Questo lavoro è stato sostenuto da NSF concedere IOS 1121692, e dalla University of Research Foundation di Washington.

1. Follection volatile <ol><li> In questo esempio, usiamo campioni volatili da M. fiori lewisii - un nativo alpino wildflower in California. Volatili vengono raccolti con metodi dinamici di assorbimento secondo Riffell et al. 14. In breve, questo metodo impiega un sistema di condensazione ad anello chiuso in cui sono racchiusi i fiori in un sacchetto di Teflon. Utilizzando una pompa a vuoto inerte, l&#39;aria intorno ai fiori viene aspirata attraverso una &quot;trappola&quot; composto da una pipetta Pasteur riempito con Porapak Q matrice. L&#39;aria di ritorno dalla pompa viene filtrata dal carbone attivo. Dopo un periodo di tempo prescritto, nel nostro caso 24 h, la Porapak Q matrice viene eluito con un solvente non polare, tipicamente esano, per raccogliere l&#39;estratto concentrato. L&#39;estratto viene quindi memorizzato in -80 ° C fino all&#39;analisi. Se necessario, i campioni possono essere concentrato prima dell&#39;analisi sotto flusso di azoto. A meno che il campione è già ben caratterizzata, eseguire una aliquota di esso attraverso unagas cromatografo-spettrometro di massa (GC-MS) per identificare i componenti volatili prima di utilizzare il campione. </li></ol> 2. Preparazione elettrofisiologica <ol><li> Tagliare circa 1 cm dall&#39;estremità di una punta di pipetta 1000 microlitri. Mettere un calabrone (Bombus impatiens) nella base della punta della pipetta e spingere delicatamente verso l&#39;estremità opposta della punta fino a che solo la testa è esposta. </li><li> Fondere la cera dentale e plasmarlo intorno alla testa esposta, facendo in modo che aderisca cera sul occhi composti per la sicurezza e per rendere la testa dell&#39;ape completamente immobile. Assicurarsi di non avere la cera sul antenna delle api. </li><li> Una volta che la testa è sicuro, fare una, piazza finestra tipo, incisione nella capsula testa con una lama di rasoio automatico o la dimensione appropriata bisturi per tagliare la cuticola. Utilizzando la lama dell&#39;interruttore, partire dal lato dorsale della capsula testa, immediatamente dietro l&#39;antenna e adiacente a uno degli occhi composti. Tagliouna linea retta, composto da un occhio all&#39;occhio composto controlaterale. Dopo il taglio di una linea retta per l&#39;occhio composto contrario, cominciare a fare un&#39;incisione sul dorso fino a quando le curve capsula testa e finisce vicino al suo torace. A questo punto, comincia a tagliare verso l&#39;estremità opposta della capsula testa. Infine, una volta che la linea è stata tagliata all&#39;estremità opposta, tagliare una linea indietro fino alla posizione di partenza della incisione iniziale. È importante rimuovere la cuticola che è adiacente all&#39;antenna, poiché ciò impedirà l&#39;inserimento dell&#39;elettrodo. </li><li> Una volta che la cuticola è tagliato, usare un paio di pinze per rimuovere la cuticola delle api, che dovrebbe quindi esporre il cervello delle api e, soprattutto, i lobi antennali. Iniziare immediatamente superfusing cervello con soluzione salina insetto, in modo che il cervello non diventa essiccato. Dopo il cervello è esposto, accuratamente usare un paio di pinze molto fini per rimuovere la guaina perineurale immediatamente sopra i lobi antennali. Fare molta attenzione a nonperforare il cervello dell&#39;ape con le pinze. </li></ol> 3. Gascromatografia con Multi-channel di registrazione <ol><li> La &quot;preparazione&quot; ape - fissata in un tubo con il suo cervello esposto - è ora pronto per la registrazione elettrofisiologica. Posizionare l&#39;ape in un morsetto, fissati ad una base magnetica che si trova su un tavolo aria. </li><li> Organizzare una sacca IV, regolatore di flusso, e tubi (riempito con soluzione fisiologica insetto) in modo che la soluzione salina superfuses continuamente il cervello. </li><li> Utilizzando un micromanipolatore, elettrodo insertareference, fatto di filo di tungsteno, nell&#39;occhio dell&#39;ape. </li><li> Utilizzando un micromanipolatore separato, inserire l&#39;elettrodo multicanale, ad esempio un tetrodo filo a spirale, o silicio multicanale elettrodo (NeuroNexus Technologies), nei lobi antennali delle api. Questo elettrodo è collegato ad un pre-amplificatore, come il sistema TDT S-3 serie Z alla Z-bus processore bioamp del sistema TDT. Uscita dal Chro GasRilevatore di matogram tramite un cavo schermato BNC può essere interfacciato con il sistema di acquisizione dati amplificatore e tale che sia il segnale neurale e GC è sincronizzato. </li><li> Attendere circa 30-60 minuti per le registrazioni neurali per stabilizzare. Una volta che l&#39;attività spontanea e la forma d&#39;onda delle quote dei canali di registrazione sono diventati coerente, utilizzare una siringa odore di stimolare l&#39;ape ed osservare la risposta dei canali di registrazione per l&#39;odore. </li><li> Registrare picchi extracellulari di neuroni da auto-sogliatura i canali di registrazione da 3,5-5 sigma del segnale sui canali di registrazione individuali. Soglia manuale può essere