Gli autori desiderano ringraziare Priyanka Subrahmanyam per le discussioni utili. Gli autori non hanno concorrenti interesse finanziario. Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti della American Cancer Society, NIH / NCI K01 CA131487, CA162273 R21, R21 CA162277, P30 e immunologia dei tumori e Programma di Immunoterapia TJ Webb. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non necessariamente rappresentano le opinioni ufficiali del National Cancer Institute e il National Institutes of Health.

1. Generazione di AAPC <ol><li> Prima di aggiungere proteine ​​di perle, preparare tutti i reagenti e tamponi: tampone borato 0,1 M; 1X D-PBS (senza Ca 2 + e Mg 2 +); (azide 1X PBS + 5% siero umano AB + di sodio 0,02%), il tampone di lavaggio perlina ; terreno completo (medium RPMI 100 mM piruvato di sodio, 10 mM non essenziali soluzione di vitamine, 100 mM MEM soluzione Vitamina, 1% di 2-mercaptoetanolo, 10 mM ciprofloxacina, 5% di siero umano AB); tampone MACS (1 L PBS libera di Ca 2 + e Mg 2 +, 5 g BSA, e 2 mmol EDTA). </li><li> Sciacquare 1 ml Dynabeads M-450 perle di resina epossidica con 3 ml di soluzione salina 0,1 M tampone borato (acido borico e acqua, pH 7,0-7,4) in un flaconcino da 5 ml in vetro borosilicato trasparente filettata. </li><li> In un altro tubo 1,5 ml microcentrifuga, aggiungere 100 mg hCD1d Ig-dimero e 20 molecole co-stimolatorie mcg (esempio: anti-CD28mAb) a 1 ml di PBS w / o Ca 2 + o Mg 2 +. </li> &lt;li&gt; Luogo perla fiala di vetro contenente il magnete e tampone borato aspirato da perline. Aggiungete il composto di proteine ​​da 1,2 a passo flacone di vetro e sostituire il tappo. Mescolare subito capovolgendo il flacone, coprire il tappo con parafilm, e posto su un mixer e incubare una notte a 4 ° C. </li><li> Il giorno successivo, il flacone di vetro posto sul magnete e rimuovere miscela proteica, evitando accuratamente perline. Lavare le perline aggiungendo 3 ml tallone tampone di lavaggio (PBS con 5% di siero AB sodio azide 0,02%), e incubando a 4 ° C su un agitatore per 5 min. Ripetere due volte. </li><li> Perline possono essere memorizzati in questa miscela di lavaggio tallone. Per rendere AAPC funzionale, rimuovere una piccola aliquota e contare le perline utilizzando un emocitometro. Controllare che le proteine ​​sono stabilmente caricati i beads di colorazione con anticorpi (es. PE-coniugato anti-topo IgG1) ed eseguendo analisi citofluorimetrica. </li><li> Per caricare le perline con l&#39;antigene, togliere 5 x 10 7 perline, e aggiungere un piccolo flaconcino di 1,5 ml in vetro, perle di sciacquare con 1 ml di PBS sterile. Resuspend perle lavato con 1 ml di PBS sterile e aggiungere l&#39;antigene; esempio: carico con α-GalCer/KRN7000 (5mg/ml). * Nota: Anche se, non abbiamo rilevato alcun problema con solubilità lipidica e la formazione di micelle, i lipidi devono essere trattati secondo le raccomandazioni del fabbricante. Specificamente, KRN7000 è stato ricostituito in DMSO (1mg/ml) per questi studi. KRN7000 e altri antigeni glicolipidi possono anche essere sciolto in 0,2 mg / ml di PBS contenente 0,5% Tween-20 (sonicare 2 hr. A 37 ° C). IMPORTANTE-La AAPC devono essere caricati per almeno 48-72 ore prima dell&#39;uso. </li></ol> 2. Isolamento di CD161 + cellule CD3 + <ol><li> Raccogliere le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC). Per la separazione di densità centrifugazione su gradiente Ficoll di linfociti da un buffy coat o pacco leucoferesi, prima diluire sangue eparinizzato con un volume uguale di 1X PBS a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 15 ml di Ficoll (riscaldata a temperatura ambiente) a 50 ml provette coniche. Lentamente overlay25 ml della miscela sangue diluito in cima al Ficoll. Centrifugare a 2000 rpm per 30 min a temperatura ambiente con il freno. </li><li> Rimuovere con attenzione l&#39;interfaccia di linfociti (anello bianco