Vorremmo ringraziare il laboratorio di A. Hadjantonakis (Sloan-Kettering Institute) e il laboratorio di L. Niswander (U of Colorado at Denver) per un parere utile con le tecniche di dissezione e la cultura. Questo lavoro è stato sostenuto da NRSA NS059562 a JDG e RO1NS05897 di MER, in collaborazione con L. e J. Niswander Nadeau (Institute for Systems Biology).

1. Preparazione di terreni di coltura - tutti i reagenti sono elencati nella tabella 1 <ol><li> Scongelare siero ratto maschio a 37 ° C. </li><li> Calore Disattiva siero di ratto per 30 minuti a 55 ° C </li><li> Centrifugare siero ratto a 10K per 5 minuti a temperatura ambiente </li><li> Rimuovere il surnatante 50:50 e mescolare con fenolo-rosso senza DMEM w / glucosio </li><li> Sterilizzare i media usando un filtro da 0,45 um siringa </li><li> Almeno 1 ml di media / embrione deve essere preparato </li></ol> 2. Isolamento dell&#39;utero dalla diga incinta <ol><li> Utilizzando le procedure approvate dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso (IACUC), la diga incinta viene prima anestetizzato e poi sacrificati per dislocazione cervicale </li><li> Sterilizzare l&#39;addome con il 70% EtOH </li><li> Pinch un piccolo sentiero di pelle lungo la linea mediana, appena sopra la linea capezzolo, con una pinza grande e aperto l&#39;addome sotto il tuo pinze con le forbici di grandi dimensioni. Fare attenzione a non danneggiare le strutture internes </li><li> Usa la tua forbici per tagliare lateralmente dalla apertura iniziale verso entrambi i lati del mouse in modo che l&#39;intero addome è aperto </li><li> Intestini e cuscinetti di grasso in eccesso possono spesso oscurare l&#39;utero e questi dovrebbero essere spostati da parte in modo che la parte superiore dell&#39;utero e delle ovaie può essere osservato da ogni lato </li><li> Pizzicare la parte superiore dell&#39;utero sotto le ovaie e utilizzare le forbici per separare l&#39;utero dal grasso, il taglio da un capo dell &#39;utero all&#39;ovaio altri </li><li> Estrarre l&#39;utero con il forcipe e posto in una capsula di Petri con soluzione salina </li></ol> 3. Rimozione di embrioni dall&#39;utero <ol><li> Risciacquare l&#39;utero con soluzione fisiologica per rimuovere il sangue in eccesso e tagliare il grasso in eccesso dall&#39;esterno </li><li> Trasferire su un piatto pulito, con temperatura ambiente. Tyrodes salina per migliorare la visualizzazione </li><li> Utilizzando uno stereomicroscopio, separare ogni embrione utilizzando piccole forbici o, se necessario, sottile (# 5) pinze a cura sbucciare l&#39;utero a parte. </li> &lt;li&gt; Inserire una pinza sottile nello spazio tra la parete uterina e la decidua e staccare la parete uterina, facendo attenzione a non forare l&#39;embrione </li></ol> 4. Rimozione di decidua da embrioni <ol><li> Orientare la decidua modo che la parte più scura (placenta) è rivolto verso di voi </li><li> Fare un&#39;incisione con il forcipe, lungo la linea che separa la parte oscura della decidua dalla parte più leggera, facendo attenzione a non tagliare troppo in profondità </li><li> Completa la separazione della placenta dalla parte superiore del sacco vitellino, facendo attenzione a non strappare la ectoplacental cono (EPC). A questo punto dovreste essere in grado di visualizzare la membrana REICHERTS sul sacco vitellino </li><li> Continuare a rimuovere l&#39;intero decidua (più leggero porzione) facendo attenzione a non forare il sacco vitellino </li><li> Premere leggermente e rimuovere il REICHERTS da peeling lontano dalla EPC. Se l&#39;EPC è danneggiato o separato dal sacco vitellino, gli embrioni non riuscirà a girare normalmente da E8.5-E9.5 </li><li&gt; Con il REICHERTS rimosso l&#39;embrione deve essere facilmente visibile attraverso il sacco vitellino e può essere messo in scena da somities conteggio. </li></ol> 5. Configurazione del sistema cultura <ol><li> Tagliare l&#39;estremità di una pipetta di trasferimento di plastica con le forbici per aumentare il diametro