1. Protocollo da utilizzare Multi-fiasche per colture cellulari <ol><li> Preparazione dei vasi e l&#39;aggiunta di sospensione cellulare <ol><li> Preparare la crescita media delle cellule, se necessario. </li><li> Line up multi-Flask verticalmente su un lato con il tappo rivolto verso l&#39;alto sul piano di lavoro (cappa a flusso laminare sterile). <ol><li> Questi contenitori sono disponibili in 3 e 5 strati formati e utilizzare un simile flusso di lavoro come un modello T-175 pallone. </li></ol></li><li> Allentare e rimuovere i tappi. Aggiungi quantità richiesta di pre-riscaldato mezzo in fiasco con una pipetta da 50 o 100 ml o per infusione. <ol><li> Pipette che sono ≤ 10 ml può raggiungere il fondo del recipiente in cui Multi-fiasche sono posti verticalmente con tappo rivolto verso l&#39;alto. Pipette ≥ 10 ml può raggiungere in nave subito dopo il logo sul Multi-Flask, fornendo così un portale comodo per creare maggiori volumi di supporti per nave. </li></ol></li><li> Per evitare bolle di media, permettono flusso di liquido di flow lungo la parete interna della Multi-Flask coperchio (logo-side). </li><li> Aggiungi sospensione cellulare da uno stock di cellule concentrate in terreno di crescita attraverso lo strato superiore con una pipetta 10 ml e fiaschi cap. Suggerimenti: - Trasporto Multi-fusti a un carrello al sito incubatore ed eseguire passaggi rimanenti. - La densità di semina delle cellule varia a seconda del tipo di cellula, medio e durata bisogno di cultura. Iniziare con la densità di semina e il volume dei media a quello usato nello standard T-175 palloni e moltiplicare per 3 o 5 a seconda della Multi-Flask formato utilizzato. </li></ol></li><li> Miscelazione di cellule <ol><li> Mix posizione: Tenere il Multi-Flask verticale con il logo rivolto verso di voi e girare in senso antiorario ad un angolo di 45 ° con porta mix rivolto verso l&#39;alto. </li><li> Tenendo lo stesso angolo, leggermente inclinare Multi-Flask da davanti a dietro (collo lontano da voi) fino liquido nello strato superiore scarichi completamente downwards attraverso la porta mix. Perno sul mix di babordo. </li><li> Allo stesso modo, dolcemente rocce multi-Flask da dietro in avanti (collo verso di voi) fino a metà scarichi completamente dallo strato basso verso l&#39;alto attraverso la porta mix. Ripetere i punti 1.2.2 e 1.2.3 ancora una volta per garantire la corretta miscelazione. </li><li> Portare Multi-Flask in posizione mix (Fase 1.2.1) e passare al punto 1,3 </li><li> In alternativa, la sospensione di cellule possono essere preparati esternamente dalla Multi-Flask e la sospensione cellulare possono essere aggiunti alla nave usando una pipetta o da dolci versando. <ol><li> Porto mix permette in-vaso di miscelazione delle cellule con i media ed elimina la necessità di fare grandi volumi di sospensioni cellulari esternamente. </li><li> Consente inoltre l&#39;equalizzazione dei media attraverso gli strati della Multi-Flask </li></ol></li></ol></li><li> Equilibrio del fluido <ol><li> Dopo la miscelazione / aggiunta di sospensione cellulare, luogo multi-Flask in verticale su una superficie di lavoro piana per pareggiare il volume liquido equazionelly in tutti gli strati. </li></ol></li><li> Liquido partizione in ogni strato <ol><li> Tenere premuto il Multi-Flask con il logo rivolto verso l&#39;alto e ruotare in senso orario ad un angolo di 45 ° per partizionare il liquido in ogni livello. Suggerimento: - Per ottenere i migliori risultati, è importante utilizzare una superficie piana di lavoro per i passaggi 1,3-1,4 </li></ol></li><li> Trasporti <ol><li> Una volta che i supporti contenenti sospensione cellulare viene partizionato, il trasporto multi-Flask allo stesso angolo di 45 ° (in senso orario) come al punto 1.4.1 con il supporto di distanza dal porto mix in incubatrice. Questa posizione è adatta anche quando si rimuove fiaschi da incubatore per la visualizzazione su un microscopio. </li></ol></li><li> Posizionamento Multi-Flask su incubatore scaffale <ol><li> Tenendo Multi-Flask al 45 ° (in senso orario, lontano dal mix-port), ruotare delicatamente verso il basso orizzontalmente sulla superficie incubatore (utilizzando l&#39;angolo lontano dalla porta come un mixpivot). Lay Multi-Fiasca con il logo rivolto verso l&#39;alto. <ol><li> Falcon Multi-Flask progettazione consente ai pescherecci di essere impilati e li tiene in posizione da una nervatura robusta accatastamento. </li></ol></li></ol></li><li> Distribuzione di cellule e reagenti <ol><li> Dopo aver posizionato Multi-Flask piatta sulla superficie di lavoro, dolcemente dondolare avanti