richiesto per alcuni canali per evitare la contaminazione da disturbi elettrici. I potenziali d&#39;azione di neuroni appaiono come picchi di tensione nel canale di registrazione. Quando la tensione del canale supera la soglia, il sistema di buffer e salva i pochi millisecondi prima e dopo l&#39;attraversamento della soglia, così takinga istantanea della forma d&#39;onda, o di picco. </li><li> Immediatamente accanto al tavolo aria è il GC. Prima di iniettare l&#39;estratto floreale nel GC, assicurarsi che il metodo per la rampa di temperatura della corsa GC è corretto. Nel nostro esempio, si utilizza un metodo di temperatura iniziale a 50 ° C per 4 min seguita da un aumento di temperatura ad una velocità di 10 ° C / min. a 220 ° C, momento in cui teniamo la GC per altri 6 min. Usiamo una colonna DB-5 GC (J &amp; W Scientific, Folsom, CA, USA), con elio come gas di trasporto. L&#39;ingresso è splitless, con una temperatura impostata a 200 ° C. Il rilevatore a ionizzazione di fiamma temperatura è impostato a 230 ° C. </li><li> Iniettare il campione estratto lo spazio di testa floreale nella porta di iniezione riscaldata del GC per rilasciare le sostanze volatili adsorbiti nella colonna GC. L&#39;effluente dalla colonna è divisa 1:1 tra il Rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID) e l&#39;antenna ape con una lente di &quot;Y&quot; (J &amp; W Scientific). Inizia recording dall&#39;elettrodo durante l&#39;iniezione di un campione nel GC. </li><li> Al termine della corsa GC ha finito, lasciate riposare la preparazione per 5 a 15 minuti. Allora o somministrazione di un altro campione nel GC o stimolare la preparazione con singoli composti volatili o miscele di composti. In questo secondo metodo di stimolare la preparazione, impulsi di aria da un flusso d&#39;aria costante vengono deviati attraverso una siringa di vetro contenente un pezzo di carta da filtro in cui i composti sono stati depositati. Lo stimolo odore era impulsi mediante un solenoide attivato valvola controllata dal software. </li><li> Se l&#39;attività unità si ferma improvvisamente o modifiche, consultare il fleboclisi e lasciate riposare la preparazione per 15 minuti. Se l&#39;attività spontanea non ritrovare il suo livello precedente il preparato deve essere eliminato e un&#39;altra ape utilizzata, se disponibile. </li><li> Dopo l&#39;esperimento, fissare il cervello con formalina al 5% per 20 minuti con la sonda ancora nel tessuto. Avanti, accisa il cervelloe metterlo in glutaraldeide al 2% per 4 ore, e successivamente fare una serie graduata di etanolo disidratazione e cancellare il cervello con salicilato di metile. In base alla fissazione e di compensazione del tessuto, le posizioni nel AL cui gli elettrodi perforato il tessuto deve essere chiaramente distinguibile mediante microscopia confocale. </li></ol> 4. Analisi dei dati <ol><li> Analizzare i dati raccolti dopo l&#39;esperimento di separare e identificare le unità registrate neurali. Utilizzare programmi software tipici (Sorter Offline, MClust e SClust) per forme d&#39;onda separate, o &quot;picchi&quot;, basata su forme a spillo, come picco o valle ampiezza picco a metà larghezza, ecc, o misure ridotte (componenti principali) 17 , 18 (Figura 2). Utilizzare solo quei cluster di picchi che separati in uno spazio tridimensionale (PC1-PC3) e sono statisticamente diversi tra loro (ANOVA multivariata; p &lt;0,05) (Figura 2) per ulteriori analisi. Si prega di fare riferimento alcitazione # s 17-19 per la descrizione completa di registrazione tetrodo e spike-ordinamento metodologie. </li><li> Time-stamp picchi di ciascun cluster, ed esportare questi dati per l&#39;analisi utilizzando MATLAB o Neuroexplorer (Nex Technologies, Winston-Salem, NC) per creare grafici raster e le risposte dei tassi di cottura (figure 2, 3A). </li><li> Identificare i tempi di ritenzione dei volatili utilizzando i dati simultaneamente registrati GC. Utilizzare i tempi di ritenzione dei volatili, determinate dal vertice del picco del cromatogramma, per esaminare i unitari a quei punti temporali. </li><li> Per esaminare le risposte per singola unità attraverso la corsa GC, bin il numero di punte in 100 msec ed esaminare il time-course di sparare risposte a tasso con riferimento al tempo di ritenzione di eluizione volatili. Il binning dei picchi in 100 msec fornisce dettagli sufficienti, o segnale, in merito ai tempi corso della risposta neuronale a un odorizzante eluizione dal GC. </li><li> Per exaestrarre le risposte della popolazione al volatiles eluizione differenti, introdurre le risposte di frequenza di attivazione di singole unità su una finestra di campionamento 3 sec, 1.5 sec prima e dopo 1,5 secondi, il tempo di ritenzione del volatile (Figura 3). Questo periodo di tempo è tipico della durata di un eluizione volatile dalla GC. Mostriamo sparare risposte a tasso delle unità di codifica a colori delle loro (il rosso è un alto tasso di risposta fuoco, blu, è una risposta bassa) e l&#39;organizzazione come una matrice attività con ogni riga che rappresenta la risposta insieme al effluente GC (colonne) ( figura 3). </li></ol>