tra la media e Ficoll) con una pipetta Pasteur e trasferire in un nuovo tubo da 50 ml. </li><li> Lavare le cellule con il riempimento del tubo di 50 ml con PBS e centrifugazione a 1500 rpm per 5 min. Eliminare il supernatante e combinare i tubi da un unico individuo ad un unico tubo e lavare le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) di nuovo con 20 ml di PBS. Poi conta il PBMC e risospendere ad una concentrazione di 5 x 10 7 cellule / ml in tampone MACS (1 L PBS privo di Ca 2 + e Mg 2 +, 5 mmol g BSA, e 2 EDTA). </li><li> Per isolare la frazione di cellule T, iniziare con 2 ml di PBMC (10 8 cellule) e aggiungere 100 ml di soluzione Pan arricchimento delle cellule T dal Kit EasySep arricchimento umano cellule T. Incubare a temperatura ambiente per 10 min. </li&gt; <li> Aggiungere 100 pl di particelle magnetiche alla soluzione e incubare a temperatura ambiente per 10 min. Portare il volume finale di 2,5 ml di solvente e inserire il tubo nel magnete viola per 5 min. Velocemente versare l &#39;CD3 + frazione in una provetta da 15 ml conica. </li><li> Lavare le cellule con l&#39;aggiunta di 5 ml di tampone freddo MACS, contare il numero di cellule vitali, e prelevare un&#39;aliquota per la colorazione FACS. </li><li> Per selezionare le cellule CD161 +, in primo luogo arricchiti risospendere le cellule T nel 980 microlitri tampone ghiacciata MACS, aggiungere 10 mg contro CD161 mAb, e incubare in frigo per 10 minuti. </li><li> Centrifugare le cellule a 1500 rpm a 4 ° C per 5 min. Poi ricostituire il pellet di cellule in 800 microlitri di tampone MACS. Aggiungere 200 pl di anti-topo IgG1 microperline e incubare la soluzione per 10 minuti a 4 ° C. </li><li> Durante questa fase di incubazione, equilibrare una colonna LS aggiungendo 3 ml tampone MACS. </li><li> Successivamente, lavare le cellule per centrifugazione 1500 rpm a 4 ° C per 5 min. Resutrascorrere le cellule in 3 ml di tampone MACS. Pipettare quindi le celle nella colonna LS MACS separazione. Assicurati di evitare di generare bolle pipettando lentamente. Lavare la colonna con l&#39;aggiunta di 3 ml di tampone MACS. Ripetere due volte. </li><li> Aggiungere 3 ml di tampone fresco MACS e rimuovere colonne da magnete. Colonna Inserire in una provetta da 15 ml conica. Inserire il pistone e spingere fuori il contenuto per ottenere purificate CD161 + cellule CD3 +. Conteggio delle cellule NKT arricchito frazione. Si dovrebbe avere 2-4 milioni di cellule. </li></ol> 3. AAPC mediata da cellule NKT di espansione <ol><li> Impostare co-coltura con l&#39;aggiunta di 10 6 arricchiti CD161 + CD3 + cellule T e 10 6 AAPC in 16 ml di mezzo completo (completo medie + IL-2, 100 U / ml). Piatto questa miscela con l&#39;aggiunta di 160 microlitri / pozzetto volume finale di un ben 96 tessuto-cultura polistirene trattate, U-piastra di fondo a bassa evaporazione coperchio. Eseguire scambio media ogni giorno 7 ° con l&#39;aggiunta di 80 ml ​​di mezzo fresco. </li><li> Raccoltocellule, contare ed eseguire colorazione FACS il giorno 12-14. </li><li> Le cellule NKT espanse possono essere saltuariamente come descritto sopra nella fase 3.1, specificamente risospendere 10 6 cellule T espanse e 10 6 AAPC in 16 ml di mezzo completo. Piastra questa miscela aggiungendo 160 pl / pozzetto di una ben 96 U-piastra inferiore. Continuare a rinfrescare medio co-coltura ogni giorno 7 ° con l&#39;aggiunta di 80 ml ​​di mezzo fresco. </li><li> Si consiglia di congelare le cellule NKT supplementari dopo il secondo turno di espansione (1 x10 6 / provetta Microbank ™ in 1 ml di DMSO-5% / 95% FBS.) </li></ol> 4. Test funzionale: AAPC-mediata stimolazione delle cellule NKT <ol><li> Impostare 5x10 4 cellule NKT / bene con 5x10 5 AAPC in 200 microlitri di volume finale (terreno completo) in 96 e U-piastra inferiore. </li><li> Harvest supernatante di coltura cellulare per ELISA dopo 24-48 ore. </li></ol>