dell&#39;apertura in modo che un embrione può essere pipettati senza danneggiare il sacco vitellino </li><li> Riempimento di bottiglie rullo pulito con 1 ml di supporti per embrione. A seconda del tipo di bottiglie a rulli utilizzati un massimo di 3-6 embrioni possono essere caricati in ogni bottiglia. </li><li> Trasferire gli embrioni usando il tuo pipetta taglio ai media pieni di bottiglie rullo, riporto quanto Tyrodes meno possibile per non diluire i media </li><li> Fissare il tappo di gomma (tappo) per la parte superiore della bottiglia di vetro rullo </li><li> Inserire il rullo di bottiglie nel tamburo cultura rullo in modo che una tenuta stagna è formata tra la spina e il tamburo </li><li> Una volta che tutte le bottiglie sono stati attaccati, e qualsiasi slot vuoti nel tamburo sono stati sigillati wtappi in gomma esima, attivare il rullo </li><li> Aperto di CO 2 e O 2 serbatoi e regolare a circa 2 bar, in modo che la valvola di scarico sta rilasciando una bolla al secondo. Per E8.5-E10 embrioni, il 20% O 2 e il 5% di CO 2 dovrebbe essere usato. </li><li> Assicurarsi che l&#39;incubatore è impostato a 37 ° C e coprire o chiudere l&#39;incubatore in modo che gli embrioni siano al riparo dalla luce. </li><li> Gli embrioni devono essere controllati periodicamente per valutare il loro sviluppo con l&#39;aggiunta di somities, la progressione della svolta, e l&#39;estensione della chiusura del tubo neurale </li><li> Dopo 2-3 ore di cultura, gli inibitori farmacologici o altri trattamenti possono essere aggiunti ai media </li><li> Il disegno dello studio dovrebbe comprendere i controlli, come veicolo o analoghi inattivi di reagente studio. </li></ol> 6. Valutare lo sviluppo dopo la coltura degli embrioni intero <ol><li> Spegnere il gas, arresto a rullo e rimuovere bottiglie da incubatore </li><li> Embrioni trasferimento a Tyrodes o PBS in una capsula di Petri per la valutazione sotto stereomicroscopio </li><li> Il sacco vitellino dovrebbe apparire simili a palloncini, un battito cardiaco dovrebbe essere visibile e la frequenza cardiaca deve essere&gt; 120 battiti al minuto, e la circolazione dovrebbe essere evidente </li><li> Embrioni fotografia prima della rimozione sacco vitellino, se necessario, </li><li> Rimuovere sacco vitellino da embrione, tagliando un foro vicino l&#39;EPC e lanciando il sacco vitellino e amnios sopra la testa e groppa dell&#39;embrione. </li><li> Il cordone ombelicale può essere tagliato per separare il sacco vitellino dall&#39;embrione, e il sacco vitellino può essere utilizzata per la genotipizzazione l&#39;embrione, se necessario. </li><li> Esaminate l&#39;embrione per numero somite e difetti del tubo neurale, come pieghe del cranio aperto, chiusura incompleta del viso e / o un neuropore aperto caudale. Gli embrioni possono essere allestita secondo la classificazione Theiler di cambiamenti morfogenetici multiple ( <a href="http://genex.hgu.mrc.ac.uk/Databases/Anatomy/MAstaging.html">http://www.emouseatlas.org/ Emap / home.html</a> ) Ancora una volta, un archivio fotografico disviluppo embrionale è utile. </li></ol> 7. Note <ol><li> Una dissezione di alta qualità è essenziale, perché ogni nick o lacrime nel sacco vitellino impedirà di svolta e di successo inibire il normale sviluppo. L&#39;EPC possono essere danneggiati durante la rimozione della membrana di Reichert (RM), e se l&#39;EPC è anche parzialmente separato dal sacco vitellino, gli embrioni non si sviluppano normalmente. Tuttavia, la rimozione incompleta della RM può causare embrioni per stare insieme e / o RM possono invadere le cellule in coltura e restringono l&#39;espansione sacco vitellino, entrambi che impedirebbe il normale sviluppo. </li><li> Pinze pulite e nitide sono il segreto per ottenere una dissezione bene, perché forcipe opaco o piegato rendere la procedura molto più difficile. Depositi di proteine ​​su strumenti porterà a danni ai tessuti. </li><li> Pulito, bottiglie di vetro sterile sono essenziali anche per