Gli autori desiderano ringraziare per la consulenza tecnica e supporto da Ren Sole (University of California, Los Angeles) e Seungmin Hwang (Washington University). Questo lavoro è stato finanziato dalla Fondazione Baxter, National Institutes di borse di Salute (R01 e R21 CA140964 AI083841 a C. Liang).

Il protocollo seguito descriverà i titoli di studio dei virus e dei carichi genoma virale nel ciclo di infezione litica e latente di γHV68 nei topi, che può teoricamente essere utilizzato per valutare l&#39;infezione da virus che condividono lo stile di vita simile a quella di γHV68. 1. Amplificazione di γHV68 <ol><li> Scongelare una fiala congelata di γHV68 a bagnomaria a 37 ° C. </li><li> Aggiungi inoculums virale per NIH3T12 o colture di cellule 3T3 (~ 50% di confluenza) in 10 piatti cm e cultura le cellule infette a 37 ° C in 5% di CO 2. </li><li> Esaminare la cultura al microscopio l&#39;effetto citopatico (CPE) e raccogliere i mezzi di comunicazione in un momento superiore al 80% delle cellule mostrano CPE 4 ~ 5 giorni dopo l&#39;infezione. Per massimizzare il rendimento di virus, la coltura di cellule infettate possono essere congelati e scongelati-due volte di liberare tutti i cellulari associati γHV68. </li><li> Centrifugare i media raccolti a 1000 rpm per 5 minuti a temperatura ambiente (RT) per rimuovere i detriti cellulari. </li><li> Trasferire accuratamente l&#39;surnatanti di nuovi tubi ad alta velocità (provetta da centrifuga) senza toccare i detriti cellulari in basso. </li><li> Centrifuga ad alta velocità a 12.000 giri (per Sorvall SA-600) a 4 ° C per almeno 1,5 ore a concentrarsi particelle virali. </li><li> Eliminare il surnatante in una soluzione di candeggina 10γ e con attenzione risospendere il pellet (virus e detriti cellulari residua) con 1 ml di DMEM senza siero. Trasferire la ri-precipitato sospeso in un ml 1,5 micro-centrifuga tubo e mescolare bene nel vortex. </li><li> Centrifugare per 2 minuti alla massima velocità per rimuovere i detriti residui cellulari e trasferire il surnatante (stock virus) in una nuova provetta. Questo è lo stock finale per l&#39;infezione virale. Il titolo dello stock del virus è determinato mediante test placca (vedi sotto). </li></ol> 2. L&#39;infezione intranasale di topi con γHV68 <ol><li> Infettare topi a ~ 6 settimane di età con 1.000 ~ 5.000 unità formanti placca (PFU) di topi per γHV68. </li><li> Anestetizzaretopi mediante iniezione di ketamina / xylazina (60 microlitri / mouse da una miscela di 80 mg / ml di ketamina e 12 mg / ml xilazina) nella cavità peritoneale. Monitor anestesia da pizzicare la punta topi. Di solito ci vogliono 5-10 min ~. Se i topi non sono completamente anestetizzati, saranno starnuto il virus. </li><li> Quando il mouse è completamente anestetizzato, utilizzare una pipetta per inoculare ~ 30 ml di PBS contenente γHV68 (15 microlitri per ogni narice) a topi goccia a goccia lentamente ma costantemente. Assicurarsi che il mouse è davvero inalare le gocce senza cercare di formare bolle. </li><li> Lasciare il mouse per recuperare per 10-15 minuti e monitorare il benessere dei topi (es. coscienza, respirazione, ecc) prima di restituirli alla gabbia. Gli animali vengono controllati ogni giorno di malattia e l&#39;adeguatezza di cibo, acqua, biancheria da letto e le condizioni. Se i segni clinici di malattia, dolore o angoscia sviluppare, diagnostica di routine per determinare l&#39;eziologia sarà condotta. Gli animali che perdono più del 20% del loro peso corporeo verrà registrato per la perdita di peso massimoe eutanasia. La decisione finale di eseguire l&#39;eutanasia è a discrezione del veterinario clinico ed è presa previa consultazione con il ricercatore principale. </li></ol> 3. La placca di analisi per determinare il titolo del virus nei polmoni con infezione acuta <ol><li> I titoli di infettività del virus sono determinate dalla formazione di placca su monostrati di cellule Vero. </li><li> Cellule Vero sono seminate a 2.5x10 4 cellule / pozzetto in 12 piastre a pozzetti del giorno prima analisi della placca. Le cellule devono essere distribuite uniformemente e la densità cellulare dovrebbe raggiungere il 30 - 40% nel giorno del test placca. </li><li> Preparare 0,5% (w / v) metilcellulosa (MC) mezzo di copertura (Tabella 1). </li><li> Sacrificio γHV68 topi infettati 5-7 giorni dopo l&#39;infezione intranasale per determinare fase acuta titoli del virus nei polmoni. Per euthanization ketamina HCl (80-100 mg / kg SC, IM, IP) verranno amministrati IM seguita da sovradosaggio per via endovenosa di sodio pentobarbital (30-50 mg / kg IP). Questo metodo è approvato da t&#39;American Veterinary Medical Association. </li><li> Raccogliere i polmoni e risciacquare due volte con 1 x PBS per rimuovere le cellule del sangue. Raccogliere un lato dei polmoni in 1 ml ghiacciata terreno completo DMEM e tenere sul ghiaccio. Rapidamente congelare l&#39;altro lato dei polmoni