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

AAPC possono essere utilizzati per studiare i requisiti di base per l&#39;attivazione delle cellule NKT e ha il potenziale valore clinico per l&#39;espansione ex vivo di cellule NKT per immunoterapia adottiva. Mescher et al. Descritto uno dei primi sistemi basati tallone, dove murino biotinilato classe MHC-peptide-singoli costrutti catena sono stati combinati con molecole costimolatorie biotinilati B7.1 e B7.2 tramite streptavidina alla superficie delle microsfere lattice 14, 15. Questo approccio è stato utilizzato con successo per stimolare cellule T antigene-specifiche di topi transgenici. Inoltre, poiché questo approccio utilizza una singola catena MHC-peptide per garantire loading omogenea delle molecole MHC, ciascun antigene peptide desiderato richiederebbe una nuova trasfezione per l&#39;espressione della singola catena desiderata MHC-peptide, limitando così la generalità di approccio. È importante sottolineare che il gruppo del Dr. Schneck ha aperto la strada al tallone based-AAPC, attraverso lo sviluppo di un altro non cellulare AAPC tallone base, Realizzato accoppiando HLA-Ig, segnale 1, e anti-CD28, segnale 2, su biglie magnetiche. HLA-Ig, una forma unica multimerica di HLA fusa ad una immunoglobulina patibolo molecolare 16, 17 è stata sviluppata dal suo gruppo. Successivamente, hanno sviluppato MHC-Ig basata AAPC, che hanno dimostrato di espandere efficacemente CMV e MART-1 specifica CTL 18. Qui, abbiamo dimostrato che CD1d-Ig AAPC base può essere utilizzato per espandere cellule NKT funzionali. Uno studio ha utilizzato un sistema simile per esaminare l&#39;interazione fisica delle cellule NK con CD1d 19. In particolare, abbiamo progettato una cellula artificiale presentanti l&#39;antigene che è adattabile a qualsiasi esigenza troviamo necessaria per ottimizzare la proliferazione delle cellule NKT. Il metodo di espansione AAPC fornisce un metodo semplice e affidabile per estendere e arricchire cellule NKT. Il nostro AAPC può essere modificato per valutare sistematicamente il ruolo di un gruppo di molecole di costimolazione potenziali e valutare il loro ruolo sulla proliferazione delle cellule NKTzione e la funzione. Così, AAPC rappresentano una tecnologia robusta versatile utile per l&#39;induzione e l&#39;espansione delle cellule NKT. La generazione di aAPCs richiede meno di una settimana ed è adatto per la produzione di grandi quantità di perle. Tuttavia, un passo critico nel generare il AAPC è confermare che CD1d-Ig è stabilmente immobilizzato sulla superficie delle perle e valutare la loro funzionalità di coerenza da lotto a lotto. Un limite potenziale del sistema è che non vi è un meccanismo atto a spegnere stimolazione, oltre rimozione meccanica delle perle. Specificamente, l&#39;impegno del recettore delle cellule T (TCR) con l&#39;antigene: complesso CD1d/MHC generano tipicamente sinapsi immunologica in concerto con accessori / molecole di adesione, che può provocare l&#39;induzione di fattori inibitori o soppressiva sia sulla cellula T e cellule presentanti l&#39;antigene. Nel sistema AAPC, questi fattori possono essere upregulated dalla cellula T, ma il tallone non si esprimono i ligandi congiuntiper questi recettori. Inoltre, le cellule CD4 + NKT hanno dimostrato di sopprimere le risposte antitumorali nei topi e umani, quindi è possibile che l&#39;attivazione non selettivo di tutte le cellule NKT stimolazione (cioè globale con α-GalCer) o attivazione del sottoinsieme errato potrebbe provocare indesiderati immunologica risultati. Di conseguenza, si deve fenotipicamente e funzionalmente caratterizzano la AAPC espanso popolazione di cellule NKT. Come mostrato in figura 4, abbiamo trovato che la stimolazione con α-GalCer-loaded AAPC esprimere anti-CD28 può provocare cellule NKT producono Th1, Th2 e citochine di tipo Th17. Studi murini hanno riportato che sfida con IL-33, una citochina recentemente identificato, portato a un aumento dei livelli circolanti di citochine infiammatorie come IL-5 e IL-13. Trattamento di cellule NKT con IL-33 potenziato la loro produzione