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Insetti olfatto-mediate comportamenti guidare molti processi diversi, tra cui la riproduzione, host-selezione del sito, e l&#39;individuazione di risorse alimentari adeguate. Lo studio di questi processi richiede la capacità di identificare i composti volatili emessi dalla sorgente, così come la capacità di identificare i composti che vengono mediano i comportamenti. A complicare le cose è che gli odori sono costituiti da decine a centinaia di singoli composti che insieme creano un profumo unico che viene percepito diversamente i singoli costituenti 6,7,13,19,20. Ricerca, inizialmente condotta nel sistema feromone sessuale 12, e più recentemente in odori alimentari e ovideposizione connesse 13,20, ha dimostrato che l&#39;efficacia comportamentale della miscela risiede in funzione di qualche chiave, volatili nella miscela, e che le miscele di suscitare risposte significativamente maggiori comportamentali rispetto ai singoli componenti. Identificare quelli chiavecomponenti è quindi una componente importante nella moderna ecologia chimica e neurobiologia olfattivo. Una varietà di tecniche sono sorti negli ultimi 50 anni per l&#39;identificazione di composti bioattivi che guidare il comportamento degli insetti. La tecnica principale per la rilevazione delle sostanze volatili dalla antenna insetto è gas-cromatografia electroantennography (GC-EAG). GAE è stato originariamente sviluppato da Schneider 21 anni, che ha registrato piccole fluttuazioni di tensione in genere presume essere causata da depolarizzazione elettrica di molti neuroni olfattivi tra la punta e la base di una antenna insetto durante la stimolazione. GAE è stato successivamente integrato con il GC per l&#39;identificazione precisa dei volatili dello spazio di testa che suscitano risposte antennali 12,22. Inoltre, la registrazione di singoli neuroni recettori dall&#39;antenna insetto è stata poi sviluppata 11,23 e accoppiato con il GC per fornire singolo sensillum registrazioni o GC-SSR. Lanche se GC-SSR è più tempo ed è difficile che GC-EAG, le registrazioni forniscono informazioni in merito alle risposte delle singole celle tramite potenziali d&#39;azione in risposta ai GC-effluenti, e permette l&#39;identificazione di quei recettori che sono specializzati per particolari composti che potrebbe perdere da GC-EAG 24. La GC-EAG e GC-SSR tecniche offrono l&#39;identificazione di quei volatili che suscitano risposte alla periferia, e sono quindi coinvolte nella ricezione odorizzante. Le tecniche più recenti hanno iniziato a esaminare le risposte del sistema nervoso centrale dei mammiferi e insetti, e sono quindi coinvolte nella percezione odorizzante. Queste tecniche si dividono in due grandi categorie: metodi di imaging chiamato GC 25-I (gas cromatografia-imaging) e dirette (ad esempio i metodi elettrofisiologici GCMR). GC-I e GCMR offrono diversi vantaggi per la convergenza dei neuroni sensoriali alla proiezione, o di uscita, neuroniAL, nonché che questi metodi permettono la determinazione di come odoranti sono rappresentati nel cervello insetto. Inoltre, metodi simili vengono ora utilizzati nel cervello dei mammiferi 25. Nonostante questi vantaggi, GCMR e GC-Offro svantaggi pure. Analisi dei dati può richiedere molto tempo, e nel caso del GCMR, proiezioni glomerulari delle unità registrate neurali sono noti per le registrazioni essendo extracellulare. Inoltre, l&#39;insetto AL è innervato da vari tipi neuronali inclusi neuroni di proiezione (PN) e interneuroni locali (LN) rendendo identificazione delle unità registrate difficili. Tuttavia, la falena, M. sexta, lavoro recente ha dimostrato che PN e LNS possono essere