evitare che gli embrioni di attaccarsi alla parete laterale e di essere danneggiati. Prima di iniziare l&#39;esperimento, le bottiglie devono essere scrubbed con acqua e sapone, risciacquati in dH 2 O, microonde e con una piccola quantità di acqua in ogni bottiglia fino a quando l&#39;acqua bolle. Bottiglie vengono poi risciacquati con il 70% EtOH e lasciato asciugare all&#39;aria. </li><li> Lavorare il più velocemente possibile, perché la prima l&#39;embrione può essere trasferito ai media cultura e riscaldato di nuovo a 37 ° C la sopravvivenza migliore. </li><li> Dissezione completa l&#39;intera cucciolata prima di trasferire tutti gli embrioni alle bottiglie rullo in modo che ogni embrione è a temperatura ambiente per la stessa quantità di tempo per evitare di creare qualsiasi discrepanza nella crescita dell&#39;embrione </li><li> Mantenere un ambiente sterile, per evitare la contaminazione batterica delle culture. I nostri esperimenti cultura sono stati effettuati senza antibiotici, ma molti laboratori aggiungere antibiotici alla loro mezzi di comunicazione per prevenire la crescita batterica. Il mezzo dovrebbe apparire più chiaro alla fine dell&#39;esperimento come era all&#39;inizio dell&#39;esperimento. Se il supporto è diventato nuvoloso o c&#39;è un precipitato visibile, è probabile una truffacontaminazione che ha infettato la vostra cultura. </li><li> Lo scambio di gas inefficaci può anche ritardare lo sviluppo degli embrioni, in modo da essere sicuri di avere un regolatore affidabile che garantisce la consegna continua. </li><li> Gli embrioni si sviluppano circa il 50% più lento nella cultura ex vivo, quindi è indispensabile contare somiti per assicurarsi di aver raggiunto l&#39;adeguato livello di sviluppo per il completamento della sperimentazione. </li></ol> 8. Rappresentante dei risultati: La comparsa degli embrioni pre-e post-roller cultura è illustrato nella figura 1. Al momento della dissezione, degli embrioni dovrebbe essere in una configurazione intentato (Fig. 1 A, D), dove la coda si trova dietro le pieghe testa. Dopo 36 ore di cultura, gli embrioni devono aver completato girando in modo che siano in C-curva, posizione fetale, in cui la coda è di fronte al capo (Fig. 1B, C, E, F). Manipolazione farmacologica con RhoA inibitore della chinasi (Y-27632), un noto inibitore di estensione convergente duranteneurulazione (Ybot-Gonzalez, 2007), si traduce in un accorciamento degli embrioni lungo il loro asse rostro-caudale (Fig. 1E, F) e inibisce la chiusura del cranio neurale volte. I nostri dati mostrano che dosi crescenti di Y-27632 compromette progressivamente cranica chiusura volte (Figura 2A) e riduce l&#39;asse del corpo (Fig. 2B), in coerenza con il ruolo di valle RhoA segnalazione in neurulazione cranico ed estensione convergente. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3132/3132fig1.jpg" /> Figura 1. Aspetto di embrioni culture e di manipolazione con l&#39;inibitore farmacologico Y-27632. (A, D) embrioni Dissected a E8.5 prima della coltura degli embrioni interi (B, E) Gli embrioni in E10 con il sacco vitellino ancora intatto, a seguito 36hrs della cultura rullo. (C, F) Il sacco vitellino è stato rimosso per illustrare il successo di svolta e la chiusura del tubo neurale. Embrioni che sono stati trattati con l&#39;inibitore della chinasi Rho Y-27632 (E, F) non è riuscito a sottoporsi corretta estensione convergente e illustrareun asse del corpo ridotto. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3132/3132fig2.jpg" /> Figura 2. Effetto inibitore della chinasi RhoA sul cranio di chiusura del tubo neurale e di allungamento dell&#39;asse. (A) La percentuale di embrioni che sono stati in grado di chiudere con successo la loro pieghe cranica (NTC% = percentuale di chiusura del tubo neurale) viene confrontato con la dose di Y-27632 aggiunto al mezzo di coltura. (B) La distanza tra vescicola otica e arti anteriori è stato notevolmente ridotto a dosi crescenti di Y-27632 (p &lt;.05).