di citochine 20. IL-33 è un ligando specifico per ST2 ed è stato dimostrato che ST2 solubile can blocchi IL-33 di segnalazione. Quindi, come esempio di una futura applicazione, ST2 AAPC esprimendo potrebbe essere generato e utilizzato per determinare se si potesse inibire selettivamente la produzione di citochine Th2 mentre induce secrezione di citochine da Th1 cellule NKT. E &#39;stato anche riportato che l&#39;iniezione iv di Kb-AAPC esprimere in topi C57BL / 6 provocato metastasi polmonari ridotte del tumore 21. Importante, questi dati dimostrano che il traffico AAPC al polmone e sono in grado di attivare cellule T effettrici sottoinsiemi. Pertanto, si potrebbe generare diversi tipi di AAPC ed esaminare l&#39;interazione tra sottopopolazioni di cellule T antigene specifiche. Per riassumere, questi studi dimostrano che CD1d-Ig AAPC base può essere utilizzato per sostituire normale APC cellulare, e hanno il potenziale per migliorare attuali approcci clinici per cellule NKT based-immunoterapia adottiva.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Ficoll-Paque PLUS </td><td> GE Life Sciences </td><td> 17-1440 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep umano delle cellule T Kit di arricchimento </td><td> StemCell Technologies </td><td> 19051 </td><td></td></tr><tr><td> Alloficocianina CD161 umano mAb </td><td> Pharmingen </td><td> 550968 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep Magnet </td><td> StemCell Technologies </td><td> 18002 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-topo IgG1 Microsfere </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-047-101 </td><td></td></tr><tr><td> Dimero XI ricombinante solubile dimerica mouse CD1d: proteina di fusione IG </td><td> BD Biosciences </td><td> 557599 </td><td></td></tr><tr><td&gt; Anti-CD28 mAb </td><td> Biolegend </td><td> 302914 </td><td></td></tr><tr><td> M-450 epossidiche perline </td><td> Life Technologies </td><td> 150-11 </td><td></td></tr><tr><td> Alpha-galactosylceramide (KRN7000) </td><td> Axxora, LLC </td><td> BML-SL232-0100 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> R 0883 </td><td></td></tr><tr><td> Sodio piruvato </td><td> Gibco </td><td> 11360-070 </td><td></td></tr><tr><td> Aminoacidi non essenziali </td><td> Gibco </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> Vitamina Soluzione </td><td> Gibco </td><td> 11120-052 </td><td></td></tr><tr><td> 2-mercaptoetanolo </td><td> Gibco </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ciprofloxacina </td><td> Alexis Biochemicals </td><td> 380-288-G025 </td><td></td></tr><tr><td> PE-Vα24Jα18 </td><td> Biolegend </td><td> 342904 </td><td></td></tr><tr><td> PE-Vα24 (Clone C15) </td><td> Beckman Coulter </td><td> A66907 </td><td></td></tr><tr><td> FITC-Vβ11 (Clone C21) </td><td> Beckman Coulter </td><td> A66905 </td><td></td></tr><tr><td> PE-CD1d </td><td> Biolegend </td><td> 123510 </td><td></td></tr><tr><td> PE contro topo IgG1 </td><td> BD Biosciences </td><td> 556650 </td><td></td></tr><tr><td> FITC anti-topo IgG2a </td><td> Biolegend </td><td> 407105 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS, no calcio, magnesio no </td><td> Life Technologies </td><td> 14190250 </td><td></td></tr><tr><td> Di sodio azide </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S8032 </td><td></td></tr><tr><td> Albumina di siero bovino </td><td> Americana Bioanalytical </td><td> AB00440-00100 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 431788 </td><td></td></tr><tr><td> IL-2 (Proleukin) </td><td> BD Biosciences </td><td> 354043 </td><td></td></tr><tr><td> Siero umano AB </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S40110 </td><td></td></tr><tr><td> Tubo Rotator Labquake </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-687-10Q </td><td></td></tr><tr><td> BD Falcon 5 ml in polistirolo a fondo tondo tubi </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-959-1A </td><td></td></tr><tr><td> Wheaton Vial in vetro con tappo </td><td> Fisher Scientific </td><td> Piccolo (03-343-6A) Grande (03-343-6E) </td><td></td></tr></tbody></table>