e conservare a -80 ° C per l&#39;esame dei carichi DNA virale nei polmoni da qPCR (vedi sotto). </li><li> Utilizzare un omogeneizzatore ad omogeneizzare il tessuto tessuti polmonari alla massima velocità per 1 secondo, gelo-disgelo e-tre volte. Lavare l&#39;omogeneizzatore con etanolo al 70% ad ogni passo quando si cambia il campione. </li><li> Centrifugare il tessuto omogeneizzato a 3.000 giri per 10 minuti a 4 ° C. Raccogliere il surnatante e trasferimento in nuovi tubi per il dosaggio della placca. </li><li> Preparare diluizioni seriali (di solito da 10 ° a 10 -8) dei campioni di polmone omogenato in 1,5 ml di micro-tubi con centrifuga pianura DMEM da vortice. Prefill il numero adeguato di appositi tubi con 540 microlitri DMEM e diluire 60 omogenato microlitri nel primo tubo. Trasferire 60 microlitri dal primo tubo inon il prossimo, e così via. </li><li> Aspirare multimediali dal monostrati preparato Vero nel 12-pozzetti e carico 200 l / omogenato e serialmente diluiti contenenti virus infettivi in un ordine inverso (da 10 -8 a 10 °). Utilizzare due pozzi per ogni titolazione (in duplice copia). </li><li> Incubare cellule Vero con il virus inoculums 1 ora a 37 ° C. Mescolare delicatamente i piatti ogni 15 minuti per distribuire uniformemente il virus per il monostrato. </li><li> Rimuovere il inoculums e sostituirlo con 2 ml / pozzetto di mezzo di copertura (Tabella 1). Incubare le piastre per una settimana a 37 ° C. </li><li> Rimuovere il mezzo di copertura (non ha bisogno di essere completa) e sostituirlo con la correzione / media macchia di dosaggio placca (Tabella 1) e incubare per almeno 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Quando le piastre sono asciugati, contare il numero di ben isolate placche ad ogni diluizione. Per ridurre al minimo errore, solo i pozzetti contenenti tra placche 10 e 100 sono contati. </li><li> Calcolare il titolo del virus usando il Folloala formula: titolo (pfu / ml) = [(numero di placche / pozzetto) / (volume di inoculums / pozzetto)] x fattore di diluizione. </li></ol> 4. Centro di saggio infettive per determinare la carica virale in splenociti latentemente infette <ol><li> Carico latente virale è determinata dalla infettive centro (IC), saggio sul monostrato di cellule Vero. Il giorno prima del test IC, le cellule Vero seme in 6 pozzetti (1 -. 2,5 x 10 5 cellule / pozzetto Usiamo solitamente 11 pozzi per campione milza, 10 pozzi saranno utilizzati per la sospensione diluita serialmente splenociti e un bene per i test riattivazione spontanea del virus dopo cicli gelo-disgelo. </li><li> Sacrificare i topi infettati dopo la latenza è stabilito (12 - 14 giorni dopo l&#39;infezione). Raccolto la milza del mouse e la piscina li in 1 ml di DMEM freddo. </li><li> Dissociazione meccanica della milza del mouse. Trasferire la milza del mouse appena isolato in una tavola 10 cm e aggiungere 10 ml di supporto desiderato, come DMEM con 2% FBS. Wet due-end di vetro smerigliato microscdiapositive con ope ghiacciata media. Posizionare la milza sul lato smerigliato di una diapositiva e nick la capsula con il bordo della fine smerigliata del vetrino altri. Meccanicamente dissociare la milza tra due vetrini fino a quando tutti i grumi rossi sono schiacciati (anche rimuovere le particelle di grasso, se presente). </li><li> Sciacquare i vetrini con DMEM per recuperare cellule rimanenti su entrambe le diapositive. </li><li> Trasferire la sospensione intero tessuto delicatamente attraverso un colino cellula (40 mesh di nylon micron) in una conica da 50 ml con tappo a vite del tubo. Lavare i 10 cm contenente il piatto omogenati di milza con 10 ml di PBS e il trasferimento, mentre il filtraggio. </li><li> Centrifugare la singola cellula sospensioni 10 min a 375 xg ed eliminare il surnatante. Flick il pellet cellulare per rompere grumi di cellule già esistenti. Aggiungere 5 ml di tampone ACK (Tabella 1) per lisare i globuli rossi. Incubare 5 min e centrifugare di nuovo a 375 x g. </li><li> Eliminare il supernatante e risospendere il pellet, a fondo, ma delicatamente, in PBS con il 2% FBS. Mantenere le cellule a 4 ° C. Utilizzare una pipetta perrimuovere i detriti, se presente. Conte cellule vitali mediante un contatore automatico di cellule (Bio-Rad). </li><li> Rallenta il PBS-risospeso splenociti a 375 xg per 4 minuti. Gettare il surnatante e risospendere le cellule in 4 ml di DMEM completo (2 x 1 ml verranno utilizzati per l&#39;analisi IC della sospensione originale; 0,6 ml usato per serie di cinque volte nel test di diluizione IC, 0,4 ml per la preparazione del DNA virale e qPCR, e 1 ml di sospensione saranno utilizzati per valutare la riattivazione spontanea del virus latente dopo tre cicli gelo-disgelo) </li><li> Preparare serie di cinque diluizioni (cioè 1 / 5, 1 / 25, 1 / 125, 1 / 250) di sospensione splenociti di duplicati. Prefill le provette da 15 ml con DMEM 2,4 ml e diluire 600 microlitri sospensione