Siamo grati a Ken Iwata (OSI Pharmaceuticals, New York, USA) per i reagenti e Fred Miller (Barbara Ann Intitute Karmanos Cancer, Detroit, USA) per le linee cellulari.

1. Preparazione della soluzione METHOCEL (500 ml) <ol><li> Autoclave 6 g di metilcellulosa in una bottiglia da 500 ml contenente un agitatore magnetico. </li><li> Sciogliere la metilcellulosa in 250 ml di DMEM/F12 preriscaldato senza siero (60 ° C) per 20 min. </li><li> Aggiungere 250 ml di DMEM/F12 (RT) con siero di cavallo 10%. Mix notte (4 ° C). </li><li> Chiara la soluzione per centrifugazione (5000g, 2 ore, 4 ° C). </li><li> Prendere la soluzione limpida altamente viscosi a un nuovo tubo (circa il 90-95% della soluzione di riserva). </li><li> Conservare a 4 ° C fino all&#39;utilizzo. </li></ol> 2. Cultura sferoide <ol><li> Preparare una soluzione al 20% METHOCEL (10 ml METHOCEL e 40 ml di terreno di coltura). </li><li> Lavare le cellule due volte con PBS, aggiungere lo 0,1% tripsina e cellule incubare a 37 ° C </li><li> Risospendere le cellule in terreno di crescita e contare le cellule. </li><li> Preparare una sospensione di 10 000 cellule per ml nel 20% METHOCEL. </li><li> Aggiungere la sospensione cellulare ai 96 fondo anche l&#39;spiastre uspension (100 l per pozzetto). </li><li> Il giorno dopo, controlla la formazione sferoide nei piatti sospensione. Sferoidi sarà pronto per l&#39;uso dopo 1-3 giorni. </li></ol> 3. Preparazione del collagene <ol><li> Preparare sul ghiaccio una soluzione di 8 collagene ml, 1 ml di PBS 10x, 1 ml di NaOH 0,1 N e 3 gocce di 0,1 N HCl. Controlla se il pH è di 7,4 individuando alcune delle soluzione sulle strisce indicatore di pH. Regolare il pH se fuori portata. </li><li> Aggiungere 50 ml di soluzione di collagene neutralizzata nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti </li><li> Incubare a 37 ° C fino a quando il collagene è solidificata (90 min). </li><li> Preparare METHOCEL-collagene-ligando soluzioni su ghiaccio: per ogni ligando pipetta 1 parte di soluzione di collagene. Aggiungere 20 ng per ml di collagene TGF-β. Dopo diluizione con METHOCEL e diffusione sui diversi strati, la concentrazione finale di TGF-β sarà di 5 ng / ml Mescolare vortexando. Aggiungere 1 parte di METHOCEL-soluzione. Mescolare nel vortex. </li></ol> 4. Sferoide incorporareding <ol><li> Inserire una punta di 200 microlitri, che ha circa 5 mm dalla punta tagliata, in una pipetta 200 ul. Aspirare uno sferoide con la pipetta e dispensare con cura il mezzo in un piatto vuoto. Guarda se la sferoide rimane all&#39;interno della punta. Il sferoide è visibile come un punto bianco. Senza rilasciare lo stantuffo, aspirare 100 l collagene METHOCEL miscela e dispensare lo sferoide nella miscela di collagene in un collagene rivestito 96 pozzetti. Fate questo per 12 sferoidi per ogni condizione. </li><li> Lasciate solidificare il collagene almeno 30 minuti a 37 ° C </li><li> Rimuovere le bolle d&#39;aria con una punta di 200 l. </li><li> Aggiungere 50 ml di media con 1,6% di siero e gli inibitori sciolto in DMSO. Per SB-431542 aggiungere 4 ml di soluzione madre (10 mM) a 1 ml di terreno. Dopo la diffusione, la concentrazione finale della inibitore sarà di 10 micron. TGF-β e gli inibitori rimarrà il corso dell&#39;esperimento. Scatta foto di sferoidi al microscopio con ingrandimento 40x. </li><li> Dopo 48h di stimolazione con TGF-β e / o inibitori, scattare foto degli sferoidi al microscopio con ingrandimento 40x. </li><li> Misurare l&#39;area del sferoidi invasori dopo 2 giorni e sottrarre la zona di partenza. Misurazione della superficie di uno sferoide: Aprire l&#39;immagine dal sferoide in Adobe Photoshop Extended (figura 2A) e selezionare lo strumento di selezione rapida (figura 2B). Il puntatore del mouse si trasforma in un cerchio con un &#39;plus&#39; (+) segno (figura 2C). Mentre si trascina il cursore sopra la sferoide, Photoshop riconoscerà i confini della sferoide. Se una zona diversa da sferoide è selezionata, questa regione può essere esclusa dalla selezione premendo il tasto Alt o utilizzando lo strumento di selezione negativa, che è indicata da un segno (-) nella barra degli strumenti. Il cursore si trasforma in un cerchio con un &#39;meno&#39; (-) firmare e trascinando il cursore sopra l&#39;area erroneamente selezionata, questa zona viene rimosso dalla selezione (figura 2D). Se necessario, più regioni può essere selezionato premendo il Shift pulsante. Per lavorare con maggiore precisione, le dimensioni del puntatore del mouse può essere regolata cambiando il diametro del pennello nella barra degli strumenti (2E figura). Quando la sferoide tutto è selezionata, l&#39;area della selezione viene calcolata tramite ANALISI SU MISURA nella barra dei menu o premendo Ctrl + Maiusc + M (figura 2F). La finestra di registrazione misura apparirà mostrando il nome del file e la zona della selezione in pixel, così come altri dati (figura 2G). Se selezioni multiple sono misurati, la prima riga indica la somma di tutte le aree. Le misure delle scelte individuali sono presentati nelle linee di basso. I dati di tutte le misurazioni possono essere esportati in un file di testo e aperto in Excel. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: Un esempio di saggio sferoide con MCF10A1 (M1), le cellule epiteliali mammarie normali, H-RAS trasformato MCF10AneoT (M2), le cellule e M2-derivati ​​MCF10CA1a (M4) è dato in Figura 3. M1 cellule hanno mostrato solo debole senza invasionestimolazione, ma invaso significativamente migliore dopo la stimolazione da TGF-β. Al contrario, la RAS-trasformata M1-M2 derivati ​​già invaso in modo efficiente senza aggiunta di stimoli, e questo è stato ulteriormente aumentato 4-5 volte su TGF-β trattamento. M4 cellule hanno mostrato la più forte invasione, con o senza aggiunta di TGF-β. Successivamente, abbiamo valutato se ci potrebbe interferire con TGF-β-indotta invasione in questo modello sferoide utilizzando inibitori chimici. A questo scopo abbiamo utilizzato SB-431542, un analogo ATP e selettivo inibitore dell&#39;attività della chinasi TβRI, così come activina recettore di tipo IB (ActRIB) e activina receptor-like kinase (ALK) 7 12. Come previsto, SB-431542 potentemente inibito TGF-β-indotta invasione di M1, M2 e M4 cellule (Fig. 4), indicando che TGF-β-indotta invasione è TβRI-chinasi dipendente. Inoltre, l&#39;invasione basale della sferoidi è stata fortemente inibita, il che suggerisce che l&#39;invasione della base è anche deindipendenti sul TGF-β. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig1.jpg" /> Figura 1. Diagramma di flusso del test 3D sferoide. In primo luogo, le cellule sono placcati in condizioni non aderente a forma di u piastre sospensioni. Cellule aggregrate in sferoidi multcellular e può essere incorporato in una matrice di collagene. In questa matrice di collagene, sono in grado di invadere. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig2.jpg" /> Figura 2. Quantificazione dell&#39;area del sferoidi utilizzando Adobe Photoshop Extended. (A) Il quadro della sferoide è aperto in Adobe Photoshop allargata del (B) Selezione lo strumento Selezione rapida (C) Trascinando il cursore sopra la sferoide per selezionare l&#39;area dello sferoide (D) La rimozione di una zona di wongly incluso usando l&#39; negativo veloce strumento Selezione (E) Regolazione della dimensione del pennello dello strumento di selezione rapida per selezionare con maggiore precisione l&#39;area (F) Selezione delmisurazione comando da registrare (G) Esempio di un record di misura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig3.jpg" /> Figura 3. TGF-β-indotta invasione di sferoidi spontaneamente immortalata MCF10A1 (M1) (A), RAS-trasformato MCF10AneoT (M2 (B) e le sue metastasi derivate MCF10CA1a (M4) (C). M1, M2 e M4 sferoidi incorporato in collagene sono stati trattati con 5ng/ml di TGF-β per 48 ore, come indicato. AC immagini rappresentative tratte al giorno di incasso e due giorni dopo. invasione D relativo è stato quantificato come differenza zona giorno 2 meno giorno 0. I risultati sono espressi come media ± sd Adattato da 13. <img alt="Figura 4a" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig4a.jpg" /> <img alt="Figura 4b" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig4b.jpg" /> Invasione sferoide Figura 4. Basale e TGF-β-indotta è inibita by SB-431542. Sferoidi M1, M2 e M4 sono stati incorporati nel collagene e trattati con 5ng/ml TGF-β e / o 10 mM SB-431542 come indicato. Immagini rappresentative tratte dopo 2 giorni (A). Invasione parente è stato quantificato come differenza zona giorno 2 meno giorno 0 (B). I risultati sono espressi come media ± sd Adattato da 13.

