Gli autori desiderano ringraziare il Dott. Keji Zhao lab (NIH / NHLBI) per il loro aiuto nel fornire i risultati di sequenziamento. Vorremmo anche ringraziare il progetto genoma UCSC per l&#39;utilizzo di Browser per visualizzare sequenziamento del genoma mappato legge. Questo lavoro è stato sostenuto dal Pathway R00HD055052 NIH al Premio Indipendenza e R01HD065816 dal NICHD, il Lucile Parkard Foundation, e la Johns Hopkins University di start-up fondi per XC

(La procedura intero chip richiede circa due giorni. Preparazione di librerie di chip per alta sequenziamento richiede altri 2-3 giorni.) 1. Sezionare e prepara il tessuto per Experiment ChIP (circa 1 milione di cellule) <ol><li> Dissect tessuto di interesse (ad esempio, 200 paia di Drosophila testicoli) in PBS freddo inibitore della proteasi + 1x (sciogliere 1 pellet di cocktail inibitore della proteasi in 1,5 ml di PBS 1x a 7x ottenendo così la soluzione stock) + PMSF (concentrazione finale 100 pg / mL). Risciacquare tessuto doppio tessuto e risospendere in 200 pl della stessa soluzione di PBS con inibitori. </li><li> Per risolvere il campione aggiungere 5,5 microlitri di formaldeide al 37% (formaldeide calda in bagno d&#39;acqua a 37 ° C per 1 minuto prima di usare). Incubare a 37 ° C per 15 minuti, vortex ogni 5 minuti in mezzo. </li><li> Mettere il campione sul ghiaccio per il tessuto riposare per 2 minuti. Sciacquare 2x con 450 microlitri di PBS (con inibitori della proteasi e PMSF). Esempio può essere ora negoziod a -20 ° C. Ripetere più volte dissezione per ottenere materiale sufficiente per ChIP. </li></ol> 2. Preparare supernatante con la proteina-DNA Coniugazione per l&#39;analisi ChIP <ol><li> Combina campione abbastanza dal punto 1.3 in una provetta eppendorf 1,75 mL. </li><li> Rimuovere dalla PBS campione di tessuto. Aggiungere 200 pl di tampone di lisi (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM CaCl2, 0,2% Triton X-100 o NP-40, 5 mM butirrato, e 1x cocktail inibitore di proteinasi). Aggiungi fresca soluzione madre PMSF al tampone di lisi (PMSF concentrazione finale di 0,5 mM). Omogeneizzare con il blu omogeneizzatore (Cat Fisher # 749521-1590) fino a quando i tessuti si dissociano completamente senza alcuna aggregazione, incubare a RT (temperatura ambiente) per 10 minuti. </li><li> Sonicazione: microtip sonicatore uso (Misonix HS-XL200) alla potenza 20. Con ultrasuoni per 10 secondi e di riposo in ghiaccio per 50 sec. Ripetere 4-5 volte (tempo di sonicazione ottimale dovrebbe essere determinata empiricamente, come la maggior sonicazione produrrà frammenti più piccoli. Per ChIP con anticorpi contro Histonmodifiche elettroniche, che normalmente ultrasuoni cromatina di circa 200-300 bp; per il fattore di trascrizione o di regolatore di cromatina (ad esempio proteine ​​Polycomb), che normalmente sonicare cromatina a 200-1000 bp. Tuttavia, la dimensione del frammento ottimale deve essere testato empiricamente. Nota: non rimuovere la provetta in ghiaccio ANCHE DURANTE sonicazione PER EVITARE ESEMPIO DA RISCALDAMENTO! </li><li> Diluire il campione con l&#39;aggiunta di 1,8 mL di tampone RIPA (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM EDTA, 0,1% SDS, 0,1% Na-desossicolato, 1% Triton X-100, con inibitori della proteasi PMSF e alla stessa concentrazione descritta in precedenza). Salvare 40 microlitri come ingresso di controllo sommando 2 microlitri 5M NaCl e incubare a 65 ° C per una notte (O / N) per invertire reticolazione. </li><li> Per anticorpo coniugato a perline, aggiungere 40 ul Proteina A perline in una provetta eppendorf da 1,5 ml, quindi aggiungere 600 microlitri di PBS e roccia a 4 ° C per 2 minuti, perline applicano al magnete e rimuovere supernatante. Aggiungere 100 pl di PBS e anticorpo di interesse (quantità di anticorpo dovrebbe essere determinata empirismocamente). Incubare a RT per 1 ora o 4 ° C per 4 ore. </li><li> Rimuovere il surnatante da perline di magnete e aggiungere 1 ml di estratto di cromatina dal passo 2,4 ai talloni. Ruota a 4 ° CO / N. </li><li> Applicare il campione ChIP al magnete e rimuovere il surnatante. Lavare le perline con il seguente tampone a 4 ° C per 10 minuti ciascuno: 2x con 1 ml di tampone RIPA [1,89 mL &#39;tampone RIPA&#39; + 315 pl inibitori della proteasi 7x + 20 pl PMSF]; 2x con 1 ml di tampone RIPA + 0,3 M NaCl [1,89 mL di tampone RIPA + 220 microlitri 3 M NaCl]; 2x con 1 mL di tampone LiCl (0,25 M LiCl, 0,5% NP40, 0,5% NaDOC); 1x con 1 ml di TE 1x + 0,2% Triton X-100; 1x con 1 ml di TE 1x. </li><li> Per invertire reticolazione, risospendere le sfere in 100 microlitri tampone TE + 3 microlitri 10% SDS + 5 pl di proteinasi K (20 mg / mL). Incubare a 65 ° CO / N. </li><li> Applicare perline al magnete e trasferire supernatante in un nuovo tubo. Il supernatante CONTIENE IL CAMPIONE DNA. Lavare perline con 100 microlitri TE + 0,5 MNaCl e combinare le due surnatante. </li><li> Fenolo-cloroformio estrarre il campione di DNA. Aggiungere 200 ul Fenolo: Chlorofrom: IAA (25:24:1), mescolare e vortex. Spin a 14k per 5 minuti a RT. In alternativa, il DNA può essere estratto usando il kit di purificazione PCR Qiagen. </li><li> Trasferire il surnatante / acquoso in una nuova provetta, e aggiungere acrilammide lineare ad una concentrazione finale di 20 ug / mL (In alternativa, 1 pl di glicogeno a 20 mg / ml per ogni 1 ml di surnatante possono anche essere utilizzati. Glicogeno viene utilizzato per qPCR successivo o analisi PCR, mentre