splenociti sul primo tubo e mescolare bene. Trasferire 600 microlitri dal tubo precedente nel tubo successivo, ecc Non vortice! </li><li> Aspirare il terreno dalla preparato 6-ben monostrato di cellule Vero. Semi di 1 ml di splenociti in serie diluito su cellule Vero con ogni DUPL diluizionedicato (10 pozzi saranno utilizzati per 0, 1 / 5, 1 / 25, 1 / 125, 1 / 250 diluizioni). </li><li> Incubare le piastre 8-12 ore a 37 ° C e 5% di CO 2. Non superare 24 ore. Aspirare la sospensione seminato splenociti e carico di 4 ml di sovrapposizione dei media (Tabella 1) in ogni pozzetto. Incubare per altri 6 giorni. </li><li> Determinare i livelli di centri milza infettive dalla colorazione i piatti con lo 0,2% (w / v) cristalvioletto come mostrato nel saggio placca. </li></ol> 5. Quantificazione del genoma virale <ol><li> Estrarre il DNA genomico totale dal γHV68 tessuti infetti, come polmone e milza campioni in questo esperimento. Utilizzare il sangue DNeasy e kit di Tissue (Qiagen), seguendo il protocollo del produttore. </li><li> Determinare la concentrazione di DNA di ogni campione per garantire la stessa quantità di DNA utilizzate per il dosaggio qPCR. Progettare il virus-specifici primer (~ 200 bp amplificato è preferibile per un saggio qPCR). Abbiamo usato il γHV68 ORF56 specifici primer (forward primer: 5 &amp; prime; - GTAACTCGAGACTGAAACCTCGCAGAGGTCC - 3 &#39;; primer reverse: 5&#39;-CCGAAGCTTGCACGGTGCAATGTGTCACAG-3&#39;) per il dosaggio e β-actina primer (forward primer: 5&#39;-cacccacactgtggcccatcat-3 &#39;Primer inverso: 5&#39;-gtgaggatcttcatgaggtagtc-3&#39;) come un controllo per la reazione qPCR. </li><li> Miscelare il campione di DNA (100 - 500 ng è buona) e primers appropriati con 2 x SYBR Master Mix (Bio-Rad iQ SYBR Green Supermix). Utilizzare il Bio-Rad Real-Time PCR System per quantificare la carica virale nei tessuti infetti. Eseguire PCR al seguente condizione: 95 ° C per 15 min e 45 cicli di 95 ° C per 30 min, 60 ° C per 30 min e 72 ° C per 30 minuti, seguita da analisi della curva di fusione, sia per il virale e actina ampliconi. </li><li> Per effettuare una curva standard per la quantificazione di genomi virali, diluire serialmente quantità note di un DNA γHV68 bacmid con il DNA genomico isolato da cellule non infettate. Esegui qPCR in parallelo con il DNA recuperato dal infezioniTed tessuti utilizzando gli stessi set di virus-specifici primer. </li><li> Presente la carica virale nel genoma dei tessuti come numero di copie di DNA virale per unità (ad esempio 100 o 500 ng ng) di DNA genomico dopo la normalizzazione di actina. </li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: La figura 1 mostra lo schema generale degli esperimenti per la misura di γHV68 infezione nei topi in vivo. Risultati rappresentativi di titoli di virus nei polmoni durante l&#39;infezione acuta di γHV68, come determinato dal saggio di placca, sono stati mostrati in figura 2A. Un ceppo mutante di γHV68 contenente non funzionali virale Bcl-2 (vBcl-2) replicato a livelli paragonabili a wild-type γHV68 nei polmoni dopo 7 giorni l&#39;infezione intranasale di topi BALB / c (6 - 7 topi per gruppo). Nessuna differenza statisticamente significativa nei titoli polmone del virus sono stati individuati tra i due gruppi. Questi dati indicano che vBcl-2 non è un fattore cruciale per l&#39;infezione acuta del γHV68 intopi. Tuttavia, entro il 28 postinfection giorni, il titolo di vBcl-2 virus mutante della milza caduto 6 - a 10 - volte rispetto al WT, misurata con test centro infettive (Figura 2B), suggerendo che la vBcl-2 virus mutante γHV68 è difettoso per il mantenimento della latenza della milza dopo l&#39;infezione. In accordo con il centro infettive titoli ridotta, il carico genoma virale del vBcl-2 virus mutante è stata fortemente ridotta rispetto a quella del virus WT al 28 ° giorno di esperimenti ripetuti, come mostrato nella Figura 2C. La stretta correlazione tra i carichi genoma virale e la frequenza di latente-HV68vBcl-2 mutante ex vivo in fase di riattivazione del virus latente dell&#39;infezione evidenzia un difetto di latenza di questo virus mutante. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3472/3472fig1.jpg" /> Figura 1. Schema per la misura della γHV68 infezione nei topi mediante la formazione di placca, centro infettive e saggio qPCRs. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3472/3472fig2.jpg" /> Figura 2. Infezione latente e litico del WT e mutanti γHV68 virus in vivo. Replica acuta (A) del WT e mutanti vBcl-2 γHV68 virus nei polmoni dei topi BALB / c a 7 dpi (infezione giorno dopo) è stata determinata mediante saggio placca. (B e C) splenico centri infettive (B) e del carico del genoma virale (C) nella milza di topi infetti sono stati misurati a 28 dpi con il saggio centro infettive e qPCR, rispettivamente. Linee rosse, le medie dei valori indicati. ns, non significativo.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