identificati dal comportamento spiking dei neuroni, permettendo quindi l&#39;identificazione di questi tipi di neuroni dalla loro attività spontanea 26. Tuttavia, GCMR e GC-I consente l&#39;identificazione delle odoranti che attivataneuroni recettori elettronici specializzati che non possono suscitare risposte EAG forti, oltre a determinare come la popolazione di neuroni nel processo cervello le sostanze volatili. Uno studio di confronto tra queste differenti metodologie non è stato ancora effettuato, anche se i nostri dati preliminari suggeriscono che il GCMR può essere più adatto rispetto al GC-EAG per questi composti bioattivi che sono, ma sono a livello di tracce nell&#39;estratto (Riffell risultati non pubblicati). Il lavoro futuro può esaminare il trade-off nella sensibilità di rilevare odoranti bioattivi con il tempo di analisi tra le diverse metodologie. Anche se ci siamo concentrati qui in dettaglio i metodi di analisi che utilizziamo per B. api impatiens e il profumo da M. lewisii, l&#39;estratto e le specie di insetti utilizzati possono essere modificate se alcune modifiche sono fatti. Specie di insetti possono essere posizionati in puntali differenti (da 10 a 200 pl) a seconda della loro dimensione. Specie più grandi, come la falena, ManducaSexta, può essere collocato in 6 fiale ml di campione. In tal modo, il preparato viene mantenuto vivo consentendo registrazioni stabili diverse ore di durata. Nel loro insieme, i metodi analitici per l&#39;isolamento di composti insieme con registrazioni elettrofisiologiche cerebrali negli insetti presenti potenti strumenti per l&#39;identificazione di composti bioattivi, e se usato in tandem con esperimenti comportamentali, può costituire un mezzo per determinare volatili importanti legati all&#39;alimentazione comportamenti negli insetti 13, così come coloro che sono coinvolti in host-sito 2, e il sangue-host comportamenti correlati 27 che sono importanti per i parassiti agricoli e vettori della malattia.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome della voce </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Porapak Tipo Q 80-100 maglia </td><td> Waters </td><td> WAT027060 </td><td></td></tr><tr><td> Reynolds Forno Borse </td><td> Reynolds </td><td></td><td></td></tr><tr><td> GC </td><td> Agilent </td><td> 7820A </td><td></td></tr><tr><td> GC colonna </td><td> J &amp; W Scientific, Folsom, CA, USA </td><td> DB-5 (30 m, 0,25 mm, 0,25 micron) </td><td></td></tr><tr><td> Analitica elio gas di trasporto </td><td> Praxair </td><td> HE K </td><td> 1 cc / min </td></tr><tr><td> 16-canale di silicio elettrodo </td><td> NeuroNexus Techndologie </td><td> a4x4-3mm50-177 </td><td></td></tr><tr><td> Filo NiCr Bene, 0,012 mm di diametro) </td><td> Sandvik Kanthal HP Reid </td><td> PX000004 </td><td> Per fare tetrodi personalizzati e stereotrodes </td></tr><tr><td> Pre-amplificatore </td><td> Tucker-Davis sistema </td><td> PZ-2 </td><td></td></tr><tr><td> Amplificatore </td><td> Tucker-Davis sistema </td><td> RZ-2 </td><td></td></tr><tr><td> Sistema di acquisizione dati - OpenEx Suite </td><td> Tucker-Davis sistema </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Online spike-ordinamento software - SpikePac </td><td> Tucker-Davis sistema </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Offline spike-ordinamento software - Mclust Spike-ordinamento toolbox </td><td> David Redish, Dipartimento di Neuroscienze, Universitàdel Minnesota </td><td> Download gratuito a <a href="http://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.html" target="_blank">http://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.html</a> </td><td> Toolbox MATLAB </td></tr></tbody></table>