acrilammide lineare viene utilizzato per il sequenziamento saggi.) Aggiungere 20 microlitri di 3M NaOAc e 500 microlitri EtOH 100%. Mescolare bene ed incubare a 80 ° C per 10 minuti. Centrifuga alla massima velocità per 20 minuti a 4 ° C. </li><li> Rimuovere il surnatante e lavare con 300 microlitri EtOH 70%. Aria campione secco e risospendere in 50 microlitri tampone TE. Esempio possono essere conservati a -20 ° C. Esempio può essere usato per la PCR quantitativa (qPCR) test (Figura 1). </li></ol> 3 bis. Analizzare ChIP-DNA ed utilizzando qPCR <ol><li> Diluire DNA genomico al seguente concentrazione di una curva standard: non diluito, 1/10, 1/100, 1/1000, 1/5000. </li><li> Per ogni coppia di primer, istituito qPCR in duplice esemplare in una piastra a 96 pozzetti con il DNA genomico da 3a.1 passo, il controllo degli ingressi e ChIP-ed DNA: 10 L 2x PCR SYBR mix (Fermentas, K0222); 1 ul 10 uM innesco in avanti; 1 pl 10 pM primer reverse; x ul-ChIP ed DNA (controllo di input, o DNA genomico); y pl priva di nucleasi H 2 O per regolare il volume di reazione di 20 pl. </li><li> Far girare la piastra a 96 pozzetti con Mini piastra Spinner (Labnet). </li><li> Eseguire qPCR con ABI 7300 PCR in tempo reale di sistema (o altri sistemi in tempo reale PCR) utilizzando la seguente condizione: Fase 1: 50 ° C per 2 min, 1 ciclo; Fase 2: 95 ° C per 10 min, 1 ciclo; Fase 3: 95 ° C per 15 s, 60 ° C per 1 minuto, 40 cycles; Fase 4 (fase di dissociazione): 95 ° C per 15 s, 60 ° C per 1 minuto, 95 ° C per 15 s. </li><li> Controllare la curva di dissociazione: Un picco al tracciato termico dissociazione suggerisce un singolo amplicone dalla reazione PCR. Più di un picco indica non specifico prodotto con la coppia di primer, i dati qPCR non devono essere utilizzati. </li><li> Determinare la fase lineare di amplificazione esponenziale di reazione PCR per ciascuna serie di primer, calcolando la formula che risolve quantità di DNA secondo l&#39;(soglia ciclo) Ct valore, che si basa sulla curva standard utilizzando la serie di diluito DNA genomico in 3a. 1. </li><li> Se il valore di Ct ed ChIP-DNA e controllo di input sono all&#39;interno della gamma lineare del valore Ct, calcolare l&#39;arricchimento di ChIP-DNA rispetto ed input, a seconda del fattore di diluizione della ChIP-DE DNA e controllo di input in 2.4. </li></ol> 3b. Amplifica ChIP-per il sequenziamento del DNA ed elevato throughput. <ol><li> End-riparazione di ChIP-ed mix DNA (UsaEpicentre DNA END-Repair kit), costituita il ghiaccio: 1-34 DNA genomico microlitri da passo 2,12 (da 0,1 a 5 pg) 5 microlitri tampone 10x End riparazione 5 microlitri mix 2,5 mM dNTP 5 microlitri 10 mM ATP x pl H 2 O per regolare il volume di reazione di 49 microlitri 1 pl End-Repair mix enzima (DNA polimerasi T4 + polinucleotide chinasi T4) Incubare per 45 minuti a RT. Purificare reazione con Qiagen reazione MinElute Cleanup kit. Eluire in 30 microlitri tampone di eluizione (EB). </li><li> Aggiungere A-sovrasta all&#39;estremità 3 &#39;: 30 pl di DNA prodotto eluito dalla 3b.1 passo Buffer 5 microlitri NEB 10x # 2 10 pl 1 mM dATP 2 microlitri dH 2 O 3 microlitri 5 U / pl frammento di Klenow (3 &#39;→ 5&#39; Exo-) Incubare per 30 minuti a 37 ° C. Purificare reazione con MinElute kit ReactionCleanup. Eluire in 10 pl EB. </li><li> Solexa legatura linker: 10 pl di DNA eluito dalla 3b.2 passo 10 pl ddh 2 O 2.5 &amp;mu; l 10x tampone di T4 DNA ligasi 1 ml mix oligo Adattatore da Illumina (1/10-diluted dal magazzino) 2,5 microlitri DNA ligasi T4 (400 unità / pl) Incubare per 1 ora a RT. Purificare reazione con MinElute kit ReactionCleanup. Eluire in 20 pl EB. Esempio possono essere conservati a -20 ° C. </li><li> Eseguire il campione eluito da DNA 3B.3 passo utilizzando l&#39;indirizzo e-gel apparecchio. Isolare la banda di 300-500 bp nel gel e purificare mediante il Gel Extraction kit Qiagen (questo passaggio elimina i ~ 125 bp auto-legato linker dalla ligazione dell&#39;adattatore oligo). Eluire in 12 pl EB. </li><li> Amplifica libreria tramite accoppiato-end (PE) primer da Illumina: 10,5 pl di DNA eluito dalla 3B.4 passo 12,5 microlitri di master mix (2X Phusion HF, Finnzymes) 1 ml di primer PCR PE1 1 1 ml di primer PCR PE2 2 PCR condizione: 98 ° C per 30 sec (98 ° C 10 sec, 65 ° C 30 sec, 72 ° C 30 sec), 20 cicli si ripetono 72 ° C per 5 minuti. </li><li> Campioni di 3b.5 passo può essere utilizzato per ChIP-seq dopo aver selezionato il DNA di dimensioni adeguate (300-500 bp) utilizzando lo standard 2% gel di agarosio. Esempio possono essere conservati a -20 ° C. E &#39;meglio isolare ogni campione ChIP su un unico gel per prevenire la contaminazione. I campioni possono essere presentate per high-throughput sequencing. </li></ol> 3c. Solexa pipeline di analisi <ol><li> Il 25-bp sequenziamento legge sono stati ottenuti dal genoma Illumina Analyzer (GA) pipeline. </li><li> Tutte le letture sono state allineate al genoma di Drosophila (dm3) utilizzando l&#39;antilope (Efficient Allineamento locale dei dati Nucleotide) software, che consente fino a due discrepanze con la sequenza di riferimento. </li><li> Letture in modo univoco mappato sono state selezionate per l&#39;analisi a valle. Per letture multiple identici, fino a tre copie sono state conservate per ridurre la possibilità di distorsioni di amplificazione PCR. </li><li> L&#39;uscita del Pipeline GA è stato convertito in dati estendibili del browser (BED) file. </li><li> Per generarei file di