e indietro e da lato a lato per distribuire le cellule in modo uniforme su superfici cultura facendo attenzione a non versare liquidi di ogni strato. Stack fiaschi. <ol><li> Questo Flask è fatta di materiale otticamente trasparente e celle l&#39;ultimo strato possono essere facilmente visualizzati su un microscopio. </li></ol></li></ol></li><li> Mezzi di scambio <ol><li> Aspirare mentre inclinando il Multi-Flask a sinistra (mix porta-side) con il logo rivolto verso l&#39;alto. </li><li> Poi inclinazione, il Multi-Flask a destra, continuando ad aspirare tutti i media residua. </li><li> Aggiungi quantità appropriata di media e seguire i punti da 1,3-1,7 </li></ol></li></ol> 2.La raccolta delle cellule da Multi-fiasche <ol><li> Dissociare le cellule, in fila Multi-Flasks verticale e portare a ciascuno di Mix posizione (punto 1.2.1). Capovolgere delicatamente palloni con il collo rivolto verso di voi in modo da consentire ai media di scarico per lo strato superiore della Multi-Flask. </li><li> Inserire una punta di 5 o 10 ml aspirare attraverso il collo fino a raggiungere il livello del liquido nei pressi del porto mix. Aspirare il terreno esausto. </li><li> Aggiungi dissociazione reagente / tampone di lavaggio e portare a Mix posizione come nel passo 1.2.1, quindi procedere e seguire i passaggi 1,3-1,7. Neutralizzare con mezzo di crescita / neutralizzazione e versare sospensione di cellule in una provetta di ricezione o invertire fiasco tale che le cellule di scarico per lo strato superiore della nave e raccogliere le cellule con una pipetta 10 ml. Suggerimento: per favorirne il recupero di cellule o reagenti, portare Multi-pallone per mescolarne posizione (punto 1.2.1), invertire con il collo verso l&#39;operatore per permettere il drenaggio completo dei media da al<html> strati l per lo strato superiore. Poi, inclinazione Multi-Flask in senso orario per angolo di 45 ° (lontano dal porto mix), mentre il Multi-Flask rimane invertita. Utilizzare una pipetta (1-10 ml) per raccogliere tutti i reagenti rimasti. </li></ol> 3. Consigliato volume di lavoro in Falcon Multi-fiasche La crescita dei media 3-Layer: 75-150 ml per Multi-Flask 5-Layer: 125-250 mL per Multi-Flask Dissociazione agente 3-Layer: ≥ 15 ml per ogni Multi-Flask 5-Layer: ≥ 25 ml per Multi-Flask Suggerimento: Inizia con volume medio usato in standard T-175 palloni e moltiplicare per 3 o 5 volte a seconda della multi-formato Flask valutata in modo che mL per unità di superficie rimane la stessa. 4. Rappresentante dei risultati: 1. Disegno di Falcon Multi-Flask files/ftp_upload/3418/3418fig1.jpg &quot;/&gt; . Figura 1: Multi-Flask vasi coltura cellulare sono disponibili in 3 - e 5-strato formato stackable di scale-up delle cellule fornendo 525 e 875 cm 2 di superficie di crescita, rispettivamente. Pipetta di accesso facilita aggiunta e la rimozione delle cellule e reagenti in e fuori della nave. Presenza di mix-port consente una rapida in-vaso di miscelazione ed equalizzazione dei media in tutti gli strati della Multi-Flask. 2. Yield cellulare con Multi-Flask: Questi vasi sono disponibili in 3 strati e 5 strati formati che corrispondono a 3 e 5 volte la superficie di T-175 fiaschi. Di conseguenza, ≥ 3 e 5 volte (130 ± 6,8 x 10 6 e 218 ± 23,6 x 10 6 cellule, rispettivamente) il numero di BHK-21 (bambino renali di criceto), le cellule sono state coltivate e recuperati da Multi-Flask rispetto al T-175 fiaschi (43,2 ± 3,5 x 10 6 cellule; Fig.2a). Produzione di cellule per usuperficie nit era equivalente a 3 - e 5-layer multi-Palloni e T-175 palloni per BHK-21, LNCaP (adenocarcinoma prostatico umano linea cellulare), Hep-G2 (linea di cellule di epatocarcinoma umano), Ecopack 2-293 (umano linea cellulare di rene) in coltura per un periodo di 48-96h (Fig.2b) in terreni di coltura (35 ml per strato), come raccomandato dal fornitore cellulare (ATCC, Sigma e / o Clontech). Le cellule sono state elencate in un sistema automatizzato Vi-CELL contatore (1). <img alt="Figura 2A" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig2A.jpg" /> Figura 2A: tre e cinque volte il numero di cellule BHK-21 sono stati coltivati ​​e recuperati da 3 - e 5-strato Multi-fiasche rispetto al T-175 fiaschi. Rendimento atteso è stata determinata utilizzando rendimenti medi dal controllo delle cellule T-175 fiaschi moltiplicato per tre volte e cinque per il 3 - e 5-strato Multi-fiasche rispettivamente (n = 4 flaconi / formato). <img alt="Figura 2B" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig2B.jpg" /><br/ Figura&gt; 2B: resa celle per cm 2 è stato equivalente a 3 - e 5-layer multi-Palloni e T-175 palloni per BHK-21, LNCaP, HepG2 e EcoPack2-293 cellule. Ogni barra rappresenta la media di 4-6 fiaschi. BHK-21 (11.000 cells/cm2) sono state coltivate per 72 ore, le cellule LNCaP (20.000 cells/cm2) e EcoPack2-293 cellule (~ 35.000 cells/cm2) sono state coltivate per 96 ore e cellule HepG2 (25.000 cellule / cm 2 ) sono state coltivate per 48 ore prima del raccolto. 