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Nessun conflitto di interesse.

Abbiamo stabilito un modello di sferoide in cui MCF10A1 cellule e dei suoi derivati ​​maligne invadono in una matrice di collagene in un TGF-β-dipendente. In primo luogo, sferoidi si formano in 96-pozzi di piastre di fondo sospensione rotonda alla presenza di metilcellulosa. Naturalmente, anche a forma di U piatti rivestiti di poli-HEMA può essere utilizzato per questo scopo. Metilcellulosa è assolutamente necessaria in questa fase, poiché le cellule moriranno in assenza di metilcellulosa. TGF-β viene aggiunto direttamente al collagene METHOCEL miscela da quando abbiamo scoperto che le cellule hanno risposto meno bene al TGF-β se questo fattore è stato aggiunto alla cima op medio del collagene. Tuttavia, si consiglia di aggiungere inibitori chimici disciolti in DMSO non direttamente nel collagene, dato che il DMSO precipitati nei icecold collagene METHOCEL miscela. Pertanto, si aggiungono questi composti nel terreno in cima al collagene. Successivamente, le cellule sono incorporati in un collagene 3-dimensambiente ionale per consentire loro di invadere la matrice di collagene. Quando si confrontano le proprietà invasive delle diverse linee cellulari MCF10A1 abbiamo scoperto che l&#39;invasione della base così come TGF-β-indotta invasione aumentato da cellule relativamente benigno M1, a più alti livelli nel RAS-trasformato derivato M2, a livelli ancora più elevati nel metastatico M4 variante. Così, la proprietà invasivo correlato con il relativo stato di aggressività di queste tre linee cellulari 7,8,14. L&#39;incorporazione dello sferoide in collagene è un passo fondamentale nel saggio. La rilevazione della sferoide la punta della pipetta potrebbe essere difficile quando si esegue il test per le prime volte. Si può evitare questo, raccogliendo la sferoidi in un tubo, la filatura giù, rimuovendo il surnatante e risospendere il sferoidi in collagene METHOCEL miscela. Questo richiede più sferoidi come input di circa il 50% del sferoidi è perso durante questo processo. Inoltre, piùsferoidi può finire in un pozzo e potrebbe trovarsi troppo vicini gli uni agli altri da analizzare. Inoltre, si preferisce non avere più di un sferoide per pozzetto per evitare la possibilità che sferoidi possono interferire con l&#39;altro (per esempio secernono fattori di crescita). Quindi il passo risospensione è un passo fondamentale con questo metodo. Un limite di questo saggio è che analizziamo un test a 3 dimensioni in un piano a 2 dimensioni. Come si può vedere nelle figure 3 e 4, la maggior parte delle cellule di solito invadono sullo stesso piano. Tuttavia, sferoidi che si trovano molto vicino al bordo del pozzo invadono generalmente più in profondità e sono per questo motivo esclusi dall&#39;analisi. Naturalmente sarebbe possibile eseguire l&#39;analisi in 3D, al fine di ottenere un risultato più preciso. Ma questo richiede hardware e software sofisticate e il vantaggio di calcolare il volume invece di usare l&#39;area non possono superare i problemi. Soprattutto perché abbiamo scoperto che la variazione delle dimensioni di partenzadel 3-dimensionale sferoidi misurata in 2D, in genere solo il 5-10%. Un altro svantaggio di questo metodo è che l&#39;immagine è un passo molto tempo, dato che il sferoidi si trovano a diverse altezze, che ostacola l&#39;imaging automatizzato. Anche la fase di analisi richiede tempo e richiede immagini con un buon contrasto da sferoide alla matrice, al fine di fare uso di Photoshops capacità di riconoscere automaticamente il bordo della sferoide. Nel caso in cui il contrasto è troppo basso, si può facilmente adattare la luminosità e il contrasto utilizzando i livelli ed i comandi CURVE in Photoshop. Un altro modo per aumentare il contrasto potrebbe essere l&#39;uso di un colorante vitale fluorescente. Come un modo alternativo di quantificazione, si può disegnare l&#39;area intorno alla sferoide manualmente utilizzando immagini J. Un anticipo di immagine J è che è freeware (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Tuttavia, abbiamo trovato il disegno manuale della forma irregolare del sferoidi invaso in immagine Jun passo molto