identification of olfactory volatiles using gas chromatography-multi-unit recordings (gcmr) in the insect antennal lobe

Tutti gli organismi vivono in un mondo pieno di stimoli sensoriali che determinano la loro risposta comportamentale e fisiologica al loro ambiente. Olfatto è particolarmente importante negli insetti, che utilizzano i loro sistemi olfattivi di rispondere, e discriminare tra odori, stimoli complessi. Questi odori sollecitare comportamenti che mediano i processi come la riproduzione e la selezione dell&#39;habitat 1-3. Inoltre, il rilevamento chimico di mediare insetti comportamenti che sono di grande importanza per l&#39;agricoltura e la salute umana, compresa l&#39;impollinazione 4-6, erbivori delle colture alimentari 7, e la trasmissione di malattie 8,9. Identificazione dei segnali olfattivi e il loro ruolo nel comportamento degli insetti è quindi importante per capire sia i processi ecologici e le risorse di cibo umano e il benessere. Ad oggi, l&#39;identificazione di sostanze volatili che guidano il comportamento degli insetti è stato difficile e spesso noioso. Le tecniche attuali sonogas cromatografia-coupled registrazione electroantennogram (GC-EAG), e gas cromatografia accoppiata singole registrazioni sensillum (GC-SSR) 10-12. Queste tecniche rivelato fondamentale per l&#39;identificazione di composti bioattivi. Abbiamo messo a punto un metodo che utilizza la gascromatografia accoppiata a multicanale registrazioni elettrofisiologiche (definito &#39;GCMR&#39;) dai neuroni nel lobo antennale (AL; principale centro olfattivo degli insetti) 13,14. Questo stato-of-the-art tecnica permette di sondare come informazioni odore viene rappresentata nel cervello insetto. Inoltre, poiché le risposte neurali agli odori a questo livello di elaborazione olfattiva sono causa molto sensibili al grado di convergenza dei neuroni recettori dell&#39;antenna in neuroni AL, AL registrazioni permetterà di costituenti attivi di odori naturali efficiente e con elevata sensibilità. Qui descriviamo GCMR e dare un esempio del suo utilizzo. Diversi passaggi generali sono coinved nella rilevazione di sostanze volatili bioattivi e risposta insetti. Volatili necessario prima di essere raccolti da fonti di interesse (in questo esempio si usa fiori dal genere Mimulus (Phyrmaceae)) e caratterizzata, se necessario utilizzando le normali tecniche di GC-MS 14-16. Insetti sono preparati per studio utilizzando dissezione minima, dopo di che un elettrodo di registrazione viene inserito nel lobo antennale e multi-canale neurale inizia. Post-processing dei dati neurali poi rivela che odori particolari causare notevoli risposte neurali del sistema nervoso degli insetti. Anche se l&#39;esempio che presentiamo qui è specifico per gli studi di impollinazione, GCMR può essere estesa ad una vasta gamma di organismi di studio e fonti volatili. Per esempio, questo metodo può essere utilizzato per l&#39;identificazione di odoranti attrarre o respingere insetti vettori ei parassiti delle piante. Inoltre, GCMR può anche essere utilizzato per identificare attrattivi per gli insetti benefici, come Pollinators. La tecnica può essere estesa a soggetti non-insetti pure.