parrucca per caricare al browser per la visualizzazione UCSC, abbiamo usato una bisaccia python che è stato descritto in una precedente pubblicazione 3 con 4 bp, come la dimensione della finestra e 160 bp, come la dimensione del frammento di DNA. </li><li> Per classificare i geni nella Drosophila geni silenziosi e espressa, abbiamo utilizzato un numero digitale chiamato RPKM (letture / per kilobasi fusa regione exonic / per milione mappata letture). I geni con RPKM = 0 sono stati classificati come gruppo silenzioso e geni con RPKM ≥ 1 sono stati classificati nei gruppi espresse, che possono essere classificate in tre sottogruppi come i geni con livelli bassi di espressione, moderato e alto, e ogni gruppo ha circa lo stesso numero di geni. </li><li> Per confrontare il livello di modificazione degli istoni e l&#39;espressione genica, abbiamo utilizzato uno script python che è stato descritto in una precedente pubblicazione 3. </li></ol> 4. Risultati rappresentativi Esempi di ChIP-qPCR risultati utilizzando Bam (sacchetto di biglie) mutante<html> testicoli sono mostrati in Figura 1 4. In Bam testicoli, si verifica un errore nel passaggio dal spermatogoni proliferativa a differenziare spermatociti 5, 6. Usiamo bam testicoli come fonte di cellule germinali indifferenziate, che sono arricchiti in questo tipo di tessuto. Differenziazione dei geni necessari per la differenziazione degli spermatozoi, come maschio-specifico fattore di trascrizione 87 (mst87F), Don Juan (dj), e la cipolla fuzzy (fzo) non sono espressi in Bam testicoli. Questi geni sono altamente arricchito con la repressione H3K27me3 modifica istoni 7 (Figura 1A), ma sono privi del attivo H3K4me3 modifica istoni 8 (Figura 1B), una firma cromatina abbiamo chiamato 7 &#39;monovalente&#39;. Arricchimento di una o H3K27me3 H3K4me3 è determinata dalla normalizzazione ad una ciclina costitutivamente espressa A (CYCA) del gene 4. contenuto &quot;&gt; ChIP-seq analisi utilizzando lo stesso set di anticorpi (cioè repressiva H3K27me3 e attiva H3K4me3) con bam testicoli mutanti (Figura 2) qPCR convalidato i risultati illustrati nella Figura 1. Per i tre geni testati differenziazione terminale mst87F, dj e fzo , le regioni genomiche sono altamente arricchito con H3K27me3 ma non H3K4me3 (Figura 2A-2C). In contrasto, il gene espresso costitutivamente CYCA ha H3K4me3 significativo ma poco H3K27me3 vincolante in prossimità del suo sito di inizio trascrizione (TSS) (Figura 2D). Inoltre, i profili di ChIP H3K27me3 e H3K4me3 vicino ai TSSS di quattro classi di geni differenzialmente espressi sono coerenti con la funzione di ogni modificazione degli istoni. Come mostrato in figura 3A, l&#39;arricchimento di H3K27me3 valle del TSSS è inversamente correlato al livello di espressione genica. I geni silenziosi hanno il più alto H3K27me3 mentre ilgeni altamente espressi non hanno H3K27me3 vincolanti. Questi dati sono coerenti con il ruolo repressivo di H3K27me3 sull&#39;espressione del gene. Al contrario, l&#39;arricchimento delle H3K4me3 intorno alle TSSS hanno mostrato la correlazione opposta con il livello di espressione genica (Figura 3B), coerente con il ruolo attivo di H3K4me3 sull&#39;espressione genica. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3745/3745fig1.jpg" /> Figura 1. Analisi qPCR di ChIP-ed utilizzando anticorpi contro il DNA sia il repressiva H3K27me3 modificazione degli istoni (A) o attivo H3K4me3 modificazione degli istoni (B) nei testicoli cellule indifferenziate mutanti arricchito bam. (A) a Bam testicoli, i geni di differenziazione (Mst87F, dj, fzo) sono arricchiti con la modifica H3K27me3 repressiva degli istoni. (B) geni di differenziazione si esauriscono con H3K4me3 marchio attivo. Il livello di DNA ChIP (DNA ChIP / ingresso) al gene bersaglio (Mst87F, dj o fzo) per la prima volta normalizzata la Lev<html> el DNA di ChIP al gene di controllo CYCA. Le barre di errore indicano la deviazione standard da tre repliche indipendenti biologica. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3745/3745fig2.jpg" /> Figura 2. UCSC Genome Browser istantanee di H3K27me3 e H3K4me3 arricchimento attraverso le intere regioni genomiche di (A) Mst87F (B), dj e (C) fzo, (D) geni CYCA. La A cerchiata H3K27me3 arricchita di regione (D) riflette lo stato della cromatina una sovrapposizione gene CG7264, che si esprime umile bam testicoli (RPKM = 1), ma altamente espresso nel wild-type testicoli (RPKM = 130) 8 (ChIP-seq dati provenienti da 7). Sonde utilizzate in analisi PCR quantitativa dei risultati chip in figura 1 sono classificati nella parte inferiore di ogni parcella. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/3745/3745fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . tp_upload/3745/3745fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. ChIP-seq profili utilizzando H3K27me3 e H3K4me3 in bam testicoli 7. I quattro gruppi di geni (7.509 geni) sono stati classificati in base ai livelli di espressione genica loro basati su RNA-seq 8 risultati. Le classi rappresentative dei geni sono tracciate per l&#39;arricchimento di una particolare modificazione degli istoni, utilizzando sequenze da 3kb 3kb a monte a valle dei siti di trascrizione loro inizio (TSSS). Questo genera un profilo di arricchimento (A) H3K27me3 (K27) e (B) H3K4me3 (K4) ChIP-seq analisi di ciascun gruppo. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/3745/3745fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> .