artificial antigen presenting cell (aapc) mediated activation and expansion of natural killer t cells

Natural killer T (NKT) cellule sono un sottogruppo di cellule T che visualizzano marcatori caratteristici di entrambi natural killer (NK) e le cellule T 1. Diversamente classici cellule T, cellule NKT riconoscono antigeni lipidi nel contesto di molecole CD1 2. Cellule NKT esprimere un riarrangiamento catena invariante TCRα: Vα14Jα18 in topi e Vα24Jα18 nell&#39;uomo, che è associata con catene Vβ limitata diversità di 3-6, e sono indicati come canoniche o invarianti NKT (i NKT) cellule. Simile a cellule T convenzionali, cellule NKT sviluppano da cellule precursori CD4-CD8-T timici seguendo la segnalazione appropriata CD1d 7. Il potenziale di utilizzare cellule NKT per scopi terapeutici è aumentato significativamente la capacità di stimolare ed espandere cellule NKT con α-Galactosylceramide (α-GalCer) e una varietà di citochine 8. È importante sottolineare che queste cellule mantenuto il loro originale phenotype, citochine secrete e visualizzata funzione citotossica contro linee cellulari tumorali. Così, espanse ex vivo cellule NKT rimanere funzionale e può essere utilizzato per l&#39;immunoterapia adottiva. Tuttavia, cellule NKT based-immunoterapia è stato limitato con l&#39;uso di cellule che presentano l&#39;antigene autologhe e la quantità e la qualità di queste cellule stimolatrici può variare sostanzialmente. DC derivate da monociti di pazienti affetti da cancro sono stati segnalati per esprimere livelli ridotti di molecole costimolatorie e producono citochine infiammatorie meno 9,10. Infatti, DC murine anziché APC autologhe sono stati utilizzati per testare la funzione delle cellule NKT da pazienti CML 11. Tuttavia, questo sistema può essere utilizzato solo per la sperimentazione in vitro cellule NKT poiché non può essere espansa murino DC e quindi utilizzati per l&#39;immunoterapia adottiva. Quindi, un sistema standardizzato che si basa su cellule artificiali Antigen Presenting (AAPC) potrebbe produrre gli effetti stimolanti della DC senza le insidie ​​di allo-o xenogeniche ceLLS 12, 13. Qui, si descrive un metodo per generare CD1d basata AAPC. Poiché l&#39;impegno del recettore delle cellule T (TCR) di CD1d-antigene è un requisito fondamentale di attivazione delle cellule NKT, antigene: CD1d-Ig complessi forniscono un metodo affidabile per isolare, attivare, ed espandere popolazioni di cellule effettrici NKT.