Nel saggio GCMR utilizzando il M. lewisii profumo floreale, abbiamo iniettare 3 ml di estratto nel GC. Il numero totale di sostanze volatili di eluizione attraverso il GC è in genere 60-70 volatili. Il profumo di M. lewisii è prevalentemente composta monoterpenoids, compresi β-mircene (aciclico) e α-pinene, con il resto del profumo composto di sei atomi di carbonio volatili, come 2-esanolo e sesquiterpenoidi che compongono &lt;1% di spazio di testa. GCMR sfrutta la sensibilità dei neuroni lobi antennali nonché l&#39;elaborazione neuronale di volatili biologicamente importanti. Tuttavia, registrazioni multicanale di questo tipo, in effetti, prendere un campione casuale di neuroni nel lobo antennale. Questo perché piccole variazioni della posizione della posizione della sonda tra diverse preparazioni possono causare l&#39;array di registrazione per campionare neuroni differenti. Inoltre, le posizioni esatte e morphologies dei neuroni registrati non sono noti perché la registrazione è extracellulare. Per accogliere per questi effetti, abbiamo tipicamente eseguire esperimenti GCMR 8 a 16 preparazioni, con 8 a 18 unità neurali in ciascun preparato. Per scopi di illustrazione, tuttavia, useremo i dati da una sola preparazione (8 unità). Dagli esperimenti GCMR, abbiamo trovato che le unità sono sorprendentemente selettivi nella loro risposta al volatili, come illustrato nella figura 3A. La traccia inferiore (in nero) indica il cromatogramma ionico, dove ogni picco corrisponde a un instabile, visto che è in arrivo al rivelatore nel tempo. La traccia superiore (blu) mostra le risposte in frequenza di attivazione di una unità. Risposte unitari sono stati calcolati binning il numero di punte prodotte in un intervallo di 100 msec, e dividendo per questo arco di tempo per produrre la velocità. Nell&#39;esempio, l&#39;unità neurale è selettivo in risposta a D-limonene. Si noti che, in questa unità, il firin spontaneatasso di g può essere ancora variabile e soggetto a fluttuazioni casuali. Tuttavia, le risposte a D-limonene erano ben al di sopra dell&#39;intervallo di confidenza del 95%, come calcolato dalla varianza nelle risposte frequenza di scarica nel tempo. Non tutte le unità, tuttavia, ha risposto ai volatili eluiti dal GC. Infatti, in media circa il 50% delle unità registrate in ogni insieme erano insensibili (Figura 3B). Ciò è sorprendente, data la diversità dei composti volatili nello spazio di testa floreale che sono eluizione dal GC. Tuttavia, la percentuale di unità che non rispondono in un insieme è sorprendentemente coerente tra preparativi, come si trova in studi precedenti 13,14. Oltre le risposte di singole unità, il sistema GCMR consente anche l&#39;analisi di livello di popolazione risposte alle odoranti eluiti dal GC. Nell&#39;esempio mostrato qui, non c&#39;è selettività insieme forte per un gruppo di odori diversi ( <strong&gt; Figura 3B). Il grafico in alto mostra il cromatogramma con ogni picco corrisponde a un odorizzante (numerato sul asse x). Odoranti 33 e 35 (D-limonene, e trans-β-Ocimene, rispettivamente) prodotta risposte robuste nell&#39;insieme, come rappresentato dal tasso cottura normalizzato di ciascuna unità nell&#39;insieme (scala di colore). <img src="/files/ftp_upload/4381/4381fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4381/4381fig1highres.jpg" /> Figura 1. Diagramma schematico di spazio di testa assorbimento e il sistema GCMR. (A) Nello schema, un fiore è racchiuso all&#39;interno di un sacchetto di Teflon, e utilizzando una pompa a vuoto, l&#39;aria dal sacchetto viene aspirata attraverso una trappola volatile (Porapak Q), per concentrare il emessa volatili. L&#39;aria viene filtrata e restituita al fiore allegata. (B) Il campione estratto lo spazio di testa floreale è iniettareed in GC e l&#39;effluente dalla colonna è divisa in modo tale che la metà del flusso entra o del GC rivelatore a ionizzazione di fiamma, e l&#39;altra metà dell&#39;effluente è portato da una linea di trasferimento riscaldata e arriva simultaneamente antenna dell&#39;ape. I potenziali d&#39;azione del complesso AL neurale vengono registrate in continuo extracellulare durante il minuto 20 di consegna odore via GC. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/4381/4381fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/4381/4381fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4381/4381fig2highres.jpg" /> Figura 2. Ordinamento delle unità registrate utilizzando il multi-canale matrice registrazione (MR) in AL dell&#39;ape. I due steli sono distanziati in modo tale che la matrice comprende un grande volume della AL. (A) La caratteristica forma d&#39;onda (ad esempio amp<html> litude, valle) di ogni &quot;spike&quot; nella registrazione tetrodo possono essere tracciati in uno spazio tridimensionale. Nell&#39;esempio qui illustrato, l&#39;altezza di ciascun picco in 3 dei 4 canali di registrazione è tracciata in 3-D. Perché ogni unità avrà una sua forma spike, le punte di una data unità si raggruppano, consentendo in tal modo le unità da identificare e ordinati l&#39;uno dall&#39;altro. Unità di visualizzazione mostrato evidenti differenze nelle risposte di cottura (B; trama raster) e la forma d&#39;onda (C) Posizionamento dei quattro canali su ogni gambo forniti registrazione di ampie zone in trasformazione glomeruli e neuropilo. Attività neurale è stata registrata su ciascuno dei quattro canali, tracciati in 3-dimensionale spazio (come indicato in A), e ordinati in base alle caratteristiche di forma d&#39;onda. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/4381/4381fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire figura</a> . modi &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/4381/4381fig3.jpg" alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4381/4381fig3highres.jpg"/> Figura 3. (A) Firing istogrammi della frequenza di risposte dell&#39;unità ai composti eluiti dalla M. lewisii spazio di testa estratto (l&#39;iniezione di 3 microlitri) (linea di fondo, nero). Odoranti Alcuni (ad esempio, D-limonene, freccia rossa) evocato risposte significative in unità (B) Risposta di tutte le unità che sono state registrate dal MR per ogni odorizzante eluito dalla GC.. La trama di superficie è un colore in base alle risposte normalizzati frequenza di scarica delle singole unità. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/4381/4381fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> .

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Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings GCMR in the Insect Antennal Lobe

Spunti olfattivi mediare molti differenti comportamenti in insetti, e sono spesso miscele complesse costituite da decine a centinaia di composti volatili. Mediante gascromatografia con registrazione multicanale nel lobo insetto antennale, si descrive un metodo per l&#39;identificazione di composti bioattivi.

Identificazione dei volatili olfattive utilizzando la gas cromatografia-Multi-unit Recordings (GCMR) nel lobo antennale Insetto

All  organisms inhabit a world full of sensory stimuli that determine their  behavioral and physiological response to their environment. Olfaction is ...

identification-olfactory-volatiles-using-gas-chromatography-multi

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings (GCMR) in the Insect Antennal Lobe

14.2K Views.  University of Washington. Spunti olfattivi mediare molti differenti comportamenti in insetti, e sono spesso miscele complesse costituite da decine a centinaia di composti volatili. Mediante gascromatografia con registrazione multicanale nel lobo insetto antennale, si descrive un metodo per l'identificazione di composti bioattivi.