<ol>
	<li>Kharchenko, P. V., Alekseyenko, A. A., Schwartz, Y. B., Minoda, A., Riddle, N. C., Ernst, J., Sabo, P. J., Larschan, E., Gorchakov, A. A., Gu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analysis+of+the+chromatin+landscape+in+Drosophila+melanogaster.">Comprehensive analysis of the chromatin landscape in Drosophila melanogaster.</a> Nature. 471, 480-485 (2011).</li><li>Filion, G. J., van Bemmel, J. G., Braunschweig, U., Talhout, W., Kind, J., Ward, L. D., Brugman, W., de Castro, I. J., Kerkhoven, R. M., Bussemaker, H. J., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+protein+location+mapping+reveals+five+principal+chromatin+types+in+Drosophila+cells.">Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells.</a> Cell. 143, 212-224 (2010).</li><li>Barski, A., Cuddapah, S., Cui, K., Roh, T. Y., Schones, D. E., Wang, Z., Wei, G., Chepelev, I., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome.">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129, 823-837 (2007).</li><li>Chen, X., Lu, C., Prado, J. R., Eun, S. H., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+changes+at+differentiation+gene+promoters+as+they+become+active+in+a+stem+cell+lineage.">Sequential changes at differentiation gene promoters as they become active in a stem cell lineage.</a> Development. 138, 2441-2450 (2011).</li><li>Gonczy, P., Matunis, E., DiNardo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bag-of-marbles+and+benign+gonial+cell+neoplasm+act+in+the+germline+to+restrict+proliferation+during+Drosophila+spermatogenesis.">bag-of-marbles and benign gonial cell neoplasm act in the germline to restrict proliferation during Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 124, 4361-4371 (1997).</li><li>McKearin, D. M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bag-of-marbles:+a+Drosophila+gene+required+to+initiate+both+male+and+female+gametogenesis.">bag-of-marbles: a Drosophila gene required to initiate both male and female gametogenesis.</a> Genes Dev. 4, 2242-2251 (1990).</li><li>Gan, Q., Schones, D. E., Eun, S. H., Wei, G., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monovalent+and+unpoised+status+of+most+genes+in+undifferentiated+cell-enriched+Drosophila+testis.">Monovalent and unpoised status of most genes in undifferentiated cell-enriched Drosophila testis.</a> Genome Biol. 11, 42-42 (2010).</li><li>Gan, Q., Chepelev, I., Wei, G., Tarayrah, L., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+regulation+of+alternative+splicing+and+chromatin+structure+in+Drosophila+gonads+revealed+by+RNA-seq.">Dynamic regulation of alternative splicing and chromatin structure in Drosophila gonads revealed by RNA-seq.</a> Cell Res. 7, 763-783 (2010).</li></ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