tempo rispetto a strumento di selezione rapida di Photoshop. Il protocollo può essere adattato per studiare invasione di altre linee cellulari, a condizione che le cellule sono in grado di formare spheroids.Furthermore, la concentrazione ottimale di TGF-β per indurre l&#39;invasione della linea cellulare potrebbe essere diverso. In tutte le nostre linee cellulari, TGF-β induce invasione a 5 ng / ml, anche se M4 prestazioni migliori quando si usano 2 ng / ml. Inoltre, questo test può essere adattato a misurare le risposte invasiva per altri fattori di crescita, come fattore di crescita epiteliale (EGF) o fattore di crescita degli epatociti (HGF). Nei nostri test l&#39;invasione della base e TGF-β-indotta è stata fortemente inibita dal trattamento con SB-431542, un inibitore del recettore di tipo I per TGF-β. Questa è una prova di principio che gli inibitori chimici possono essere utilizzati in questo test. Inibitori chimici, come gli inibitori MMP, sono stati utilizzati con successo a concentrazionezioni consigliato dal produttore per la cultura monostrato cellulare. Su padroneggiare questa tecnica, si può testare l&#39;effetto degli inibitori chimici, l&#39;abbattimento o l&#39;iperespressione di geni invasione. Inoltre, scaling up il test in un formato ben 24, si può isolare l&#39;RNA utilizzando un fenolo-cloroformio a base di metodo (ad es Trizol ® o Tripure), seguita da una colonna a base di silice-clean-up. Questo RNA può essere utilizzato per quantitativa real-time PCR. Il nostro saggio di invasione sferoide assomiglia al processo in vivo più da vicino rispetto ai modelli 2D invasione, perché le cellule in sferoidi si trovano in diversi stati metabolici e interagire in maniera più naturale con l&#39;ambiente circostante 10. Abbiamo effettuato ioduro di propidio e diacetato di fluoresceina colorazione per verificare la presenza di cellule morte e vita dopo il test invasione e ha osservato che in modo simile alla situazione in vivo, le cellule del centro sono morti e necrotici, mentre le cellule al tempo tha bordo esterno sono metabolicamente attivi. Abbiamo usato collagene di tipo I piuttosto che Matrigel, perché diversi report hanno mostrato che la composizione della matrice extracellulare nel carcinoma mammario è spesso alterata, con conseguente fibrotiche rigide focolai di collagene con un alto contenuto io. E &#39;stato dimostrato che il collagene contenuto aumento io promuove la formazione di cancro al seno e 15 e l&#39;invasione è associata con una maggiore incidenza di metastasi 16. Molte cellule tumorali hanno quindi ad invadere attraverso un ambiente ricco di collagene I per metastasi. Diversi i modelli 3D sono stati sviluppati negli ultimi decenni. Le celle possono essere sia interamente immerse all&#39;interno in una matrice o collocato su una matrice polimerica o di un ponteggio 17,18. In un modello 3D sviluppato da Bissell e collaboratori, le cellule sono state coltivate in un ricostituito membrana basale (RBM) matrice. Questo modello fornisce un test rapido per distinguere tra normali e maligniepitelio mammario, ma si concentra sulla morfologia delle cellule 19,20. Morfogenesi e organizzazione delle diverse linee cellulari MCF10A inversamente correlato con malignità 21,22. In altri modelli 3D sferoidi multicellulari hanno mostrato la stessa resistenza ai farmaci citotossici come loro linea cellulare dei genitori in vivo, mentre le cellule in monostrato non è riuscito a farlo 11. Anche culture 3D di linee cellulari MCF10A sono stati utilizzati per valutare la sensibilità di inibitori della chinasi 23. Il nostro modello sferoide integra questi test da particolare attenzione ai invasione.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Metilcellulosa </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M0512 </td><td></td></tr><tr><td> PureCol </td><td> Avanzate Biomatrix </td><td> 5005-B </td><td></td></tr><tr><td> Indicatore di pH striscie </td><td> Merck </td><td> 9533 </td><td></td></tr><tr><td> 96-oltre sospensione Piastre </td><td> Greiner Bio-one </td><td> 650 185 </td><td></td></tr><tr><td> 96-TC e l&#39;adesione Piastre </td><td> Greiner Bio-one </td><td> 655 180 </td><td></td></tr></tbody></table>