Qui si descrive un metodo per generare CD1d-Ig basata AAPC, realizzato mediante accoppiamento covalente di CD1d-Ig e anti-CD28 mAb a perline magnetiche per stimolare le cellule NKT come metodo standardizzato per la propagazione delle cellule NKT (Figura 1). Primo, uno deve dimostrare che i CD1d-Ig proteine ​​di fusione sono stabilmente immobilizzato sulla superficie dei granuli magnetici. Come mostrato in Figura 2A, CD1d-Ig e anticorpi anti-CD28 sono stati sia espresso sulla superficie delle perle magnetiche. Per esaminare la capacità stimolante della AAPC, noi co-coltura di cellule NKT ibridomi con AAPC surnatanti raccolti durante la notte, la cultura e le misurata produzione di IL-2 da ELISA. Abbiamo trovato che CD1d-Ig basata AAPC erano in grado di stimolare le cellule NKT ibridomi a livelli pari o superiore al corrispettivo cellulari (Figura 3, i dati non mostrati). È interessante notare che, abbiamo scoperto che il nostro mouse ibridomi di cellule NKT sono stimolati da umano CD1d basata AAPC (Figura 2B), che fornisce un metodo semplice per testare ogni lotto di AAPC. Successivamente, si è cercato di dimostrare il potenziale propagazione AAPC, quindi le cellule T umane sono state isolate da sangue periferico. In primo luogo il CD161 + CD3 + frazione di cellule T è stata arricchita da separazione magnetica tallone. Quindi, le cellule T sono state stimolate bisettimanale con α-GalCer caricato AAPC. È importante sottolineare che, abbiamo scoperto che anche con un relativamente basso iniziale popolazione di cellule NKT (0,03%), siamo stati in grado di espandere le cellule a ~ 67% Vα24 Vβ11 + + (Figura 3). Abbiamo ampliato le cellule NKT dal PBMC di molti volontari sani e pazienti affetti da cancro e hanno scoperto che α-GalCer caricato AAPC stati in grado di espandere la popolazione di cellule NKT in entrambi i gruppi. In particolare, il tasso di espansione è stata molto donatore dipendente. Come previsto maggiore è la popolazione iniziale di cellule Vα24 +, maggiore è la percentuale di espansione. Inoltre,quando si utilizza una popolazione iniziale di 2 milioni di cellule CD161 + CD3 + cellule T, si può ottenere&gt; 10 7 cellule dopo due cicli di espansione (Tabella 1). Circa 80-90% delle cellule NKT espanse sono CD4 +, ~ 5% CD8 +, e le restanti sono presumibilmente negativi cellule CD4-CD8-doppie NKT. Queste cellule NKT espanse possono essere utilizzati per studi funzionali come mostrato in Figura 4A-C. Abbiamo trovato che il nostro ex vivo espanse cellule NKT continuare ad adattarsi ai α-GalCer stimolazione e sono potenti produttori di IL-17A, TNF-α e IFN-γ. Occorre notare che se la prima popolazione di cellule T arricchimento è bassa e si è in grado di eseguire la seconda fase di arricchimento CD161, il AAPC mediata espansione non può dare i risultati attesi (vedere Figura 4D, donatori 1). Tuttavia, se la percentuale di cellule circolanti NKT è superiore a 0,1%, si dovrebbe essere ancora in grado di ottenere una significativa espansionei di cellule NKT. Nel complesso, questi dati dimostrano che CD1d based-AAPC può essere utilizzato per espandere in modo efficace e stimolare cellule primarie umane NKT. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig1.jpg" /> Figura 1. Diagramma schematico di CD1d: Ig basati aAPCs porzioni extracellulari della molecola CD1d sono fusi alla regione costante di una catena pesante di immunoglobulina proteine ​​separate da un linker breve amminoacido. Queste molecole possono essere facilmente caricate con antigeni lipidici, come α-GalCer, semplicemente mediante incubazione con un eccesso di lipidi di interesse. AAPC state realizzate con l&#39;accoppiamento CD1d-Ig e anti-CD Abs a sfere magnetiche. In questo sistema, CD1d-Ig viene utilizzato per fornire l&#39;affine antigene-specifico segnale attraverso il TCR e anti-CD28 mAb fornisce il segnale di costimolazione. <img alt="Figura 2" fo:content-width="4.25in" fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/4333/4333fig2highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4333/4333fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2. . Colorazione FACS di proteine ​​di superficie su aAPCs aAPCs A) sono stati testati per la presenza di CD1d: IgG dimero (tramite colorazione con PE-coniugato anti-topo IgG1) e anticorpo anti-CD28 (con FITC-coniugato anti-topo IgG2a) istogrammi. aperti indicano controllo isotipico; istogrammi pieni rappresentano gli anticorpi indicati. CD1d-Ig Esprimere AAPC possono stimolare produzione di IL-2 da parte delle cellule NKT. B) Il + Vα14 topo NKT cellulare di ibridomi, DN32.D3, è stato co-coltivate sia con media, antigene solubile (α-GalCer), scaricate AAPC o α-GalCer caricato AAPC. Supernatanti di coltura sono stati raccolti e standard sandwich ELISA è stato utilizzato per misurare la produzione di IL-2. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4333/4333fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig3.jpg" /> Figura 3. Espansione delle cellule NKT da cellule rivestite CD1d-antigene artificiali presentano. (A) primario CD3 + CD161 + doppie cellule positive sono state isolate da PBMC mediante separazione magnetica. Le cellule sono state stimolate con filtrate α-GalCer caricato, CD1d-Ig AAPC rivestito per 14 giorni. Le cellule sono state colorate per Vα24 e Vβ11 seguito di stimolazione AAPC. (B) Primary cellula umana NKT mediato lisi di una linea di linfoma a cellule B. C1R-CD1d cellule incubate con cellule NKT ai rapporti indicati in presenza o assenza di antigene, un GalCer (100 ng / ml) a 96 pozzetti con fondo a U piastre per 20-24 hr. Lisi delle cellule NKT cellulo-mediata è stata valutata dalla norma 51Cr-release test. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4333/4333fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig4.jpg" /> Figura 4. Profili delle citochine di AAPC-espanse cellule NKT. </strong&gt; Dopo stimolazione con α GalCer caricato AAPC per due settimane, le cellule NKT espanse (1 × 10 5 / pozzetto) sono state co-coltivate con α-solubile GalCer, PMA / ionomicina, anti-CD3/28 microperle, o α-GalCer loaded AAPC (2 × 10 5 / pozzetto) per 48 ore. (A) IL-17A, (B), TNF-α, e (C) IFN-γ produzione di citochine è stata misurata mediante ELISA standard. I dati indicati sono al netto della produzione di citochine dopo aver sottratto i controlli negativi (media e perle vuote). (D) cellule T primarie sono state isolate da PBMC mediante separazione magnetica tallone. Le cellule sono state stimolate filtrate per due settimane con l&#39;indicazione a-GalCer caricato-AAPC. Le cellule sono state colorate usando Abs specifici per Vα24 + e + Vβ11 ed analizzate al citofluorimetro.

