing on the extra steps compared to standard metallographic sample preparation procedures. The paper proposes a novel bespoke rig for dynamic domain imaging with in situ BH (magnetic hysteresis) measurements and elaborates the protocols for the sensor preparation and the use of the rig to ensure accurate BH measurement. The protocols for static and ordinary dynamic domain imaging (without in situ BH measurements) are also presented. The reported method takes advantage of the convenience and high sensitivity of the traditional Bitter method and enables in situ BH measurement without interrupting or interfering with the domain wall movement processes. This facilitates establishing a direct and quantitative link between the domain wall movement processes&#8211;microstructural feature interactions in ferritic steels with their BH loops. This method is anticipated to become a useful tool for the fundamental study of microstructure&#8211;magnetic property relationships in steels and to help interpret the electromagnetic sensor signals for non-destructive evaluation of steel microstructures.

Optimized Setup and Protocol for Magnetic Domain Imaging with In Situ Hysteresis Measurement

This paper elaborates the sample and sensor preparation procedures and the protocols for using the test rig particularly for dynamic domain imaging with in situ BH measurements in order to achieve optimal domain pattern quality and accurate BH measurements.

Installazione ottimizzata e protocollo per l'Imaging di dominio magnetico con In Situ isteresi misura

This paper elaborates the sample preparation protocols required to obtain optimal domain patterns using the Bitter method, focusing on the extra steps ...