γHV68 è stato ampiamente utilizzato come modello per comprendere la patogenesi delle risorse umane γ-HVS 2,4,5. In questo protocollo, abbiamo descritto tre metodi utilizzati di routine, compreso saggio di placca per titolo virali infettive, test IC per il carico virale latente, e qPCR per il carico del genoma virale, per valutare l&#39;infezione acuta e latente di γHV68 dopo l&#39;inoculazione intranasale nei topi. Il dosaggio della placca è stato ampiamente utilizzato per determinare il titolo del virus nelle cellule infette o tessuti, ma le condizioni ottimali per variare il virus utilizzato. Ciò è in gran parte perché la capacità di virus diversi per produrre placche (lesioni numerabile) su un monostrato cellulare è diverso. γHV68 normalmente produce placche evidenti sul monostrato di cellule Vero scimmia o cellule di topo in coltura come NIH3T12 o 3T3, 6 - 7 giorni dopo l&#39;infezione. In particolare, la sensibilità delle cellule di infezione virale diminuisce con l&#39;invecchiamento della monostrato o diventa sovraffollati Così, abbiamodi solito usano meno del 50% confluenza delle cellule Vero per il saggio di placca, che, nella nostra esperienza, dimostra i migliori risultati per γHV68. Inoltre, un monostrato uniformemente distribuiti e appena fatto è altamente raccomandato per la precisione di conteggio placca. Mentre si effettua la diluizione seriale dei campioni di virus, la cautela deve essere presa per evitare bolle e puntali dovrebbe essere cambiato tra ogni titolazione. Per l&#39;alta titolati campioni di virus, diluizioni seriali di 10 volte sono raccomandati, altrimenti 2 - a diluizioni seriali di 5 volte vengono utilizzati. A differenza di infezione acuta in cui virus infettivo possono essere analizzati direttamente dalla targa capacità di formazione, latentemente infette tessuti / campioni di γ-HVS di solito non contengono virus rilevabile preformato infettive, invece, il DNA virale è mantenuto come episoma circolare con pochi geni espresse 6,7. In questo caso, il carico virale di latenza può essere determinata dalla frequenza di riattivazione ex vivo del virus da in vitrespianti o di cellule latentemente infette su una cultura permissiva cellula indicatore (es. cellule Vero) 8. A tal fine, la sospensione singola cellula di tessuti infetti è preparata, contati, e placcato su monostrati di cellule sensibili, che vengono poi sovrapposte con mezzo di placca test. In questo protocollo, abbiamo descritto come preparare sospensioni singola cella della milza per il saggio di IC per misurare la quantità di virus latente che ha la capacità di riattivare per milza o popolazione al di splenociti 4. Poiché solo una piccola popolazione di splenociti è latentemente infette, di solito si prepara seriale a bassa diluizioni di sospensione splenociti per i test titolo infettive. Estrema cautela deve essere presa durante l&#39;intera procedura al fine di evitare dure cellule pipettaggio o vortex. E &#39;importante notare che le cellule B espiantati da milza mostrano generalmente scarsa vitalità 9, che potrebbero influire sul rendimento di riattivazione ex vivo. Ogni gene che migliora la sopravvivenza di latenTLY cellule infettate potrebbe indirettamente favorire l&#39;efficienza della ex vivo riattivazione del virus. Rispetto ai test di formazione di placca e IC, qPCR fornisce un mezzo efficace per quantificare con precisione linfocitica γ-HVS in topi infettati 10. E &#39;particolarmente utile per un virus con scarsa capacità di formazione di placca grazie alla sua citotossicità minima per le cellule indicatore Vero o altro, e può essere applicata sia per i campioni acutamente e cronicamente infetti. Una curva standard è necessario e importante per quantificare con precisione genomi virali. Abbiamo sviluppato γHV68 curve standard basato sul ORF56 amplificazione genica, utilizzando un clone bacmid contenente il genoma γHV68 8. qPCR reazione è estremamente sensibile in grado di rilevare anche alcune copie di DNA virale per reazione qPCR, ben oltre i limiti del saggio della placca. Precauzioni devono però essere messe in atto per evitare la contaminazione incrociata tra campioni, mentre tra uninfectecampioni d, se necessario, controlli negativi per ogni reazione. La specificità della reazione qPCR può essere un problema serio in particolare per i campioni di tessuto infetto, poiché enorme quantità di DNA cellulare può influenzare il segnale di virus specifici per l&#39;amplificazione. Questo però può essere rilevato da analisi della curva di fusione per non specifici prodotti amplificati. Nel naturalmente infetti splenocyte popolazioni, la frequenza di