3. Distribuzione media tra strati di multi-Flask Terreno di coltura cellulare (DMEM, Invitrogen) è stato aggiunto a 5 strati multi-Palloni (250 nave mL/5-layer) e suddiviso in strati secondo il protocollo sopra descritto. Distribuzione dei media è stata misurata mediante fori in ogni strato e media pompato fuori da singoli livelli. Peso del liquido recuperato da ogni strato è risultata essere relativamente uniforme da un livello all&#39;altro come mostrato in Fig. 3. Essi sono i seguenti: 510,8 ± 0,73, 50,3 ± 0,58, 50,21 ± 0,13, 49,88 ± 0,35, 49,45 ± 0,37 (gm). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig3.jpg" /> Figura 3. Uniforme distribuzione dei media in ciascuno dei cinque strati di un 5-strato Multi-Flask. Terreno di coltura cellulare è stato aggiunto al Multi-Palloni (250 nave ml/5-layer), equilibrato e diviso per singoli livelli. Il supporto è stato pompato fuori attraverso fori praticati nei singoli strati e il peso del liquido è stato registrato da ogni strato (n = 6 bottiglie). 4. Distribuzione tra gli strati di celle multi-Flask Le celle possono essere aggiunti e mescolati all&#39;interno del Multi-Flask. Abbiamo simulato la distribuzione di cellule tra gli strati di multi-Flask utilizzando perline (10μm; Polysciences Inc.) di dimensioni simili a celle. Sospensione tallone è stato aggiunto in Multi-Flask nave con una pipetta 10 ml attraverso lo strato superiore e mescolato con i media nel vaso come discribed nel protocollo di cui sopra. Distribuzione tallone è stata misurata mediante fori in ogni strato e fluido contenente sospensione tallone è stata pompata fuori dai singoli livelli. Concentrazione tallone recuperato da ogni strato è stato letto su un contatore Coulter e registrati. Qui sotto sono equivalenti distribuzioni tallone inter-strato a 3 strati multi-Palloni (Fig.4A). Il mix-porta consente una distribuzione omogenea di cellule e reagenti tra Flask multi-strati. <img alt="Figura 4A" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig4A.jpg" /> Figura 4A: Bead distribuzione in ognuno dei tre strati di un 3-strato Multi-Flask. Una sospensione di perline (3,6 x10 6 / ml) è stato aggiunto al medio erogato in Multi-Palloni (sospensione perle: il volume dei media è di 1:10, vol: vol) e misti, seguiti da fasi di separazione e di equilibrio utilizzando il protocollo descritto. Concentrazione tallone recuperato da ogni strato (medio pompato attraverso fori praticati su ogni livello) è stata letta su un conte Coulterer e registrati. Qui sotto sono equivalenti distribuzioni tallone inter-layer 3 - strato Multi-Palloni (n = 5 palloni) Mostrate di seguito sono immagini rappresentative di Ecopack 2-293 pattern di colorazione delle cellule cresciute a confluenza&gt; 80% sul 3-strati multi-fiasche in terreni di coltura integrata. Monostrati cellulari sono stati fissati e colorati con cristallo viola e multi-Flask strati sono stati poi tagliati e immagini digitalizzate (2). Nota, patterning cellulare è stata omogenea su tutti i livelli di Multi-Flask (Fig.4b). Risultati simili sono stati ottenuti con più tipi di cellule valutato (dati non riportati). <img alt="Figura 4B" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig4B.jpg" /> Figura 4B: Questa figura illustra la crescita omogenea delle cellule tra gli strati di multi-fiaschi. Ecopack-2-293 cellule cresciute a confluenza&gt; 80% in 3-strati multi-Palloni e T-175 sono state fissate e colorate con violetto cristallo. Multi-Flask navi sono state tagliate e ogni strato colorato è stato scansionato. 5 Alimentazione aria in Multi-Flask.: Analisi dei mezzi di comunicazione speso utilizzando BioProfile FLEX analizzatore (3,4) (Nova Biomedical) da EcoPack2-293 cellule in coltura per 96 ore hanno rivelato alcuna differenza di saturazione dell&#39;aria di cellule cresciute in 5 strati multi-fiasche vs T-175 flaconi (81,03 ± 1,9 vs 83,4 ± 5,8% ambient O 2). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig5.jpg" /> Figura 5: Aria di saturazione (% ambient O 2) di media spesi erano simili in pre-mixed media da 5 strati multi-fiasche vs T-175 fiaschi. EcoPack2-293 cellule sono state seminate ad una densità di 35.000 cellule / cm 2 e coltivate per 96 ore prima analisi dei media (n = 3 palloni).