<ol>
	<li>Cockroft, D. L., Copp, A. J., Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+culture+of+post+implantation+embryos.">Dissection and culture of post implantation embryos.</a> Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. , (1990).</li><li>Gray, J. D., Ross, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+folate+supplementation+from+Crooked+tail+and+other+NTD-prone+mutant+mice.">Mechanistic insights into folate supplementation from Crooked tail and other NTD-prone mutant mice.</a> Birth Defects Res. A. Clin. Mol. Teratol. 85, 314-321 (2009).</li><li>Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Atlas of Mouse Development. , (1992).</li><li>Ybot-Gonzalez, P., Savery, D., Gerrelli, D., Signore, M., Mitchell, C. E., Faux, C. H., Greene, N. D., Copp, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+extension,+planar-cell-polarity+signalling+and+initiation+of+mouse+neural+tube+closure.">Convergent extension, planar-cell-polarity signalling and initiation of mouse neural tube closure.</a> Development. 134, 789-799 (2007).</li><li>Ross, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-environment+interactions,+folate+metabolism+and+the+embryonic+nervous+system.">Gene-environment interactions, folate metabolism and the embryonic nervous system.</a> Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2, 471-480 (2010).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La possibilità di separare materno, i fattori intrauterina da quelli che sono intrinseci all&#39;embrione durante il suo sviluppo è uno strumento importante per studiare tutte le fasi della embriogenesi. Qui abbiamo analizzato gli effetti di un inibitore della chinasi piccola molecola RhoA in utero cranica ex neurulazione, eliminando così la variabile del metabolismo materno del farmaco. Questa manipolazione farmacologica ha un profondo effetto sulla neurulazione cranica ed estensione convergente. Sensibilità a questo composto può essere confrontato fra i differenti mutanti di topo genetica. Il metodo qui presentato può essere applicato anche agli studi di altre vie molecolari in fase di sviluppo, permettendo la manipolazione diretta della funzione cellulare in embrioni usando una varietà di reagenti.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> Stereomicroscopio per dissezione </td><td> Leica </td><td> M165 </td><td></td></tr><tr><td> Incubatore di precisione </td><td> BTC Ingegneria (UK) </td><td> BTC 001 </td><td></td></tr><tr><td> Rotazione Bottiglia dell&#39;Unità Cultura </td><td> BTC </td><td> BTC 003 </td><td></td></tr><tr><td> Bottiglie di vetro per rotante Unità </td><td> BTC </td><td> BTC 005 </td><td></td></tr><tr><td> Silicone Rubber Bung </td><td> BTC </td><td> BTC 007 </td><td></td></tr><tr><td> Silicone Rubber Cork </td><td> BTC </td><td> BTC 008 </td><td></td></tr><tr><td> Gas Bubbler ingresso </td><td> BTC </td><td> BTC 012 </td><td></td></tr><tr><td> Bubbler gas in ingresso trappola </td><td> BTC </td><td> BTC 013 </td><td></td></tr><tr><td> Gas Bubbler uscita </td><td> BTC </td><td> BTC 014 </td><td></td></tr><tr><td> Bombola di gas </td><td> TechAir </td><td></td><td> 20% di O 2, 5% CO 2 </td></tr><tr><td> Regolatore del gas </td><td> TechAir </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rat Serum maschio </td><td> Harlan Labs </td><td> 4520 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM w / o rosso fenolo </td><td> Invitrogen </td><td> 31053 </td><td></td></tr><tr><td> Siringa da 10 ml </td><td> BD </td><td> 309604 </td><td></td></tr><tr><td> Filtro siringa </td><td> Nalgene </td><td> 190-2545 </td><td></td></tr><tr><td> Grande Forbici dissezione (Blunt punta) </td><td> VWR </td><td> 82027-594 </td><td></td></tr><tr><td> Extra Fine Bonn Forbici </td><td> Belle Strumenti Scientifici (FST) </td><td> 14084-08 </td><td></td></tr><tr><td&gt; Dumot # 5 pinze </td><td> FST </td><td> 11252-50 </td><td></td></tr><tr><td> Tyrode di Saline </td><td></td><td></td><td> Come descritto in Cockroft 1990 </td></tr><tr><td> Piatto 10 centimetri Petri monouso </td><td> BD </td><td> 351029 </td><td></td></tr></tbody></table>