γHV68-cuscinetto cellule possono essere molto basso. In questo scenario, come complemento per l&#39;analisi del DNA utilizzando qPCR quasispecie, limitando la diluizione-PCR (LD-PCR) fornisce un vantaggio alternativa per valutare la frequenza del genoma virale-cuscinetto cellule 11,12. In breve, γ-HVS-linfociti infettati sono serialmente diluiti. DNA estratto da queste cellule è quello di essere utilizzato per un test sensibile nested PCR, in grado di rilevare la presenza di singole copie di DNA virale in campioni individuali. Un&#39;analisi combinata di limitare la diluizione e qPCR rivelerà sia la frequenza di cellule latentemente infette e THe carico del DNA virale latente. In particolare, saggio IC non può essere utilizzato come uno stand-alone metodo per misurare il carico virale latente, a causa del fatto che non fa distinzione tra riduzione del carico virale latente rispetto a un fallimento del virus latente in sé per riattivare. Come ulteriore misura di latenza virale, qPCR viene utilizzato per valutare quantitativamente le copie di genoma virale nei tessuti infetti. Una correlazione tra genoma ridotto la carica virale e contagiosa centro titolo suggerirebbe un difetto di latenza del virus. Al contrario, una disparità tra gli alti carichi del genoma virale e titolo virale latente basso sostengono che, anche se il virus è in grado di mantenere un pool di DNA virale latente, non è in grado di riattivare in modo efficiente dalla latenza. In conclusione, i metodi descritti in questo protocollo anche applicabilità generale a herpesvirus diversi γHV68, per i quali la cellula bersaglio tipi virali e sequenze genomiche sono disponibili e permettono °valutazione e inequivocabile dei cicli di vita distinte in vivo. Può anche essere utilizzato per affrontare il ruolo biologico dei fattori di virulenza specifici nel contesto di infezione del mouse. Ad esempio, confrontando la replicazione di diversi virus Bcl-2 mutante γHV68 con quella di wild-type γHV68, il nostro recente lavoro 8 consente di determinare quale funzione di vBcl-2 (ad esempio l&#39;apoptosi, l&#39;autofagia, o entrambi) contribuisce alla in comportamento in vivo di questo virus a infezione acuta e cronica nel topo. Così, essi rappresentano anche importanti strumenti per sezionare il virus-ospite interazioni durante l&#39;infezione.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del materiale </td><td> Procedura di preparazione </td></tr><tr><td> Metilcellulosa (MC) mezzo di copertura per il dosaggio della placca virale </td><td><ol><li> Calore ~ ​​250 ml di acqua distillata in bottiglia TC&gt; 80 ° C (bollente per 3 minuti nel forno a microonde) </li><li> Aggiungere a poco a poco 2,5 g polvere MC in acqua riscaldata, mescolando a fuoco basso fino alla dissoluzione. </li><li> Autoclave subito per 15 minuti a ciclo liquido. </li><li> Mescolando i media MC sterilizzati in autoclave a 4 ° C per una notte. </li><li> Unire 250 ml MC media con 2 x 200ml MEM (Gibco-BRL) + 50 ml di FBS per dare 500 ml di sovrapposizione dei media. </li></ol></td></tr><tr><td> Fix / macchia medi per il dosaggio della placca </td><td> 0,2% (w / v) di cristallo viola in etanolo al 20%. </td></tr><tr><td> Lysis Buffer ACK </td><td> NH 4 Cl 0,15 m, KHCO 3 10mM, EDTA 0,1 mm </td></tr><tr><td> Completo DMEM </td><td> Medio Dulbecco modificato Eagle(DMEM) supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS, Invitrogen), 2 mM di L-glutamina e 1% penicillina-streptomicina (Gibco-BRL). </td></tr></tbody></table> Mezzi di tabella 1. Specifiche utilizzate in questo protocollo <table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Ketamina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> K2753 </td></tr><tr><td> Xylazina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X1251 </td></tr><tr><td> Metilcellulosa </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M0512-250g </td></tr><tr><td> 2 x MEM </td><td> Life Technologies </td><td> 11935 </td></tr><tr><td> Cellulare filtro </td><td> BD Faclon </td><td> 352340 </td></tr><tr><td> Omni tessuto omogeneizzatore </td><td> OMNI internazionale </td><td> TH115 </td></tr><tr><td> Sangue DNeasy e kit di tessuto </td><td> QIAgenerazione </td><td> 69504 </td></tr><tr><td> iQTM SYBRH Verde Supermix </td><td> BioRad </td><td> 170-8882 </td></tr><tr><td> CFX96 PCR in tempo reale del sistema </td><td> Bio-Rad </td><td> 184-5072 </td></tr><tr><td> Contatore di cellule </td><td> Bio-Rad </td><td> 145-0001 </td></tr><tr><td> Sorvall SA-600 </td><td> Thermo Scientific </td><td> 096-124022 </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Reagenti e attrezzature specifiche