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	<li>Szabo, S. E., Monroe, S. L., Fiorino, S., Bitzan, J., Loper, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+an+automated+instrument+for+viability+and+concentration+mesurements+of+cryopreserved+hematopoietic+cells.">Evaluation of an automated instrument for viability and concentration mesurements of cryopreserved hematopoietic cells.</a> Lab. Hematol. 10, 109-109 (2004).</li><li>Bonnekoh, B., Wevers, A., Jugert, F., Merk, H., Mahrle, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+growth+assay+for+epidermal+cell+cultures+by+their+crystal+violet+binding+capacity.">Colorimetric growth assay for epidermal cell cultures by their crystal violet binding capacity.</a> Arch. Dermatol. Res. 281, 487-487 (1989).</li><li>Sengupta, N., Rose, S. T., Morgan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Flux+analysis+of+CHO+cell+metabolism+in+the+late+non-growth+phase.">Metabolic Flux analysis of CHO cell metabolism in the late non-growth phase.</a> Biotechnol. Bioeng. 108, 83-83 (2010).</li><li>Zhu, M. M., Goyal, A., Rank, D. L., Gupta, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+elevated+pCO2+and+osmolality+on+growth+of+cells+and+production+of+antibody&#x2013;fusion+protein+B1:+a+case+study.">Effects of elevated pCO2 and osmolality on growth of cells and production of antibody&#x2013;fusion protein B1: a case study.</a> Biotechnol. Prog. 21, (2005).</li><li>Ryan, J. M., Sharf, B. B., Cristofalo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+culture+medium+volume+on+cell+density+and+life-span+of+human+diploid+fibroblasts.">The influence of culture medium volume on cell density and life-span of human diploid fibroblasts.</a> Exp Cell Res. 91, 389-389 (2004).</li><li>Flaherty, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tips and Techniques for enhancing your cell culture. , (2009).</li><li>Sanyal, S., Abraham, E. J., Slater, K., Cai, A., Lacey, B., Hartshorn, C., Flaherty, P., McHugh, B., Qian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Scaling up cells in BD Falcon Cell Culture Multi-Flasks. , (2011).</li><li>DiPersio, C. M., Jackson, D. A., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+coordinately+modulates+liver+transcription+factors+and+hepatocyte+morphology.">The extracellular matrix coordinately modulates liver transcription factors and hepatocyte morphology.</a> Mol. Cell. Biol. 11, 4405-4405 (1991).</li><li>Grose, R., Hutter, C., Bloch, W., Thorey, I., Watt, F. M., Fassler, R., Brakebusch, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+crucial+role+of+&#x03B2;1+integrins+for+keratinocyte+migration+in+vitro+and+during+cutaneous+wound+repair.">A crucial role of &#x03B2;1 integrins for keratinocyte migration in vitro and during cutaneous wound repair.</a> Dev. 129, 2303-2303 (2002).</li></ol>