La versatilità di analisi ChIP discussi in questo protocollo può essere utilizzato su diversi tessuti, che fornisce l&#39;opportunità di studiare lo stato cromatina in un sistema biologicamente rilevante. Esperimenti chip utilizzando cellule coltivate sono sistemi conveniente eseguire a causa grande quantità di cellule può essere ottenuto facilmente. Tuttavia, cellule coltivate non riflette necessariamente cellule in un multi-cellulare ambiente. Con lo sviluppo di questa tecnica usando tessuti sezionati da animali vivi, siamo in grado di rispondere a molte domande che le cellule in coltura non può. Nonostante l&#39;utilità di questo protocollo, ci sono diversi avvertimenti. Ad esempio, il tessuto sezionato è ancora eterogeneo con molti tipi di cellule differenti. Mentre le cellule relativamente omogenee può essere ottenuto in tessuti di Drosophila come dischi immaginale, di altri tessuti, come fegato, testicoli e ovaie che contengono tutte limitate le cellule staminali adulte sono eterogenei. Tale complicazione può essere parzialmenteaffrontato tramite un potente Drosophila genetica. Ad esempio, sebbene le cellule staminali esistono in una piccola popolazione in tessuti discussi sopra e sono estremamente difficili da isolare in un numero sufficiente per l&#39;analisi ChIP, popolazione di cellule staminali possono essere arricchiti mediante sfondo geneticamente mutato. Il gene bam è necessario per la differenziazione delle cellule staminali in Drosophila germinale lignaggio 5,6. Pertanto bam gonadi mutanti sono una buona fonte di cellule germinali indifferenziate arricchiti. Eseguendo ChIP con bam mutante, possiamo ottenere un paesaggio epigenomic nelle cellule germinali indifferenziate.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Complete Mini cocktail inibitore della proteasi </td><td> Roche </td><td> 11836153001 </td><td></td></tr><tr><td> La formaldeide (37%) </td><td> Supelco </td><td> 47.083-U </td><td></td></tr><tr><td> PMSF </td><td> Sigma </td><td> 78830 </td><td></td></tr><tr><td> Kontes pellet pestello </td><td> Fischer Scientific </td><td> K749521-1590 </td><td></td></tr><tr><td> PCR Purification Kit </td><td> Qiagen </td><td> 28104 </td><td></td></tr><tr><td> Poliacrilammide lineare </td><td> Sigma </td><td> 56575-1 ml </td><td></td></tr><tr><td> Glicogeno </td><td> Qiagen </td><td> 158930 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR green / ROX qPCR Master Mix </td><td> Fermentas </td><td> K0223 </td><td></td></tr><tr><td> Mini Piastra filatrice </td><td> Labnet </td><td> Z723533 </td><td></td></tr><tr><td> Real time PCR System </td><td> Applied Biosystem </td><td> 4351101 </td><td></td></tr><tr><td> Volume piccolo processore ad ultrasuoni </td><td> Misonix </td><td> HS-XL2000 </td><td> Modello interrotto </td></tr><tr><td> Dynabeads, Proteina A </td><td> Invitrogen </td><td> 100-01D </td><td></td></tr><tr><td> Dynamag magnete </td><td> Invitrogen </td><td> 123-21D </td><td></td></tr><tr><td> Fenolo: Chlorofrom: IAA </td><td> Invitrogen </td><td> 15593-049 </td><td></td></tr><tr><td> Epicentre DNA END-Repair Kit </td><td> Epicentre Biotecnologie </td><td> ER0720 </td><td></td></tr><tr><td> MinElute Reaction Cleanup Kit </td><td> Qiagen </td><td> 28204 </td><td></td></tr><tr><td> Klenow Fragment (3 &#39;→ 5&#39; exo-) </td><td> New England Biolabs </td><td> M0212S </td><td></td></tr><tr><td> DNA ligasi T4 </td><td> Promega Corporation </td><td> M1794 </td><td></td></tr><tr><td> Adattatore oligonucleotidi </td><td> Illumina </td><td> PE-400-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Abbinato-End Primer 1.0 e 2.0 </td><td> Illumina </td><td> 1001783 1001 784 </td><td></td></tr><tr><td> E-Gel Electorphoresis sistema </td><td> Invitrogen </td><td> G6512ST </td><td></td></tr><tr><td> 2X Phusion HF Mastermix </td><td> Finnzymes </td><td> F-531 </td><td></td></tr></tbody></table>