measurement of &#947;hv68 infection in mice

Herpesvirus-γ (γ-HVS) si distinguono per la loro capacità di stabilire infezioni latenti di cellule linfoidi 1. La gamma ristretta di ospitare umano γ-HVS, come EBV e KSHV, ha gravemente ostacolato studi dettagliati patogeni. Murino γ-herpesvirus 68 (γHV68) azioni estese somiglianze genetiche e biologiche umane con γ-HVS ed è un patogeno naturale di roditori murid 2. Come tale, la valutazione di γHV68 infezione ceppi di topi inbred a diversi stadi di infezione virale fornisce un modello importante per la comprensione del ciclo di vita virale e la patogenesi durante γ-HVS infezione. Su inoculazione intranasale, γHV68 risultati infezione in viremia acuta nel polmone, che è poi risolto in una infezione latente di splenociti e di altre cellule, che può essere riattivato per tutta la vita dell&#39;ospite 3,4. In questo protocollo, descriveremo come utilizzare il test per valutare la placcatitolo s virus infettivo nel polmone omogenati su monostrati di cellule Vero in fase precoce (5 - 7 giorni) di post-infezione intranasale (dpi). Mentre l&#39;infezione acuta è in gran parte cancellato 2-3 postinfection settimane, una infezione latente di γHV68 è stabilito circa 14 dpi e mantenuto in seguito nella milza dei topi. Infezione latente di solito colpisce una popolazione molto piccola di cellule nei tessuti infetti, per cui il virus rimane inattivo e si spegne la maggior parte della sua espressione genica. Splenociti latentemente infette spontaneamente riattivare virus su espianto in colture di tessuti, che può essere riassunta da un centro infettivi (IC) test per determinare la carica virale latente. Per ulteriori stimare la quantità di copie del genoma virale nel acuta e / o tessuti latentemente infette, quantitativa real-time PCR (qPCR) è usato per la sua massima sensibilità e precisione. L&#39;analisi combinata dei risultati dei test qPCR e placca, e / o dosaggio IC rivelerà il profilo spazio-temporale del viralereplicazione e l&#39;infettività in vivo.

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Measurement of &#947;HV68 Infection in Mice

Herpesvirus-γ (γ-HVS) stabilisce per tutta la vita persistenza nel loro ospite. L&#39;infezione di topi con γ-HV68 offre una geneticamente trattabili<em&gt; In vivo</emModello&gt; per la caratterizzazione del ciclo di vita / patogenesi della γHVs. Questo protocollo descrive l&#39;individuazione e quantificazione dei γHV68 infezione in fase acuta e latente dopo l&#39;infezione con formazione di placca, centro infettive, e saggi qPCR.

Misura della γHV68 infezione nei topi

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human ...

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.5K Views.  University of Southern California, Los Angeles. Herpesvirus-γ (γ-HVS) stabilisce per tutta la vita persistenza nel loro ospite. L'infezione di topi con γ-HV68 offre una geneticamente trattabili In vivo per la caratterizzazione del ciclo di vita / patogenesi della γHVs. Questo protocollo descrive l'individuazione e quantificazione dei γHV68 infezione in fase acuta e latente dopo l'infezione con formazione di placca, centro infettive, e saggi qPCR.

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A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in the thymus proper vasculature formation and patterning is essential for thymocyte entry into the organ and mature T-cell exit to the periphery. The spatial arrangement of blood vessels in the thymus is dependent upon signals from the local microenvironment, namely thymic epithelial cells (TEC). Several recent reports suggest that disruption of these signals results in thymus blood vessel defects 1,2. Previous studies have described techniques used to label the neonatal and adult thymus vasculature 1,2. We demonstrate here a technique for labeling blood vessels in the embryonic thymus. This method combines the use of FITC-dextran or Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I (GSL 1 - isolectin B4) facial vein injections and CD31 antibody staining to identify thymus vascular structures and PDGFR-&beta; to label thymic perivascular mesenchyme 3-5. The option of using cryosections or vibratome sections is also provided. This protocol can be used to identify thymus vascular defects, which is critical for defining the roles of TEC-derived molecules in thymus blood vessel formation. As the method labels the entire vasculature, it can also be used to analyze the vascular networks in multiple organs and tissues throughout the embryo including skin and heart 6-10.

This article describes a method for labeling embryonic skin and thymus blood vessels.