Tutti gli autori sono dipendenti di Becton Dickinson, Segmento Biosciences, Discovery unità mediche di laboratorio.

Lo studio attuale dimostra l&#39;aumento di produttività che di design Multi-Flask offre ai ricercatori. Mentre è importante seguire la procedura descritta in precedenza per ottenere prestazioni ottimali durante l&#39;utilizzo multi-Palloni, ci sono pochi passaggi critici in questo protocollo che sono ritenute più essenziali. Questi includono (i) la miscelazione di cellule e reagenti mediante la porta miscela all&#39;interno del serbatoio (ii) il trasporto multi-pallone in un angolo di 45 ° in senso orario dopo il partizionamento del fluido in ciascuno dei livelli (iii) che multi-Flask messaggio piatto partizionamento in incubatrice. L&#39;uso corretto di Multi-Flask porta alla produzione di una popolazione di cellule omogenee all&#39;interno di ciascuna nave che viene colto in un ambiente che è congruente al T-175 palloni (5). Questi vasi forniscono cellule 3 e 5 volte di più in un ingombro simile a quella del T-175 pallone. La nave 3 e 5 strati fornisce 525 e 875 centimetri 2 di area di crescita, rispettivamente, e offrono spazio e del lavoro savings agli utenti. Cultura trattamento del tessuto di superficie è paragonabile a fiaschi di serie consentendo così di scale-up senza la necessità di ri-ottimizzazione delle condizioni di coltura esistente o compromettere la qualità, omogeneità o prestazioni delle celle (6, 7). Questo prevede anche la comparabilità con i dati precedentemente raccolti. Questi vasi possono essere anche rivestiti con i reagenti come il collagene, fibronectina, poli-D-lisina per fornire un substrato specializzata per l&#39;attacco, la crescita e la differenziazione di alcuni tipi di cellule come gli epatociti 8, kertainocytes 9, le cellule staminali coltivate in serum-free dei media formulazioni. Soluzioni di rivestimento può essere rimosso con un minimo di ritenzione di liquido residuo in modo da ridurre lo spreco di reagenti preziosi così come la rimozione efficace di soluzione di rivestimento prima della coltura delle cellule. La raccomandata volume ottimale dei media per le cellule in cultura multi-fiaschi gamma ,142-0,287 ml / cm 2, che si traducono in 25-50 ml per strato. A differenza di un altro fiasco multistrato, til suo prodotto offre un mix-porto la nave, che consente una rapida in-vaso di miscelazione e distribuzione uniforme delle cellule e reagenti all&#39;interno e tra gli strati di ogni nave. Diverse linee cellulari, colture primarie e cellule staminali sono stati scalati in modo efficiente utilizzando Multi-fiaschi. Questi vasi sono particolarmente vantaggiosa in applicazioni che richiedono un gran numero di tali cellule come in high throughput screening, produzione di vaccini, trasfezioni vettori virali e terapia cellulare. Risparmio di tempo, spazio, lavoro e produzione di rifiuti ridotti sono vincite chiave del Multi-Flask contro le culture tradizionali in monostrato navi. Siamo in grado di cultura circa tre volte il numero di cellule raccolte da 5, T-175 palloni nello stesso spazio con 3, 5-strato Multi-fiaschi. Questo vantaggio in risparmio di spazio non si limita solo al T-175, ma può essere esteso anche alle altre navi: una norma apparato bottiglia a rulli che si inserisce in case comuni incubatori di laboratorio ~ 4 rolbottiglie ler (2200 ml) ciascuna delle quali fornisce 850 centimetri 2 di superficie. Nella stessa zona, ~ 20, a 5 strati multi-fiasche possono essere alloggiati fornendo così a cinque volte la superficie di crescita per le cellule della cultura. Inoltre, con un aumento della consapevolezza &quot;Go-Green&quot;, le opzioni per ridurre la produzione di rifiuti è altamente auspicabile. A tal proposito, c&#39;è un 38% (5, T-175 palloni pesano ~ 640g, mentre uno, a 5 strati multi-Flask ~ pesa 400g) diminuzione della produzione di rifiuti usando Multi-fiasche rispetto al T-175 palloni e questi vantaggi portano a diminuire in stoccaggio dei rifiuti ei costi di smaltimento e di tradursi in un risparmio economico per l&#39;utente.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / attrezzature </td><td> Azienda </td><td> Catalogo # </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> 3-strato di tessuto Cultura trattati con 525 centimetri 2 </td><td> BD Biosciences </td><td> 353143 </td><td rowspan="21"> <a href="http://www.bdbiosciences.com/cellculture/multiflasks/index.jsp">BD Biosciences Colture Cellulari - BD Falcon Multi-fiasche</a> </td></tr><tr><td> 5-strato di tessuto Cultura trattati con 875 centimetri 2 </td><td> BD Biosciences </td><td> 353144 </td></tr><tr><td> 100ml pipetta </td><td> BD Biosciences </td><td> 357600 </td></tr><tr><td> 10 ml pipetta </td><td> BD Biosciences </td><td> 357551 </td></tr><tr><td> 5 ml aspirazione pipetta </td><td> BD Biosciences </td><td&gt; 357501 </td></tr><tr><td> 50 ml di tubo in polipropilene conica </td><td> BD Biosciences </td><td> 352070 </td></tr><tr><td> T-175 fiasco Tissue Culture-trattati </td><td> BD Biosciences </td><td> 353028 </td></tr><tr><td> Grammo di cristallo viola </td><td> BD </td><td> 212525 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11885 </td></tr><tr><td> GMEM </td><td> Sigma </td><td> G5154 </td></tr><tr><td> RPMI-1640 </td><td> ATCC </td><td> 30-2001 </td></tr><tr><td> MEM </td><td> ATCC </td><td> 30-2003 </td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA </td><td> Lonza </td><td> CC-5012 </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino </td><td> Invitrogen </td><td> 16000-044 </td></tr><tr><td> Triptosio fosfato brodo </td><td> Sigma </td><td> T8159 </td&gt; </tr><tr><td> BHK-21 </td><td> Sigma </td><td> 85011433 </td></tr><tr><td> Hep-G2, LNCaP </td><td> ATCC </td><td></td></tr><tr><td> Ecopack 2-293 </td><td> Clontech </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldeide </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 15710 </td></tr><tr><td> Polistirolo Bead </td><td> Polysciences Inc. </td><td> 24628-20 </td></tr><tr><td> Bio-Flex Profile Analyzer </td><td> Nova Biomedical </td><td></td></tr></tbody></table>