chromatin immunoprecipitation (chip) using drosophila tissue

L&#39;epigenetica rimane un settore in rapida evoluzione che gli studi come lo stato della cromatina contribuisce alla espressione genica differenziale in diversi tipi di cellule a diversi stadi di sviluppo. Regolazione epigenetica contribuisce ad un ampio spettro di processi biologici, tra cui la differenziazione cellulare durante lo sviluppo embrionale e l&#39;omeostasi in età adulta. Una strategia critico negli studi epigenetici è quello di esaminare come le varie modificazioni degli istoni e fattori di cromatina regolare l&#39;espressione genica. Per risolvere questo problema, immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è ampiamente utilizzato per ottenere una fotografia della associazione di fattori particolari con DNA nelle cellule di interesse. ChIP tecnica utilizza comunemente cellule coltivate come materiale di partenza, che può essere ottenuto in abbondanza e omogeneità per generare dati riproducibili. Tuttavia, vi sono diversi avvertimenti: Innanzitutto, l&#39;ambiente far crescere le cellule in piastre di Petri è diversa da quella in vivo, così puònon rispecchiano lo stato endogena cromatina delle cellule in un organismo vivente. In secondo luogo, non tutti i tipi di cellule possono essere coltivate ex vivo. Ci sono solo un numero limitato di linee cellulari, da cui la gente può ottenere abbastanza materiale per l&#39;analisi ChIP. Qui si descrive un metodo per fare esperimenti ChIP utilizzando tessuti di Drosophila. Il materiale di partenza è sezionato da un tessuto animale vivente, quindi in grado di rispecchiare con precisione lo stato endogena cromatina. L&#39;adattabilità di questo metodo con diversi tipi di tessuto permetterà ai ricercatori di affrontare molto più biologicamente questioni rilevanti in materia di regolazione epigenetica in vivo 1, 2. Combinando questo metodo con high-throughput sequencing (ChIP-seq) ulteriormente permetterà ai ricercatori di ottenere un paesaggio epigenomic.

Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue at JoVE.com

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Recentemente high-throughput tecnologia di sequenziamento ha notevolmente aumentato la sensibilità di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) esperimento e ha spinto la sua applicazione con cellule purificate o tessuti sezionati. Qui delineare un metodo per usare la tecnica ChIP con<em&gt; Drosophila</em&gt; Tessuto, che può definire la condizione cromatina endogeno in un sistema ben caratterizzato biologico.

Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) con Drosophila Tessuto

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

chromatin-immunoprecipitation-chip-using-drosophila-tissue

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

25.0K Views.  Johns Hopkins University. Recentemente high-throughput tecnologia di sequenziamento ha notevolmente aumentato la sensibilità di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) esperimento e ha spinto la sua applicazione con cellule purificate o tessuti sezionati. Qui delineare un metodo per usare la tecnica ChIP con Drosophila Tessuto, che può definire la condizione cromatina endogeno in un sistema ben caratterizzato biologico.