Un metodo per l&#39;etichettatura vasi embrionali nei topi

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

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Immunologia e infezioni

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

Lymphatic vessels comprise a multifunctional transport system that maintains fluid homeostasis, delivers lipids to the central circulation, and acts as a surveillance system for potentially harmful antigens, optimizing mucosal immunity and adaptive immune responses1. Lymph is formed from interstitial fluid that enters blind-ended initial lymphatics, and then is transported against a pressure gradient in larger collecting lymphatics. Each collecting lymphatic is made up of a series of segments called lymphangions, separated by bicuspid valves that prevent backflow. Each lymphangion possesses a contractile cycle that propels lymph against a pressure gradient toward the central circulation2. This phasic contractile pattern is analogous to the cardiac cycle, with systolic and diastolic phases, and with a lower contraction frequency4. In addition, lymphatic smooth muscle generates tone and displays myogenic constriction and dilation in response to increases and decreases in luminal pressure, respectively5. A hybrid of molecular mechanisms that support both the phasic and tonic contractility of lymphatics are thus proposed.
Contraction of smooth muscle is generally regulated by the cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+]i) plus sensitivity to Ca2+, of the contractile elements in response to changes in the environment surrounding the cell6. [Ca2+]i is determined by the combination of the movement of Ca2+ through plasma membrane ligand or voltage gated Ca2+ channels and the release and uptake of Ca2+ from internal stores. Cytosolic Ca2+ binds to calmodulin and activates enzymes such as myosin light chain (MLC) kinase (MLCK), which in turn phosphorylates MLC leading to actin-myosin-mediated contraction8. However, the sensitivity of this pathway to Ca2+ can be regulated by the MLC phosphatase (MLCP)9. MLCP activity is regulated by Rho kinase (ROCK) and the myosin phosphatase inhibitor protein CPI-17.
Here, we present a method to evaluate changes in [Ca2+]i over time in isolated, perfused lymphatics in order to study Ca2+-dependent and Ca2+-sensitizing mechanisms of lymphatic smooth muscle contraction. Using isolated rat mesenteric collecting lymphatics we studied stretch-induced changes in [Ca2+]i and contractile activity. The isolated lymphatic model offers the advantage that pressure, flow, and the chemical composition of the bath solution can be tightly controlled. [Ca2+]i was determined by loading lymphatics with the ratiometric, Ca2+-binding dye Fura-2. These studies will provide a new approach to the broader problem of studying the different molecular mechanisms that regulate phasic contractions versus tonic constriction in lymphatic smooth muscle.

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

We introduce an approach to evaluate the cytosolic Ca2+ concentration in isolated lymphatics to study Ca2+-dependent and Ca2+-sensitizing mechanisms of lymphatic smooth muscle contraction.

Misura della Ca citosolico 2 + In isolati Linfatici contrattile

Lymphatic vessels comprise a multifunctional transport system that maintains fluid homeostasis, delivers lipids to the central circulation, and acts as a ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

This protocol outlines the steps required to longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging tomography with integrated &mu;CT (DLIT-&mu;CT) and the subsequent use of this data to generate a four dimensional (4D) movie of the infection cycle. To develop the 4D infection movies and to validate the DLIT-&mu;CT imaging for bacterial infection studies using an IVIS Spectrum CT, we used infection with bioluminescent C. rodentium, which causes self-limiting colitis in mice. In this protocol, we outline the infection of mice with bioluminescent C. rodentium and non-invasive monitoring of colonization by daily DLIT-&mu;CT imaging and bacterial enumeration from feces for 8 days.
The use of the IVIS Spectrum CT facilitates seamless co-registration of optical and &mu;CT scans using a single imaging platform. The low dose &mu;CT modality enables the imaging of mice at multiple time points during infection, providing detailed anatomical localization of bioluminescent bacterial foci in 3D without causing artifacts from the cumulative radiation. Importantly, the 4D movies of infected mice provide a powerful analytical tool to monitor bacterial colonization dynamics in vivo.

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Multi-modality imaging is a valuable approach for studying bacterial colonization in small animal models. This protocol outlines infection of mice with bioluminescent Citrobacter rodentium and the longitudinal monitoring of bacterial colonization using composite 3D diffuse light imaging tomography with &mu;CT imaging to create a 4D movie of C. rodentium infection.

4D imaging multimodale di<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infezioni in topi

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

Long Term cronica<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infezione delle vie aeree nei topi

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Measuring Local Anaphylaxis in Mice

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. Exposure to an allergen in a sensitized individual can result in clinical symptoms that vary from minor erythema to life threatening anaphylaxis. In the laboratory, various animal models have been developed to understand the mechanisms driving allergic responses. Herein, we describe a detailed method for measuring changes in vascular permeability to quantify localized allergic responses. The local anaphylaxis assay was first reported in the 1920s, and has been adapted from the technique published by Kojima et al. in 20071. In this assay, mice sensitized to OVA are challenged in the left ear with vehicle and in the right ear with OVA. This is followed by an intravenous injection of Evans Blue dye. Ten min after injecting Evans Blue, the animal is euthanized and the dye that has extravasated into the ears is extracted overnight in formamide. The absorbance of the extracted dye is then quantified with a spectrophotometer. This method reliably results in a visual and quantifiable manifestation of a local allergic response.