scale-up of mammalian cell culture using a new multilayered flask

Un numero crescente di cellulari basati su applicazioni richiedono un gran numero di cellule. L&#39;utilizzo di singolo strato T-boccette, che sono adeguati durante l&#39;espansione di piccole dimensioni, può diventare ingombrante, laborioso e richiede molto tempo quando un gran numero di cellule sono obbligatori. Per rispondere a questa esigenza, le prestazioni di un nuovo multi-layered nave coltura cellulare per facilitare la scala facile da cellule stratificate da sola T-palloni saranno discussi. I palloni testati sono disponibili in 3 - e 5-strato formato e consentire il recupero della cultura e completo di tre e cinque volte il numero di cellule, rispettivamente, rispetto al T-175 fiaschi. Una caratteristica fondamentale del BD Multi-Flask è un mix / equilibrio porta che permette una rapida in-vaso di miscelazione e distribuzione uniforme delle cellule e reagenti all&#39;interno e tra gli strati di ogni nave e produrre cellule che possono essere coltivate in un ambiente che è congruente al T-175 fiaschi. Il design di questi multi-fiasche consente inoltre di caccesso pipetta onvenient per l&#39;aggiunta di reagenti e le cellule direttamente nelle fiasche e recupero efficiente di cellule preziose e reagenti e riduce il rischio di contaminazione a causa della colata. Per le applicazioni dove è preferibile versare sopra pipettaggio, il design permette di minima ritenzione di liquidi residui in modo da ridurre gli sprechi di preziose cellule e reagenti.

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Scale-Up of Mammalian Cell Culture using a New Multilayered Flask

Cellule svolgono un ruolo fondamentale e crescente nella ricerca, e la scoperta e lo sviluppo di nuove terapie. Grazie a questa crescente necessità di un maggior numero di cellule abbiamo bisogno di modi più efficienti ed efficaci per la coltivazione e la raccolta delle cellule attaccamento dipendente. Un fiasco multistrato con le giuste caratteristiche può servire a questo scopo.

Scale-up di colture cellulari di mammifero utilizzando un pallone nuovo multistrato

A growing number of cell-based applications require large numbers of cells. Usage of single layer T-flasks, that are adequate during small-scale ...

scale-up-of-mammalian-cell-culture-using-a-new-multilayered-flask

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

37.5K Views.  BD Biosciences. Cellule svolgono un ruolo fondamentale e crescente nella ricerca, e la scoperta e lo sviluppo di nuove terapie. Grazie a questa crescente necessità di un maggior numero di cellule abbiamo bisogno di modi più efficienti ed efficaci per la coltivazione e la raccolta delle cellule attaccamento dipendente. Un fiasco multistrato con le giuste caratteristiche può servire a questo scopo.

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Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System

Continued advancement in pluripotent stem cell culture is closing the gap between bench and bedside for using these cells in regenerative medicine, drug discovery and safety testing. In order to produce stem cell derived biopharmaceutics and cells for tissue engineering and transplantation, a cost-effective cell-manufacturing technology is essential. Maintenance of pluripotency and stable performance of cells in downstream applications (e.g., cell differentiation) over time is paramount to large scale cell production. Yet that can be difficult to achieve especially if cells are cultured manually where the operator can introduce significant variability as well as be prohibitively expensive to scale-up. To enable high-throughput, large-scale stem cell production and remove operator influence novel stem cell culture protocols using a bench-top multi-channel liquid handling robot were developed that require minimal technician involvement or experience. With these protocols human induced pluripotent stem cells (iPSCs) were cultured in feeder-free conditions directly from a frozen stock and maintained in 96-well plates. Depending on cell line and desired scale-up rate, the operator can easily determine when to passage based on a series of images showing the optimal colony densities for splitting. Then the necessary reagents are prepared to perform a colony split to new plates without a centrifugation step. After 20 passages (~3 months), two iPSC lines maintained stable karyotypes, expressed stem cell markers, and differentiated into cardiomyocytes with high efficiency. The system can perform subsequent high-throughput screening of new differentiation protocols or genetic manipulation designed for 96-well plates. This technology will reduce the labor and technical burden to produce large numbers of identical stem cells for a myriad of applications.

The protocols described allow laboratories to perform scalable, adherent stem cell culture in high throughput with minimal labor, experience and equipment investment cost using a programmable liquid handling robot and 96-well plates. iPSCs passaged more than 20 times on this system maintained pluripotency, normal karyotypes and differentiated into cardiomyocytes.