Video: Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, transcription factors, or chromatin-modifying enzymes at a given locus or on a genome-wide scale. The combination of ChIP assays with next-generation sequencing (i.e., ChIP-Seq) is a powerful approach to globally uncover gene regulatory networks and to improve the functional annotation of genomes, especially of non-coding regulatory sequences. ChIP protocols normally require large amounts of cellular material, thus precluding the applicability of this method to investigating rare cell types or small tissue biopsies. In order to make the ChIP assay compatible with the amount of biological material that can typically be obtained in vivo during early vertebrate embryogenesis, we describe here a simplified ChIP protocol in which the number of steps required to complete the assay were reduced to minimize sample loss. This ChIP protocol has been successfully used to investigate different histone modifications in various embryonic chicken and adult mouse tissues using low to medium cell numbers (5 x 104 - 5 x 105 cells). Importantly, this protocol is compatible with ChIP-seq technology using standard library preparation methods, thus providing global epigenomic maps in highly relevant embryonic tissues.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Here, we describe a chromatin immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-seq library preparation protocol to generate global epigenomic profiles from low-abundance chicken embryonic samples.

Protocollo di immunoprecipitazione (ChIP) della cromatina per campioni embrionali bassa-abbondanza

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Ricerca

Genetica

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a protocol for performing the chromatin conformation capture technique in situ Hi-C on staged Drosophila melanogaster embryo populations. The result is a sequencing library that allows the mapping of all chromatin interactions that occur in the nucleus in a single experiment. Embryo sorting is done manually using a fluorescent stereo microscope and a transgenic fly line containing a nuclear marker. Using this technique, embryo populations from each nuclear division cycle, and with defined cell cycle status, can be obtained with very high purity. The protocol may also be adapted to sort older embryos beyond gastrulation. Sorted embryos are used as inputs for in situ Hi-C. All experiments, including sequencing library preparation, can be completed in five days. The protocol has low input requirements and works reliably using 20 blastoderm stage embryos as input material. The end result is a sequencing library for next generation sequencing. After sequencing, the data can be processed into genome-wide chromatin interaction maps that can be analyzed using a wide range of available tools to gain information about topologically associating domain (TAD) structure, chromatin loops, and chromatin compartments during Drosophila development.

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

This work describes a protocol for the generation of high resolution in situ Hi-C libraries from tightly staged pre-gastrulation Drosophila melanogaster embryos.

Generazione di Genome-wide cromatina conformazione cattura librerie da strettamente in fasi precoce embrioni della drosofila

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after injury (Teng et al., 2006). It is recognized that transcriptional programs essential for neurite and axonal outgrowth are 
reactivated upon injury in the PNS (Makwana et al., 2005). However the tools available to analyze neuronal gene regulation in vivo are limited and 
often challenging.
The dorsal root ganglia (DRG) offer an excellent injury model system because both the CNS and PNS are innervated by a 
bifurcated axon originating from the same soma. The ganglia represent a discrete collection of cell bodies where all transcriptional events occur, 
and thus provide a clearly defined region of transcriptional activity that can be easily and reproducibly removed from the animal. Injury of nerve 
fibers in the PNS (e.g. sciatic nerve), where axonal regeneration does occur, should reveal a set of transcriptional programs that are distinct from 
those responding to a similar injury in the CNS, where regeneration does not take place (e.g. spinal cord). Sites for transcription factor binding, 
histone and DNA modification resulting from injury to either PNS or CNS can be characterized using chromatin immunoprecipitation (ChIP). 
Here, we describe a ChIP protocol using fixed mouse DRG tissue following axonal injury. This powerful combination provides a means for characterizing the pro-regeneration chromatin environment necessary for promoting axonal regeneration.

We present a method for chromatin immunoprecipitation from dorsal root ganglia tissue following axonal injury. The approach can be used to identify specific transcription factor binding sites and epigenetic modification of histone and DNA important for the regeneration of injured axons in both the peripheral and central nervous system.

Immunoprecipitazione della cromatina dal tessuto dei gangli dorsali seguenti danno assonale

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Neuroscienze

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of a wide range of transcription factors (TFs) and cofactors mediating transcriptional activation or repression via changes in chromatin structure. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a useful molecular biology approach for mapping histone modifications and profiling transcription factors/cofactors binding to DNA, thus providing a snapshot of the dynamic nuclear changes occurring during different biological processes.
To study transcriptional regulation in adipose tissue, samples derived from in vitro cell cultures of immortalized or primary cell lines are often favored in ChIP assays because of the abundance of starting material and reduced biological variability. However, these models represent a limited snapshot of the actual chromatin state in living organisms. Thus, there is a critical need for optimized protocols to perform ChIP on adipose tissue samples derived from animal models.
Here we describe a protocol for efficient ChIP-seq of both histone modifications and non-histone proteins in brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. The protocol is optimized for investigating genome-wide localization of proteins of interest and epigenetic markers in the BAT, which is a morphologically and physiologically distinct tissue amongst fat depots.

Here we describe a protocol for efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) followed by high-throughput DNA sequencing (ChIP-seq) of brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. This protocol is suitable for both mapping histone modifications and investigating genome-wide localization of non-histone proteins of interest in vivo.