neural tube closure in mouse whole embryo culture

Modelli murini genetiche sono uno strumento importante per lo studio dei mammiferi chiusura del tubo neurale (Gray &amp; Ross, 2009; Ross, 2010). Tuttavia, lo studio di embrioni di topo in utero è limitata dalla nostra incapacità di farmacologicamente direttamente manipolare gli embrioni in modo isolato dagli effetti del metabolismo materno sul reagente di interesse. Sia che si utilizzi una piccola molecola, proteine ​​ricombinanti, o siRNA, la consegna di queste sostanze alla madre, attraverso la dieta o per iniezione saranno oggetto questi composti instabili ad una varietà di difese corporee che potrebbero impedire loro di raggiungere l&#39;embrione. Studi effettuati su colture di embrioni intero può essere usato per separare materna da intrinseca effetti sullo sviluppo fetale. Qui vi presentiamo un metodo per la coltura embrioni di topo usando sostanze altamente arricchito in un apparecchio rotante incubatore che consente di normale chiusura del tubo neurale dopo la dissezione (Crockett, 1990). Una volta in coltura, gli embrioni possonoessere manipolato con tradizionali tecniche in vitro, che altrimenti non sarebbero possibili se gli embrioni erano ancora in utero. Fratelli embrione può essere raccolte in vari momenti per studiare diversi aspetti del neurulazione, che si verificano da E7-7.5 (formazione di placca neurale, appena prima l&#39;inizio della neurulazione) per E9.5-10 (al termine del cranio neuropore piega e caudale chiusura, Kaufman, 1992). In questo protocollo, dimostriamo il nostro metodo per sezionare embrioni a timepoints che sono ottimali per lo studio del neurulazione cranica. Embrioni saranno sezionati a E8.5 (circa 10-12 somities), dopo l&#39;inizio della chiusura del tubo neurale, ma prima di accendere embrione e la chiusura del cranio neurale piega, e mantenute in coltura fino a E10 (26-28 somities), quando cranico neurulazione dovrebbe essere completa.

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Neural Tube Closure in Mouse Whole Embryo Culture

Un metodo che consente la manipolazione diretta farmacologica di embrioni di topo durante neurulazione che aggira il metabolismo materno è descritto. La tecnica può essere adattata per studiare diversi aspetti della neurulazione variando il punto di tempo e agente farmacologico.

La chiusura del tubo neurale in Cultura embrione di topo intero

Genetic mouse models are an important tool in the study of mammalian neural tube closure (Gray &amp; Ross, 2009; Ross, 2010).  However, the study of mouse ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

21.5K Views.  Weill Cornell Medical College. Un metodo che consente la manipolazione diretta farmacologica di embrioni di topo durante neurulazione che aggira il metabolismo materno è descritto. La tecnica può essere adattata per studiare diversi aspetti della neurulazione variando il punto di tempo e agente farmacologico.