Scalabile piastra a 96 pozzetti Based iPSC cultura e di produzione utilizzando un sistema robotico Liquid Handling

Continued advancement in pluripotent stem cell culture is closing the gap between bench and bedside for using these cells in regenerative medicine, drug ...

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Biologia dello sviluppo

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in vitro analysis are well suited to study of large numbers of cells (&ge;105) in milliliter-scale volumes (&ge;0.1 ml). However, there are many instances in which it is necessary or desirable to scale down culture size to reduce consumption of the cells of interest and/or reagents required for their culture, stimulation, or processing. Unfortunately, conventional approaches do not support precise and reproducible manipulation of micro-scale cultures, and the microfluidics-based automated systems currently available are too complex and specialized for routine use by most laboratories. To address this problem, we have developed a simple and versatile technology platform for automated culture, stimulation, and recovery of small populations of cells (100 - 2,000 cells) in micro-scale volumes (1 - 20 &mu;l). The platform consists of a set of fibronectin-coated microcapillaries ("cell perfusion chambers"), within which micro-scale cultures are established, maintained, and stimulated; a digital microfluidics (DMF) device outfitted with "transfer" microcapillaries ("central hub"), which routes cells and reagents to and from the perfusion chambers; a high-precision syringe pump, which powers transport of materials between the perfusion chambers and the central hub; and an electronic interface that provides control over transport of materials, which is coordinated and automated via pre-determined scripts. As an example, we used the platform to facilitate study of transcriptional responses elicited in immune cells upon challenge with bacteria. Use of the platform enabled us to reduce consumption of cells and reagents, minimize experiment-to-experiment variability, and re-direct hands-on labor. Given the advantages that it confers, as well as its accessibility and versatility, our platform should find use in a wide variety of laboratories and applications, and prove especially useful in facilitating analysis of cells and stimuli that are available in only limited quantities.

We have developed an automated cell culture and interrogation platform for micro-scale cell stimulation experiments. The platform offers simple, versatile, and precise control in cultivating and stimulating small populations of cells, and recovering lysates for molecular analyses. The platform is well suited to studies that use precious cells and/or reagents.

Una piattaforma automatizzata versatile per micro-scala Cellulari esperimenti di stimolazione

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

Bioingegneria

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor&#8217;s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.

Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.

La coltivazione di cellule di mammifero utilizzando un singolo-uso del sistema pneumatico Bioreattore

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

Regolamento nutrienti alimentando in continuo per l&#39;espansione su larga scala di cellule di mammifero in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Una piattaforma Microfluidic per l&#39;isolamento Single-cell high-throughput e cultura

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Human Mesenchymal Stem Cell Processing for Clinical Applications Using a Closed Semi-Automated Workflow

Human mesenchymal stem cells (hMSCs) are currently being explored as a promising cell-based therapeutic modality for various diseases, with more market approvals for clinical use expected over the next few years. To facilitate this transition, addressing the bottlenecks of scale, lot-to-lot reproducibility, cost, regulatory compliance, and quality control is critical. These challenges can be addressed by closing the process and adopting automated manufacturing platforms. In this study, we developed a closed and semi-automated process for passaging and harvesting Wharton's jelly (WJ)-derived hMSCs (WJ-hMSCs) from multi-layered flasks using counterflow centrifugation. The WJ-hMSCs were expanded using regulatory compliant serum-free xeno-free (SFM XF) medium, and they showed comparable cell proliferation (population doubling) and morphology to WJ-hMSCs expanded in classic serum-containing media. Our closed semi-automated harvesting protocol demonstrated high cell recovery (~98%) and viability (~99%). The cells washed and concentrated using counterflow centrifugation maintained WJ-hMSC surface marker expression, colony-forming units (CFU-F), trilineage differentiation potential, and cytokine secretion profiles. The semi-automated cell harvesting protocol developed in the study can be easily applied for the small- to medium-scale processing of various adherent and suspension cells by directly connecting to different cell expansion platforms to perform volume reduction, washing, and harvesting with a low output volume.

Here, we present a protocol to harvest adherent cells from multi-layered flasks in a closed semi-automated manner using a counterflow centrifugation system. This protocol can be applied for harvesting both adherent and suspension cells from other cell expansion platforms with few modifications to the existing steps.

Elaborazione di cellule staminali mesenchimali umane per applicazioni cliniche utilizzando un flusso di lavoro semi-automatizzato chiuso

Human mesenchymal stem cells (hMSCs) are currently being explored as a promising cell-based therapeutic modality for various diseases, with more market ...