Allergic responses, characterized by the activation of mast cells and basophils, are driven by the cross-linking of IgE and release of proinflammatory mediators. A quantitative assessment of allergic responses can be achieved by using Evans Blue dye to monitor changes in vascular permeability after allergen challenge.

Misurare Anafilassi locali nei topi

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic yeast. Capsule size can vary widely between strains, has the ability to grow rapidly when introduced to stressful or low nutrient conditions, and has been positively correlated with strain virulence. For these reasons, the size of the capsule is of great interest to C. neoformans researchers. The growth of the C. neoformans capsule is induced during phenotypic testing to help understand the effects of different treatments on the yeast or size differences between strains. Here we describe one of the standard methods of capsule induction and compare two accepted methods of staining and measuring capsule diameter: (i) India ink, a negative stain, used in conjunction with conventional light microscopy and (ii) co-staining with fluorescent dyes of both the cell wall and capsule followed by confocal microscopy. Finally, we show how measurement of capsule diameter from India ink-stained samples can be automated using computational image analysis.

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule is the primary virulence factor in Cryptococcus neoformans, and its size correlates with strain virulence. Capsule diameter measurements are used in phenotypic testing and to gauge therapeutic efficacy. Here a standard method of capsule induction is presented, and two methods of staining and measuring diameter are compared.

Size Matters: Misurare il diametro di capsula in Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic ...

A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced saliva production. Similarly, saliva production is severely compromised in patients receiving radiation treatment for head and neck cancers. Rodent models, developed to mimic these clinical conditions, facilitate an understanding of the disease pathogenesis and allow for the development of new therapeutic strategies. Therefore, the ability to accurately, reproducibly, and repeatedly measure salivary gland function in animal models is critical. Building on procedures previously described in the literature, a method was developed that meets these criteria and was used to evaluate salivary gland function in mice. An additional advantage of this new method is that it is easily mastered, and has little inter-operator variation. Salivary gland function is evaluated as the amount (weight or volume) or rate (mL/min) of saliva produced in response to pilocarpine stimulation. The collected saliva is a good source for the analyses of protein content, immunoglobulin concentrations, and other biomolecules.

Salivary gland hypofunction is a frequent consequence of autoimmune disease and radiation therapy. Reproducible evaluation of salivary gland function in mouse models of these diseases is a technical challenge. Here, a simple method for accurate and reproducible measurement of saliva production in mice is described.

Un metodo per la misurazione della funzione della ghiandola salivaria in topi

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a formidable defense against invading pathogens via diverse mechanisms. One major goal of vaccination is to induce protective antigen-specific antibodies to prevent life-threatening infections. Both thymus-dependent (TD) and thymus-independent (TI) antigens can elicit robust antigen-specific IgM responses and can also induce the production of isotype-switched antibodies (IgG, IgA and IgE) as well as the generation of memory B cells with the help provided by antigen presenting cells (APCs). Here, we describe a protocol to characterize TD and TI Ig isotype responses in mice using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In this protocol, TD and TI Ig responses are elicited in mice by intraperitoneal (i.p.) immunization with hapten-conjugated model antigens TNP-KLH (in alum) and TNP-polysaccharide (in PBS), respectively. To induce TD memory response, a booster immunization of TNP-KLH in alum is given at 3 weeks after the first immunization with the same antigen/adjuvant. Mouse sera are harvested at different time points before and after immunization. Total serum Ig levels and TNP-specific antibodies are subsequently quantified using Ig isotype-specific Sandwich and indirect ELISA, respectively. In order to correctly quantify the serum concentration of each Ig isotype, the samples need to be appropriately diluted to fit within the linear range of the standard curves. Using this protocol, we have consistently obtained reliable results with high specificity and sensitivity. When used in combination with other complementary methods such as flow cytometry, in vitro culture of splenic B cells and immunohistochemical staining (IHC), this protocol will allow researchers to gain a comprehensive understanding of antibody responses in a given experimental setting.

In this paper, we describe a protocol to characterize T-dependent and T-independent immunoglobulin (Ig) isotype responses in mice using ELISA. This method used alone or in combination with flow cytometry will allow researchers to identify differences in B cell-mediated Ig isotype responses in mice following T-dependent and T-independent antigen immunization.

Caratterizzazione delle risposte di isotipo dell'immunoglobulina timo-dipendenti e indipendenti del timo in topi usando l'analisi enzima-collegata dell'immunosorbente

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

Misurazione di High-throughput di membrana plasmatica risigillazione efficienza in cellule di mammifero

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Valutazione delle risposte ospite-patogeno e l'efficacia del vaccino nei topi

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Misura della γHV68 infezione nei topi

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Un metodo per l'etichettatura vasi embrionali nei topi

Misura della Ca citosolico^{2 +} In isolati Linfatici contrattile

4D imaging multimodale di

Long Term cronica