Video: Neural Tube Closure in Mouse Whole Embryo Culture

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

Stabilire embrionali di topo Neural Stem Cell Culture del saggio di neurosfere

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

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Neuroscienze

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolamento e la coltura delle cellule della cresta neurale da Embryonic Murine tubo neurale

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of existing mouse lines for genetic cell lineage tracing: a tamoxifen-inducible Cre line and a Cre reporter line expressing dsRed upon Cre-mediated recombination. By using a relatively low level of tamoxifen, we were able to induce recombination in a small number of cells, permitting us to follow individual cell divisions. Additionally, we observed the transcriptional response to Sonic Hedgehog (Shh) signaling using an Olig2-eGFP transgenic line 1-3 and we monitored formation of cilia by infecting the cultured slice with virus expressing the cilia marker, Sstr3-GFP 4. In order to image the neuroepithelium, we harvested embryos at E8.5, isolated the neural tube, mounted the neural slice in proper culturing conditions into the imaging chamber and performed time-lapse confocal imaging. Our ex vivo live imaging method enables us to trace single cell divisions to assess the relative timing of primary cilia formation and Shh response in a physiologically relevant manner. This method can be easily adapted using distinct fluorescent markers and provides the field the tools with which to monitor cell behavior in situ and in real time.

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Here we develop the tools necessary for ex vivo live imaging to trace single cell divisions in the mouse E8.5 neuroepithelium

Ex vivo Imaging in diretta di divisioni cellulari singoli in mouse neuroepitelio

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ability to study cell movements and differentiation in vivo is still very difficult. Neurocristopathies, or disorders of the neural crest lineage, are particularly challenging to study due to a lack of accessibility of key embryonic stages and the difficulties in separating out the neural crest mesenchyme from adjacent mesodermal mesenchyme. Here, we set out to establish a well-defined, routine protocol for the culture of primary cranial neural crest cells. In our approach we dissect out the mouse neural plate border during the initial neural crest induction stage. The neural plate border region is explanted and cultured. The neural crest cells form in an epithelial sheet surrounding the neural plate border, and by 24 h after explant, begin to delaminate, undergoing an epithelial-mesenchymal transition (EMT) to become fully motile neural crest cells. Due to our two-dimensional culturing approach, the distinct tissue populations (neural plate versus premigratory and migratory neural crest) can be readily distinguished. Using live imaging approaches, we can then identify changes in neural crest induction, EMT and migratory behaviors. The combination of this technique with genetic mutants will be a very powerful approach for understanding normal and pathological neural crest cell biology.

This protocol describes the dissection and culture of cranial neural crest cells from mouse models, primarily for the study of cell migration. We describe the live imaging techniques used and the analysis of speed and cell shape changes.

Dissezione, cultura e analisi delle cellule staminali primarie dal mouse per lo studio della delaminazione e della migrazione delle cellule creste neurali

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...

Biologia dello sviluppo

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development and growth of mammalian embryos are critically dependent on the function of the placenta, WEC technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages during embryonic day (E) 6.5-E12.5 in the mouse or E8.5-E14.5 in the rat 2, 3, 4. In WEC, we can directly target desired areas of embryos using fine glass capillaries because embryos can be manipulated under the microscope. Therefore, rodent WEC is very useful technique when we want to study dynamic developmental processes of postimplanted mammalian embryos. Up to date, several types of WEC systems have been developed 1. Among those, the rotator-type bottle culture system is most popular and suitable for long-term culture of embryos at midgestation, i.e., after E9.5 and E11.5 in the mouse and rat, respectively 1. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat WEC after E12.5 using a refined model of the original rotator system, which was designed by New and Cockroft 5, 6, and introduce various applications of WEC technique for studies in mammalian developmental biology.

Whole embryo culture technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat whole embryo culture after E12.5 using the rotator-type bottle culture system.