Immunoprecipitazione della cromatina del tessuto adiposo marrone murino

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

Immunoprecipitazione della cromatina di cellule staminali embrionali umane

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Biologia

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological advantages provided by the giant salivary gland polytene chromosomes of third instar larvae.  In this tissue the chromosomes undergo many rounds of replication in the absence of cell division giving rise to approximately 1000 copies.  The DNA remains aligned after each replicative cycle resulting in greatly enlarged chromosomes that provide a unique opportunity to correlate chromatin morphology with the localization of specific proteins.  Consequently, there has been a high level of interest in defining the epigenetic modifications present at different genes and at different stages of the transcription process. An important tool for such studies is the labeling of polytene chromosomes with antibodies to the enzyme, transcription factor, or histone modification of interest. This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

Preparazione dei cromosomi di Drosophila Zucche politene per l&#39;etichettatura di anticorpi

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

Saggio di immunoprecipitazione della cromatina per geni tessuto-specifici utilizzando nella fase iniziale di embrioni di topo

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Chromatin Extraction from Frozen Chimeric Liver Tissue for Chromatin Immunoprecipitation Analysis

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on host and/or pathogen chromatin. Chromatin preparation from tissues creates additional challenges that need to be overcome to obtain reproducible and reliable protocols comparable to those used for cell culture. Tissue disruption and fixation are critical steps to achieve efficient shearing of chromatin. Coexistence of different cell types and clusters may also require different shearing times to reach optimal fragment size and hinders shearing reproducibility. The purpose of this method is to achieve reliable and reproducible host chromatin preparations from frozen tissue (liver) suitable for both ChIP-qPCR and next generation sequencing (NGS) applications. We observed that the combination of liquid nitrogen tissue pulverization followed by homogenization leads to increased reproducibility compared to homogenization only, since it provides a suspension consisting mostly of dissociated single cells that can be efficiently sheared. Moreover, the fixation step should be performed under mild rotation to provide homogeneous crosslinking. The fixed material is then suitable for buffer-based nuclei isolation, to reduce contamination of cytoplasmic protein and pathogen DNAs and RNAs (when applicable), avoiding time-consuming centrifugation gradients. Subsequent sonication will complete nuclear lysis and shear the chromatin, producing a specific size range according to the chosen shearing conditions. The size range should fall between 100 and 300 nt for NGS applications, while it could be higher (300-700 nt) for ChIP-qPCR analysis. Such protocol adaptations can greatly improve chromatin analyses from frozen tissue specimens.

This protocol focuses on chromatin preparation from snap frozen tissues and it is suitable for Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) followed by either quantitative PCR analysis (X-ChIP-qPCR) or next generation sequencing approaches (X-ChIP-seq).

Estrazione della cromatina dal tessuto epatico chimerico congelato per l'analisi dell'immunoprecipitazione della cromatina

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on ...

Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

Visualization of heterochromatin aggregates by immunostaining can be challenging. Many mammalian components of chromatin are conserved in Drosophila melanogaster. Therefore, it is an excellent model to study heterochromatin formation and maintenance. Polytenized cells, such as the ones found in salivary glands of third instar D. melanogaster larvae, provide an excellent tool to observe the chromatin amplified nearly a thousand times and have allowed researchers to study changes in the distribution of heterochromatin in the nucleus. Although the observation of heterochromatin components can be carried out directly in polytene chromosome preparations, the localization of some proteins can be altered by the severity of the treatment. Therefore, the direct visualization of heterochromatin in cells complements this type of study. In this protocol, we describe the immunostaining techniques used for this tissue, the use of secondary fluorescent antibodies, and confocal microscopy to observe these heterochromatin aggregates with greater precision and detail.

Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

This protocol aims to visualize heterochromatin aggregates in Drosophila polytene cells.

Colorazione immunofluorescente per la visualizzazione delle proteine associate all'eterocromatina nelle ghiandole salivari della Drosophila

Visualization of heterochromatin aggregates by immunostaining can be challenging. Many mammalian components of chromatin are conserved in Drosophila ...

Chromatin Immunoprecipitation

Histones are proteins that help organize DNA in eukaryotic nuclei by serving as &#8220;scaffolds&#8221; around which DNA can be wrapped, forming a complex called &#8220;chromatin&#8221;. These proteins can be modified through the addition of chemical groups, and these changes affect gene expression. Researchers use a technique called chromatin immunoprecipitation (ChIP) to better understand which DNA regions associate with specific histone modifications or other gene regulatory proteins. Antibodies are used to isolate the protein of interest, and the bound DNA is extracted for analysis. Here, JoVE presents the principles behind ChIP, discussing specific histone modifications and their relationship to gene expression and DNA organization. We then review how to perform a ChIP protocol, and explore the ways scientists are currently using this technique.

Immunoprecipitazione della cromatina

Histones are proteins that help organize DNA in eukaryotic nuclei by serving as &#8220;scaffolds&#8221; around which DNA can be wrapped, forming a complex ...