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Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and other social interactions. The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy to conduct, and reliable method to assay olfactory function at the level of the olfactory epithelium. Since the 1956 description of the EOG by Ottoson in frogs1, the EOG recording has been applied in many vertebrates including salamanders, rabbits, rats, mice, and humans (reviewed by Scott and Scott-Johnson, 2002, ref. 2). The recent advances in genetic modification in mice have rekindled interest in recording the EOG for physiological characterization of olfactory function in knock-out and knock-in mice. EOG recordings have been successfully applied to demonstrate the central role of olfactory signal transduction components3-8, and more recently to characterize the contribution of certain regulatory mechanisms to OSN responses9-12.
Odorant detection occurs at the surface of the olfactory epithelium on the cilia of OSNs, where a signal transduction cascade leads to opening of ion channels, generating a current that flows into the cilia and depolarizes the membrane13. The EOG is the negative potential recorded extracellularly at the surface of the olfactory epithelium upon odorant stimulation, resulting from a summation of the potential changes caused by individual responsive OSNs in the recording field2. Comparison of the amplitude and kinetics of the EOG thus provide valuable information about how genetic modification and other experimental manipulations influence the molecular signaling underlying the OSN response to odor. 
Here we describe an air-phase EOG recording on a preparation of mouse olfactory turbinates. Briefly, after sacrificing the mouse, the olfactory turbinates are exposed by bisecting the head along the midline and removing the septum. The turbinate preparation is then placed in the recording setup, and a recording electrode is placed at the surface of the olfactory epithelium on one of the medial turbinates. A reference electrode is electrically connected to the tissue through a buffer solution. A continuous stream of humidified air is blown over the surface of the epithelium to keep it moist. The vapor of odorant solutions is puffed into the stream of humidified air to stimulate the epithelium. Responses are recorded and digitized for further analysis.

The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy-to-conduct, and reliable way of assessing olfactory function at the level of the olfactory epithelium. This protocol describes a recording setup, mouse tissue preparation, data collection, and basic data analysis.

Analizzando le risposte di topo neuroni olfattivi sensoriali che utilizzano l&#39;aria in fase di registrazione Electroolfactogram

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

Ricerca

Neuroscienze

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

Imaging di calcio di cattivi odori evocati risposte nel Drosophila Lobe antenne

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex behaviors such as food choice, predator, conspecific and mate recognition and other socially relevant cues. Olfactory receptor neurons (ORNs) are located in the dorsal part of the nasal cavity embedded in the olfactory epithelium. These bipolar neurons send an axon to the olfactory bulb (see Fig. 1, Reisert &amp; Zhao1, originally published in the Journal of General Physiology) and extend a single dendrite to the epithelial border from where cilia radiate into the mucus that covers the olfactory epithelium. The cilia contain the signal transduction machinery that ultimately leads to excitatory current influx through the ciliary transduction channels, a cyclic nucleotide-gated (CNG) channel and a Ca2+-activated Cl- channel (Fig. 1). The ensuing depolarization triggers action potential generation at the cell body2-4.
In this video we describe the use of the "suction pipette technique" to record odorant-induced responses from ORNs. This method was originally developed to record from rod photoreceptors5 and a variant of this method can be found at jove.com modified to record from mouse cone photoreceptors6. The suction pipette technique was later adapted to also record from ORNs7,8. Briefly, following dissociation of the olfactory epithelium and cell isolation, the entire cell body of an ORN is sucked into the tip of a recording pipette. The dendrite and the cilia remain exposed to the bath solution and thus accessible to solution changes to enable e.g. odorant or pharmacological blocker application. In this configuration, no access to the intracellular environment is gained (no whole-cell voltage clamp) and the intracellular voltage remains free to vary. This allows the simultaneous recording of the slow receptor current that originates at the cilia and fast action potentials fired by the cell body9. The difference in kinetics between these two signals allows them to be separated using different filter settings. This technique can be used on any wild type or knockout mouse or to record selectively from ORNs that also express GFP to label specific subsets of ORNs, e.g. expressing a given odorant receptor or ion channel.

Olfactory receptor neurons (ORNs) convert odor signals first into a receptor current that in turn triggers action potentials that are conveyed to second order neurons in the olfactory bulb. Here we describe the suction pipette technique to record simultaneously the odorant-induced receptor current and action potentials from mouse ORNs.

Odorizzante indotte risposte registrate da neuroni recettori olfattivi con la tecnica della pipetta di aspirazione

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Due registrazioni elettrofisiologiche di sinapticamente-evocati Risposte astrogliale e neuronale in acute fettine di ippocampo

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

Multi-unit Metodi di registrazione per caratterizzare l&#39;attività neurale nel Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Circuiti olfattive

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Tutta Monte immunomarcatura di recettore olfattivo neuroni nel<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Using Insect Electroantennogram Sensors on Autonomous Robots for Olfactory Searches