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Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Qui si descrive un metodo per l&#39;attivazione ed espandere cellule NKT dal bulk popolazioni di cellule T usando cellule presentanti antigene artificiali (AAPC). L&#39;uso di CD1d basata AAPC fornisce un metodo standard per la generazione di numeri elevati di cellule NKT funzionali.

Antigen Presenting artificiale cellulare (AAPC) Attivazione mediata ed espansione delle cellule Natural Killer T

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

artificial-antigen-presenting-cell-aapc-mediated-activation-expansion

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

18.0K Views.  University of Maryland. Qui si descrive un metodo per l'attivazione ed espandere cellule NKT dal bulk popolazioni di cellule T usando cellule presentanti antigene artificiali (AAPC). L'uso di CD1d basata AAPC fornisce un metodo standard per la generazione di numeri elevati di cellule NKT funzionali.

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Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK cells to recognize and lyse HIV-1 infected cells because identifying any aberrancy in NK cell function against HIV-infected cells could potentially lead to therapies that would enhance their cytolytic activity. There is a need to use HIV-infected primary T-cell blasts as target cells rather then infected-T-cell lines in the cytotoxicity assays. T-cell lines, even without infection, are quite susceptible to NK cell lysis. Furthermore, it is necessary to use autologous primary cells to prevent major histocompatibility complex class I mismatches between the target and effector cell that will result in lysis. Early studies evaluating NK cell cytolytic responses to primary HIV-infected cells failed to show significant killing of the infected cells 1,2. However, using HIV-1 infected primary T-cells as target cells in NK cell functional assays has been difficult due the presence of contaminating uninfected cells 3. This inconsistent infected cell to uninfected cell ratio will result in variation in NK cell killing between samples that may not be due to variability in donor NK cell function. Thus, it would be beneficial to work with a purified infected cell population in order to standardize the effector to target cell ratios between experiments 3,4. Here we demonstrate the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected cells by taking advantage of HIV-1's ability to down-modulate CD4 on infected cells and the availability of commercial kits to remove dead or dying cells 3-6. The purified infected primary T-cell blasts can then be used as targets in either a degranulation or cytotoxic assay with purified NK cells as the effector population 5-7. Use of NK cells as effectors in a degranulation assay evaluates the ability of an NK cell to release the lytic contents of specialized lysosomes 8 called "cytolytic granules". By staining with a fluorochrome conjugated antibody against CD107a, a lysosomal membrane protein that becomes expressed on the NK cell surface when the cytolytic granules fuse to the plasma membrane, we can determine what percentage of NK cells degranulate in response to target cell recognition. Alternatively, NK cell lytic activity can be evaluated in a cytotoxic assay that allows for the determination of the percentage of target cells lysed by release of 51Cr from within the target cell in the presence of NK cells.

Cytotoxicity assays to measure natural killer cell lytic responses to HIV-infected cells is limited by the purity of the target cells. We demonstrate here the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected primary T-cell blasts by taking advantage of HIV-1 s ability to down-modulate CD4.

Preparazione e utilizzo di HIV-1 CD4 infetti primaria + T-Cells come cellule bersaglio nei test di cellule Natural Killer citotossici

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals may exhibit suppressive immune microenvironment and, in contrast to activating CTL, their autologous antigen presenting cells may tend to tolerize or anergize antigen specific CTL. As a result, although still in the experimental phase, CTL-based adoptive immunotherapy has evolved to become a promising treatment for various diseases such as cancer and virus infections. In initial experiments ex vivo expanded CMV (cytomegalovirus) specific CTL have been used for treatment of CMV infection in immunocompromised allogeneic bone marrow transplant patients. While it is common to have life-threatening CMV viremia in these patients, none of the patients receiving expanded CTL develop CMV related illness, implying the anti-CMV immunity is established by the adoptively transferred CTL1. Promising results have also been observed for melanoma and may be extended to other types of cancer2. 
While there are many ways to ex vivo stimulate and expand human CTL, current approaches are restricted by the cost and technical limitations. For example, the current gold standard is based on the use of autologous DC. This requires each patient to donate a significant number of leukocytes and is also very expensive and laborious. Moreover, detailed in vitro characterization of DC expanded CTL has revealed that these have only suboptimal effector function 3. 
Here we present a highly efficient aAPC based system for ex vivo expansion of human CMV specific CTL for adoptive immunotherapy (Figure 1). The aAPC were made by coupling cell sized magnetic beads with human HLA-A2-Ig dimer and anti-CD28mAb4. Once aAPC are made, they can be loaded with various peptides of interest, and remain functional for months. In this report, aAPC were loaded with a dominant peptide from CMV, pp65 (NLVPMVATV). After culturing purified human CD8+ CTL from a healthy donor with aAPC for one week, CMV specific CTL can be increased dramatically in specificity up to 98% (Figure 2) and amplified more than 10,000 fold. If more CMV-specific CTL are required, further expansion can be easily achieved by repetitive stimulation with aAPC. Phenotypic and functional characterization shows these expanded cells have an effector-memory phenotype and make significant amounts of both TNF&alpha; and IFN&gamma; (Figure 3).

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

A new DC independent method for induction and expansion of antigen-specific T cells is described. HLA A2-Ig based artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) are loaded with HLA-A2 restricted peptides to efficiently expand CTL of diverse antigen specificity. This technology holds great potential for CTL-based adoptive immunotherapy.

HLA-Ig celle in base Antigen Presenting artificiale per Efficiente Ex vivo Estensione dei diritti dell&#39;uomo e CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

Applicazione clinica della<em&gt; Bella Addormentata</em&gt; Artificiale e cellule presentanti l&#39;antigene per modificare geneticamente le cellule T da sangue del cordone ombelicale e periferico

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied by adverse side effects such as a reduced ability to control infections or malignancies. Therefore, new approaches need to be developed that target only the disease mediating cells and leave the remaining immune system intact. Over the past decade a variety of cell based immunotherapy strategies to modulate T cell mediated immune responses have been developed. Most of these approaches rely on tolerance-inducing antigen presenting cells (APC). However, in addition to being technically difficult and cumbersome, such cell-based approaches are highly sensitive to cytotoxic T cell responses, which limits their therapeutic capacity. Here we present a protocol for the generation of non-cellular killer artificial antigen presenting cells (KaAPC), which allows for the depletion of pathologic T cells while leaving the remaining immune system untouched and functional. KaAPC is an alternative solution to cellular immunotherapy which has potential for treating autoimmune diseases and allograft rejections by regulating undesirable T cell responses in an antigen specific fashion.