spheroid assay to measure tgf-&#946;-induced invasion

TGF-β ha opposti ruoli nella progressione del cancro al seno, agendo come un soppressore del tumore nella fase iniziale, ma stimolando l&#39;invasione e metastasi in seguito 1,2 stadio. Inoltre, TGF-β è spesso sovra-espresso nel cancro al seno e la sua espressione correla con prognosi infausta e metastasi 3,4. I meccanismi attraverso i quali TGF-β induce invasione non sono ben compresi. TGF-β suscita le sue risposte via cellulare di tipo II del TGF-β (TβRII) e di tipo I (TβRI) recettori. Su TGF-β-indotta formazione eteromerici complesso, TβRII fosforila il TβRI. Il TβRI attivato avvii un percorso di segnalazione intracellulare canonica da Smads fosforilazione del recettore (R-Smads), cioè Smad2 e Smad3. Questi attivato R-Smads formare complessi con eteromerici Smad4, che si accumulano nel nucleo e regolano la trascrizione dei geni bersaglio 5. Oltre al già described percorso Smad, i risultati del recettore attivazione attivazione di numerose altre vie di segnalazione non Smad, per esempio mitogeno proteina chinasi attivata (MAPK) percorsi di 6. Per studiare il ruolo del TGF-β in diversi stadi di cancro al seno, abbiamo fatto uso del sistema a celle MCF10A. Questo sistema è costituito da immortalata spontaneamente MCF10A1 (M1), le cellule epiteliali del seno 7, l&#39;H-RAS trasformato M1-derivato MCF10AneoT (M2), che produce lesioni precancerose nei topi 8, e l&#39;M2-derivato MCF10CA1a (M4), istituito dalla xenotrapianti M2 e forme ad alta carcinomi di grado con la capacità di metastatizzare al polmone 9. Questa serie MCF10A offre la possibilità di studiare le risposte delle cellule con diversi gradi di malignità che non sono viziate da un background genetico diverso. Per l&#39;analisi di TGF-β-indotta invasione, abbiamo generato homotypic MCF10A sferoide embe colture cellularidded in una matrice di collagene 3D in vitro (Fig. 1). Tali modelli sono molto simili tumori umani in vivo mediante l&#39;istituzione di un gradiente di ossigeno e nutrienti, con conseguente cellule attive e invasivi sulle cellule all&#39;esterno e quiescenti o addirittura necrotico nella parte interna della sferoide 10. Sferoide test basato hanno anche dimostrato di ricapitolare meglio la resistenza ai farmaci di colture monostrato 11. Questo modello MCF10 sistema 3D ci ha permesso di studiare l&#39;impatto di TGF-β segnalazione sulle proprietà invasiva delle cellule del seno in diverse fasi di malignità.