Robots designed to track chemical leaks in hazardous industrial facilities1 or explosive traces in landmine fields2 face the same problem as insects foraging for food or searching for mates3: the olfactory search is constrained by the physics of turbulent transport4. The concentration landscape of wind borne odors is discontinuous and consists of sporadically located patches. A pre-requisite to olfactory search is that intermittent odor patches are detected. Because of its high speed and sensitivity5-6, the olfactory organ of insects provides a unique opportunity for detection. Insect antennae have been used in the past to detect not only sex pheromones7 but also chemicals that are relevant to humans, e.g., volatile compounds emanating from cancer cells8 or toxic and illicit substances9-11. We describe here a protocol for using insect antennae on autonomous robots and present a proof of concept for tracking odor plumes to their source. The global response of olfactory neurons is recorded in situ in the form of electroantennograms (EAGs). Our experimental design, based on a whole insect preparation, allows stable recordings within a working day. In comparison, EAGs on excised antennae have a lifetime of 2 hr. A custom hardware/software interface was developed between the EAG electrodes and a robot. The measurement system resolves individual odor patches up to 10 Hz, which exceeds the time scale of artificial chemical sensors12. The efficiency of EAG sensors for olfactory searches is further demonstrated in driving the robot toward a source of pheromone. By using identical olfactory stimuli and sensors as in real animals, our robotic platform provides a direct means for testing biological hypotheses about olfactory coding and search strategies13. It may also prove beneficial for detecting other odorants of interests by combining EAGs from different insect species in a bioelectronic nose configuration14 or using nanostructured gas sensors that mimic insect antennae15.

We describe a protocol for using insect antennae in the form of electroantennograms (EAGs) on autonomous robots. Our experimental design allows stable recordings within a day and resolves individual odor patches up to 10 Hz. The efficiency of EAG sensors for olfactory searches is demonstrated in driving a robot toward an odor source.

Utilizzando Insetto Electroantennogram sensori sul robot autonomi per le ricerche olfattive

Robots designed to track chemical leaks in hazardous industrial facilities1 or explosive traces in landmine fields2 face the same problem as insects ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex Vivo preparati della lampadina vomeronasale Organo e accessori olfattivo intatto

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular recording has historically been a common technique used to study sensitivities of individual photoreceptor cells to different light stimuli that is still being used today. However, there remains a dearth of detailed methodology in the literature for researchers wishing to replicate intracellular recording experiments in the eye. Here we present the insect as a model for examining eye physiology more generally. Insect photoreceptor cells are located near the surface of the eye and are therefore easy to reach, and many of the mechanisms involved in vision are conserved across animal phyla. We describe the basic procedure for in vivo intracellular recording of photoreceptor cells in the eye of a butterfly, with the goal of making this technique more accessible to researchers with little prior experience in electrophysiology. We introduce the basic equipment needed, how to prepare a live butterfly for recording, how to insert a glass microelectrode into a single cell, and finally the recording procedure itself. We also explain the basic analysis of raw response data for determining spectral sensitivity of individual cell types. Although our protocol focuses on determining spectral sensitivity, other stimuli (e.g., polarized light) and variations of the method are applicable to this setup.

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

The electrophysiological technique of intracellular recording is demonstrated and used to determine spectral sensitivities of single photoreceptor cells in the compound eye of a butterfly.

Determinazione del fotorecettore cellulare Sensibilità spettrale in un modello da insetti<em&gt; In Vivo</em&gt; registrazioni intracellulari

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular ...

Insect-controlled Robot: A Mobile Robot Platform to Evaluate the Odor-tracking Capability of an Insect

Robotic odor source localization has been a challenging area and one to which biological knowledge has been expected to contribute, as finding odor sources is an essential task for organism survival. Insects are well-studied organisms with regard to odor tracking, and their behavioral strategies have been applied to mobile robots for evaluation. This "bottom-up" approach is a fundamental way to develop biomimetic robots; however, the biological analyses and the modeling of behavioral mechanisms are still ongoing. Therefore, it is still unknown how such a biological system actually works as the controller of a robotic platform. To answer this question, we have developed an insect-controlled robot in which a male adult silkmoth (Bombyx mori) drives a robot car in response to odor stimuli; this can be regarded as a prototype of a future insect-mimetic robot. In the cockpit of the robot, a tethered silkmoth walked on an air-supported ball and an optical sensor measured the ball rotations. These rotations were translated into the movement of the two-wheeled robot. The advantage of this "hybrid" approach is that experimenters can manipulate any parameter of the robot, which enables the evaluation of the odor-tracking capability of insects and provides useful suggestions for robotic odor-tracking. Furthermore, these manipulations are non-invasive ways to alter the sensory-motor relationship of a pilot insect and will be a useful technique for understanding adaptive behaviors.

The capability to localize an odor source is necessary for insect survival and is expected to be applicable to artificial odor-tracking. The insect-controlled robot is driven by an actual silkmoth and enables us to evaluate the odor-tracking capability of insects through a robotic platform.

Robot Insect-controllato: una piattaforma mobile Robot per valutare la capacità odore-tracking di un insetto

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Identificazione dei volatili olfattive utilizzando la gas cromatografia-Multi-unit Recordings (GCMR) nel lobo antennale Insetto

Riepilogo

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Tutta Monte immunomarcatura di recettore olfattivo neuroni nel

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