Il metodo di coltura degli embrioni roditori intero utilizzando il Rotator tipo di sistema cultura Bottiglia

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

Biologia

Monitoraggio longitudinale della meccanica delle placche neurali nello sviluppo dell'embrione di pollo

Monitoring the Mechanical Evolution of Tissue During Neural Tube Closure of Chick Embryo

Neural tube closure (NTC) is a critical process during embryonic development. Failure in this process can lead to neural tube defects, causing congenital malformations or even mortality. NTC involves a series of mechanisms on genetic, molecular, and mechanical levels. While mechanical regulation has become an increasingly attractive topic in recent years, it remains largely unexplored due to the lack of suitable technology for conducting mechanical testing of 3D embryonic tissue in situ. In response, we have developed a protocol for quantifying the mechanical properties of chicken embryonic tissue in a non-contact and non-invasive manner. This is achieved by integrating a confocal Brillouin microscope with an on-stage incubation system. To probe tissue mechanics, a pre-cultured embryo is collected and transferred to an on-stage incubator for ex ovo culture. Simultaneously, the mechanical images of the neural plate tissue are acquired by the Brillouin microscope at different time points during development. This protocol includes detailed descriptions of sample preparation, the implementation of Brillouin microscopy experiments, and data post-processing and analysis. By following this protocol, researchers can study the mechanical evolution of embryonic tissue during development longitudinally.

Autore in primo piano: Misurazione senza contatto della meccanica tissutale in embrioni di pollo vivi mediante microscopia Brillouin

This protocol was developed to longitudinally monitor the mechanical properties of neural plate tissue during chick embryo neurulation. It is based on the integration of a Brillouin microscope and an on-stage incubation system, enabling live mechanical imaging of neural plate tissue in ex ovo cultured chick embryos.

Monitoraggio dell'evoluzione meccanica del tessuto durante la chiusura del tubo neurale dell'embrione di pulcino

Neural tube closure (NTC) is a critical process during embryonic development. Failure in this process can lead to neural tube defects, causing congenital ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the neural tube in a process known as neurulation. During neurulation, morphogenesis of the mesenchyme that underlies the neural plate is believed to drive neural fold elevation. The cranial mesenchyme is comprised of the paraxial mesoderm and neural crest cells. The cells of the cranial mesenchyme form a pourous meshwork composed of stellate shaped cells and intermingling extracellular matrix (ECM) strands that support the neural folds. During neurulation, the cranial mesenchyme undergoes stereotypical rearrangements resulting in its expansion and these movements are believed to provide a driving force for neural fold elevation. However, the pathways and cellular behaviors that drive cranial mesenchyme morphogenesis remain poorly studied. Interactions between the ECM and the cells of the cranial mesenchyme underly these cell behaviors. Here we describe a simple ex vivo explant assay devised to characterize the behaviors of these cells. This assay is amendable to pharmacological manipulations to dissect the signaling pathways involved and live imaging analyses to further characterize the behavior of these cells. We present a representative experiment demonstrating the utility of this assay in characterizing the migratory properties of the cranial mesenchyme on a variety of ECM components.

The cranial mesenchyme undergoes dramatic morphogenic movements that likely provides a driving force for elevation of the neural folds1,2. Here we describe a simple ex vivo explant assay to characterize the cellular behaviors of the cranial mesenchyme during neurulation. This assay has numerous applications including being amenable to pharmacological manipulations and live imaging analyses.

Un test per la valutazione dei comportamenti Espianto cellulare del Mesenchima cranio

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

La chiusura del tubo neurale in Cultura embrione di topo intero

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Stabilire embrionali di topo Neural Stem Cell Culture del saggio di neurosfere

Isolamento e la coltura delle cellule della cresta neurale da Embryonic Murine tubo neurale

Ex vivo Imaging in diretta di divisioni cellulari singoli in mouse neuroepitelio

Dissezione, cultura e analisi delle cellule staminali primarie dal mouse per lo studio della delaminazione e della migrazione delle cellule creste neurali

Il metodo di coltura degli embrioni roditori intero utilizzando il Rotator tipo di sistema cultura Bottiglia

Monitoraggio dell'evoluzione meccanica del tessuto durante la chiusura del tubo neurale dell'embrione di pulcino

Monitoraggio dell'evoluzione meccanica del tessuto durante la chiusura del tubo neurale dell'embrione di pulcino

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Un test per la valutazione dei comportamenti Espianto cellulare del Mesenchima cranio

Isolamento e coltura di cellule staminali neurali embrionali del Mouse