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Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

Un test per misurare quantitativamente fattore di crescita trasformante (TGF)-β-indotta invasione in 3-dimensionale gel collagene è descritto. Questo saggio si avvale della MCF10A serie di linee cellulari, che rappresentano diversi stadi di sviluppo del cancro al seno. Questo metodo può essere adottato per essere utilizzato con altre linee cellulari e può essere utilizzato per indagare altri potenziali attivatori o inibitori di invasione.

Saggio sferoide Misura TGF-β-indotta Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

spheroid-assay-to-measure-tgf-induced-invasion

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

21.8K Views.  Leiden University Medical Centre. Un test per misurare quantitativamente fattore di crescita trasformante (TGF)-β-indotta invasione in 3-dimensionale gel collagene è descritto. Questo saggio si avvale della MCF10A serie di linee cellulari, che rappresentano diversi stadi di sviluppo del cancro al seno. Questo metodo può essere adottato per essere utilizzato con altre linee cellulari e può essere utilizzato per indagare altri potenziali attivatori o inibitori di invasione.

Video: Spheroid Assay to Measure TGF-β-induced Invasion

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor microenvironment. To obtain more reliable in vitro results, several three-dimensional (3D) cell culture assays have been introduced. These assays allow cancer cells to interact with the extracellular matrix. This interaction affects cell behavior, such as proliferation and invasion, as well as cell morphology. Additionally, this interaction could induce or suppress the expression of several pro- and anti-tumorigenic molecules. Spheroid invasion assay was developed to provide a suitable 3D in vitro method to study cancer cell invasion. Currently, animal-derived matrices, such as mouse sarcoma-derived matrix (MSDM) and rat tail type I collagen, are mainly used in the spheroid invasion assays. Taking into consideration the differences between the human tumor microenvironment and animal-derived matrices, a human myoma-derived matrix (HMDM) was developed from benign uterus leiomyoma tissue. It has been shown that HMDM induces migration and invasion of carcinoma cells better than MSDM. This protocol provided a simple, reproducible, and reliable 3D human tumor-based spheroid invasion assay using the HMDM/fibrin matrix. It also includes detailed instructions on imaging and analysis. The spheroids grow in a U-shaped ultra-low attachment plate within the HMDM/fibrin matrix and invade through it. The invasion is daily imaged, measured, and analyzed using ilastik and Fiji ImageJ software. The assay platform was demonstrated using human laryngeal primary and metastatic squamous cell carcinoma cell lines. However, the protocol is suitable also for other solid cancer cell lines.

Tumor microenvironment is an essential part of cancer growth and invasion. To mimic carcinoma progression, a biologically relevant human matrix is needed. This protocol introduces an improvement for the in vitro three-dimensional spheroid invasion assay by applying a human leiomyoma-based matrix. The protocol also introduces a computer-based cell invasion analysis.