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Guidelines are presented for the generation of killer artificial antigen presenting cells, KaAPC, an efficient tool for in vitro depletion of human antigen-specific T cells and an alternative solution to cellular immunotherapy for the treatment of T cell-mediated autoimmune diseases in an antigen-specific fashion without compromising the remaining immune system.

Killer artificiale cellule presentanti l&#39;antigene (KaAPC) per una efficiente<em&gt; In Vitro</em&gt; L&#39;esaurimento delle Umana antigene-specifiche cellule T

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells are therefore characterized as an innate T cell population capable of activating and steering adaptive immune responses. The development of improved techniques for the culture and expansion of murine iNKT cells facilitates the study of iNKT cell biology in in vitro and in vivo model systems. Here we describe an optimized procedure for the isolation and expansion of murine splenic iNKT cells.
Spleens from C57Bl/6 mice are removed, dissected and strained and the resulting cellular suspension is layered over density gradient media. Following centrifugation, splenic mononuclear cells (MNCs) are collected and CD5-positive (CD5+) lymphocytes are enriched for using magnetic beads. iNKT cells within the CD5+ fraction are subsequently stained with &#945;GalCer-loaded CD1d tetramer and purified by fluorescence activated cell sorting (FACS). FACS sorted iNKT cells are then initially cultured in vitro using a combination of recombinant murine cytokines and plate-bound T cell receptor (TCR) stimuli before being expanded in the presence of murine recombinant IL-7. Using this technique, approximately 108 iNKT cells can be generated within 18-20 days of culture, after which they can be used for functional assays in vitro, or for in vivo transfer experiments in mice.

Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.

Un metodo ottimizzato per l&#39;isolamento ed espansione invariante Natural Killer cellule T da Spleen mouse

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.

In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).

Sviluppo di un modello colite Antigen-driven per studiare presentazione di antigeni da cellule presentanti l&#39;antigene alle cellule T

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

Lo sviluppo di cellule staminali derivate antigene-specifiche cellule T regolatorie contro autoimmunità

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Flusso analisi di citometria di Natural Killer cellulare Lytic attività nel Sangue umano intero

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells

Excess dietary salt intake contributes to inflammation and plays a vital role in the development of hypertension. We previously found that antigen-presenting dendritic cells (DCs) can sense elevated extracellular sodium leading to the activation of the NADPH oxidase and formation of isolevuglandin (IsoLG)-protein adducts. These IsoLG-protein adducts react with self-proteins and promote an autoimmune-like state and hypertension. We have developed and optimized state-of-the-art methods to study DC function in hypertension. Here, we provide a detailed protocol for isolation, in vitro treatment with elevated sodium, and adoptive transfer of murine splenic CD11c+ cells into recipient mice to study their role in hypertension.

Here, we present a protocol to isolate dendritic cells from murine spleens by magnetic cell sorting and subsequent adoptive transfer into na&#239;ve mice. The model of high-salt activated dendritic cells was chosen to explain the step-by-step procedures of adoptive transfer and flow cytometry.

Isolamento e trasferimento adottivo di sale alta trattati cellule dendritiche presentanti l'antigene

Excess dietary salt intake contributes to inflammation and plays a vital role in the development of hypertension. We previously found that ...

Analysis of Human Natural Killer Cell Metabolism

Natural Killer (NK) cells mediate mainly innate anti-tumor and anti-viral immune responses and respond to a variety of cytokines and other stimuli to promote survival, cellular proliferation, production of cytokines such as interferon gamma (IFN&#947;) and/or cytotoxicity programs. NK cell activation by cytokine stimulation requires a substantial remodeling of metabolic pathways to support their bioenergetic and biosynthetic requirements. There is a large body of evidence that suggests that impaired NK cell metabolism is associated with a number of chronic diseases including obesity and cancer, which highlights the clinical importance of the availability of a method to determine NK cell metabolism. Here we describe the use of an extracellular flux analyzer, a platform that allows real-time measurements of glycolysis and mitochondrial oxygen consumption, as a tool to monitor changes in the energy metabolism of human NK cells. The method described here also allows for the monitoring of metabolic changes after stimulation of NK cells with cytokines such as IL-15, a system that is currently being investigated in a wide range of clinical trials.

In this paper, we describe a method to measure glycolysis and mitochondrial respiration in primary human Natural Killer (NK) cells isolated from peripheral blood, at rest or following IL15-induced activation. The protocol described could be easily extended to primary human NK cells activated by other cytokines or soluble stimuli.

Analisi del metabolismo delle cellule dell'assassino naturale umano

Natural Killer (NK) cells mediate mainly innate anti-tumor and anti-viral immune responses and respond to a variety of cytokines and other stimuli to ...