Biochimica

Preparation and Structural Evaluation of Epithelial Cell Monolayers in a Physiologically Sized Microfluidic Culture Device

In vitro microfluidic experimentation holds great potential to reveal many insights into the microphysiological phenomena occurring in conditions such as acute respiratory distress syndrome (ARDS) and ventilator-induced lung injury (VILI). However, studies in microfluidic channels with dimensions physiologically relevant to the terminal bronchioles of the human lung currently face several challenges, especially due to difficulties in establishing appropriate cell culture conditions, including media flow rates, within a given culture environment. The presented protocol describes an image-based approach to evaluate the structure of NCI-H441 human lung epithelial cells cultured in an oxygen-impermeable microfluidic channel with dimensions physiologically relevant to the terminal bronchioles of the human lung. Using phalloidin-based filamentous-actin staining, the cytoskeletal structures of the cells are revealed by confocal laser scanning microscopy, allowing for the visualization of individual as well as layered cells. Subsequent quantification determines whether the cell culture conditions being employed are producing uniform monolayers suitable for further experimentation. The protocol describes cell culture and layer evaluation methods in microfluidic channels and traditional fixed-well environments. This includes channel construction, cell culture and requisite conditions, fixation, permeabilization and staining, confocal microscopic imaging, image processing, and data analysis.

The presented protocol describes the development and use of a phalloidin-based filamentous-actin staining technique with confocal laser scanning microscopy (CLSM) to visualize adherent cell layer structure in microfluidic dynamic-culture channels and traditional fixed-well static-culture chambers. This approach aids in evaluating cell layer confluency, monolayer formation, and layer-thickness uniformity.

Preparazione e valutazione strutturale di monostrati di cellule epiteliali in un dispositivo di coltura microfluidica di dimensioni fisiologiche

In vitro microfluidic experimentation holds great potential to reveal many insights into the microphysiological phenomena occurring in conditions such as ...

Produzione in sistema chiuso di cellule aderenti basate su microcarrier solubili

Large-Scale Cell Production Based on GMP-Grade Dissolvable Porous Microcarriers

Researchers in the cell and gene therapy (CGT) industry have long faced a formidable challenge in the efficient and large-scale expansion of cells. To address the primary shortcomings of the two-dimensional (2D) planar culturing system, we innovatively developed an automated closed industrial scale cell production (ACISCP) platform based on a GMP-grade, dissolvable, and porous microcarrier for the 3D culture of adherent cells, including human mesenchymal stem/stromal cells (hMSCs), HEK293T cells, and Vero cells. To achieve large-scale expansion, a two-stage expansion was conducted with 5 L and 15 L stirred-tank bioreactors to yield 1.1 x 1010 hMSCs with an overall 128-fold expansion within 9 days. The cells were harvested by completely dissolving the microcarriers, concentrated, washed and formulated with a continuous-flow centrifuge-based cell processing system, and then aliquoted with a cell filling system. Compared with 2D planar culture, there are no significant differences in the quality of hMSCs harvested from 3D culture. We have also applied these dissolvable porous microcarriers to other popular cell types in the CGT sector; specifically, HEK293T cells and Vero cells have been cultivated to peak cell densities of 1.68 x 107 cells/mL and 1.08 x 107 cells/mL, respectively. This study provides a protocol for using a bioprocess engineering platform harnessing the characteristics of GMP-grade dissolvable microcarriers and advanced closed equipment to achieve the industrial-scale manufacturing of adherent cells.

Autore in primo piano: Avanzamento della produzione di terapie cellulari con microcarrier solubili 

Here, we present a protocol to achieve the large-scale manufacturing of adherent cells through a fully closed system based on GMP-grade dissolvable microcarriers. The cultivation of human mesenchymal stem cells, HEK293T cells, and Vero cells was validated and met both quantity demands and quality criteria for the cell and gene therapy industry.

Produzione di celle su larga scala basata su microcarrier porosi solubili di grado GMP

Researchers in the cell and gene therapy (CGT) industry have long faced a formidable challenge in the efficient and large-scale expansion of cells. To ...

Scale-up di colture cellulari di mammifero utilizzando un pallone nuovo multistrato

Riepilogo

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Scalabile piastra a 96 pozzetti Based iPSC cultura e di produzione utilizzando un sistema robotico Liquid Handling

Una piattaforma automatizzata versatile per micro-scala Cellulari esperimenti di stimolazione

La coltivazione di cellule di mammifero utilizzando un singolo-uso del sistema pneumatico Bioreattore

Regolamento nutrienti alimentando in continuo per l'espansione su larga scala di cellule di mammifero in Spheroids

Una piattaforma Microfluidic per l'isolamento Single-cell high-throughput e cultura

Elaborazione di cellule staminali mesenchimali umane per applicazioni cliniche utilizzando un flusso di lavoro semi-automatizzato chiuso

Preparazione e valutazione strutturale di monostrati di cellule epiteliali in un dispositivo di coltura microfluidica di dimensioni fisiologiche

Produzione di celle su larga scala basata su microcarrier porosi solubili di grado GMP

Produzione di celle su larga scala basata su microcarrier porosi solubili di grado GMP

Produzione di celle su larga scala basata su microcarrier porosi solubili di grado GMP