Matrice a base di tumore umano in un saggio di invasione sferoide tridimensionale

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor stroma, host fibroblasts are stimulated by cancer cells to differentiate. Thus, they acquire a phenotype that contributes to the tumor microenvironment and supports tumor progression. By using the spheroid model, we have set up such a 3D in vitro model system, in which we analyzed the role of laminin-332 and its receptor integrin &#945;3&#946;1 in this differentiation process. This spheroid model system not only reproduces the tumor microenvironment conditions in a more accurate way, but also is a very versatile model since it allows different downstream studies, such as immunofluorescent staining of both intra- and extracellular markers, as well as deposited extracellular matrix proteins. Moreover, transcriptional analyses by qPCR, flow cytometry and cellular invasion can be studied with this model. Here, we describe a protocol of a spheroid model to assess the role of CAFs&#39; integrin &#945;3&#946;1 and its ectopically deposited ligand, laminin-332, in differentiation and in supporting the invasion of pancreatic cancer cells.

The goal of this protocol is to establish a 3D in vitro model to study the differentiation of cancer-associated fibroblasts (CAFs) in a tumor bulk-like environment, which can be addressed in different analysis systems, such as immunofluorescence, transcriptional analysis and life cell imaging.

Un modello esplosivo 3D come sistema più fisiologico per la differenziazione dei fibroblasti associati al cancro e gli studi sull'invasione in vitro

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited number of assays allow for direct monitoring and mechanistic insights into the interactions between tumor and immune cells, amongst which, T-cells play a significant role in executing the cytotoxic response of the adaptive immune system to cancer cells. Most assays are based on two-dimensional (2D) co-culture of cells due to the relative ease of use but with limited representation of the invasive growth phenotype, one of the hallmarks of cancer cells. Current three-dimensional (3D) co-culture systems either require special equipment or separate monitoring for invasion of co-cultured cancer cells and interacting T-cells.
Here we describe an approach to simultaneously monitor the invasive behavior in 3D of cancer cell spheroids and T-cell cytotoxicity in co-culture. Spheroid formation is driven by enhanced cell-cell interactions in scaffold-free agarose microwell casts with U-shaped bottoms. Both T-cell co-culture and cancer cell invasion into type I collagen matrix are performed within the microwells of the agarose casts without the need to transfer the cells, thus maintaining an intact 3D co-culture system throughout the assay. The collagen matrix can be separated from the agarose cast, allowing for immunofluorescence (IF) staining and for confocal imaging of cells. Also, cells can be isolated for further growth or subjected to analyses such as for gene expression or fluorescence activated cell sorting (FACS). Finally, the 3D co-culture can be analyzed by immunohistochemistry (IHC) after embedding and sectioning. Possible modifications of the assay include altered compositions of the extracellular matrix (ECM) as well as the inclusion of different stromal or immune cells with the cancer cells.

The presented approach simultaneously evaluates cancer cell invasion in 3D spheroid assays and T-cell cytotoxicity. Spheroids are generated in a scaffold-free agarose multi-microwell cast. Co-culture and embedding in type I collagen matrix are performed within the same device which allows to monitor cancer cell invasion and T-cell mediated cytotoxicity.

Monitoraggio dell'invasione delle cellule tumorali e della citotossicità delle cellule T nella cultura 3D

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

Valutazione del cancro ovarico Spheroid attaccamento e l&#39;invasione delle cellule mesoteliali in tempo reale

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Medicina

Modelli 3D in Biologia del Cancro: Dinamiche di Invasione negli Eterosferoidi

Alternative Strategy to Analyze In Vitro Cell Invasion of 3D Cultures

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) cultures. Invasion is a cellular outcome of utmost interest in cancer biology. In this protocol, we have devised an alternative strategy for evaluating cancer cell invasion in vitro, employing heterospheroids comprised of oral squamous cell carcinoma (OSCC), cancer-associated fibroblasts (CAF), and monocytes. These heterospheroids aim to mimic the tumor microenvironment (TME), including two relevant non-neoplastic cell types alongside the cancer cells. Each cell type was labeled with vital fluorescent markers emitting in distinct wavelengths before spheroid formation. Once formed, heterospheroids were seeded onto a layer of human leiomyoma-derived extracellular matrix in the upper compartment of a microporous membrane. Invasion was assessed in the z-axis using confocal microscopy. Digital images were obtained in the corresponding fluorescent channels at 10 &#181;m intervals, covering a depth of 90 &#181;m in the z-axis. Analysis was performed using freeware image software by calculating the integrated fluorescence intensity in each image and fluorescence channel. This approach enables a more dynamic analysis of cell invasion patterns in a multilayered context, as well as the examination of spatial co-localization of different cell types during invasion.

Autore in primo piano: Decifrare il crosstalk tra cancro e cellule immunitarie durante la progressione del cancro della testa e del collo

Invasion is a major biological phenomenon in the development and progression of cancer. This process is influenced by non-neoplastic cells and components of the tumor microenvironment. The purpose of this study is to describe an alternative method for analyzing tumor cell invasion in vitro using three-dimensional (3D) cultures.

Strategia alternativa per analizzare l'invasione cellulare in vitro di colture 3D

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Tridimensionale (3D) Tumore Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

<meta charset="utf8"></head><body>Esame delle interazioni macrofagi-sferoidi tumorali in una configurazione di matrice di collagene 3D

A Macrophage-Tumor Spheroid Co-Invasion Assay

The interaction of immune and cancer cells and their respective impact on metastasis represents an important aspect of cancer research. So far, only a few protocols are available that allow an in vitro approximation of the in vivo situation. Here, we present a novel approach to observing the impact of human macrophages on the invasiveness of cancer cells, using tumor spheroids of H1299 non-small cell lung carcinoma cells embedded in a three-dimensional (3D) collagen I matrix. With this co-cultivation setup, we tested the impact of small interfering RNA (siRNA)-based depletion of regulatory factors in macrophages on the 3D invasion of cancer cells from the tumor spheroid compared to controls. This method allows the determination of different parameters, such as spheroid area or the number of invading cancer cells, and thus, to detect differences in cancer cell invasion. In this article, we present the respective setup, discuss the subsequent analysis, as well as the advantages and potential pitfalls of this method.

<meta charset="utf8"></head><body>Un test di co-invasione di macrofagi-tumori sferoidi

Here, we present a protocol to investigate the interaction of primary human monocyte-derived macrophages with a tumor spheroid in a three-dimensional (3D) collagen I matrix, with the possibility to compare the impact of soluble and physical properties of the microenvironment on cell invasion.

Un test di co-invasione di macrofagi-tumori sferoidi

The interaction of immune and cancer cells and their respective impact on metastasis represents an important aspect of cancer research. So far, only a few ...

Saggio sferoide Misura TGF-β-indotta Invasion

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Matrice a base di tumore umano in un saggio di invasione sferoide tridimensionale

Un modello esplosivo 3D come sistema più fisiologico per la differenziazione dei fibroblasti associati al cancro e gli studi sull'invasione in vitro

Monitoraggio dell'invasione delle cellule tumorali e della citotossicità delle cellule T nella cultura 3D

Valutazione del cancro ovarico Spheroid attaccamento e l'invasione delle cellule mesoteliali in tempo reale

Strategia alternativa per analizzare l'invasione cellulare in vitro di colture 3D

Strategia alternativa per analizzare l'invasione cellulare in vitro di colture 3D

Strategia alternativa per analizzare l'invasione cellulare in vitro di colture 3D

Tridimensionale (3D) Tumore Spheroid Invasion Assay

Un test di co-invasione di macrofagi-tumori sferoidi

Un test di co-invasione di macrofagi-tumori sferoidi