Vorremmo ringraziare i tecnici di laboratorio della Clinica Mayo micobatteriologia Laboratorio per il loro aiuto durante lo studio.

Ogni laboratorio deve eseguire una valutazione dei rischi in collaborazione con il loro Comandante istituzionali di sicurezza biologica per determinare il livello appropriato di biosicurezza per la preparazione dell&#39;inoculo e per pipettaggio dell&#39;inoculo nella piastra. Nel nostro laboratorio, utilizziamo livello di biosicurezza 3 laboratorio (BSL3) pratiche fino alla micropiastre vengono inoculati, e sigillato con una guarnizione di plastica adesiva. Queste lastre vengono poi poste all&#39;interno di un sacchetto di plastica, che è caldo anche sigillato. Lettura di incubazione e l&#39;interpretazione dei micropiastra è condotto in un laboratorio di livello di biosicurezza 2 (BSL2). 1. Etichettatura delle materie <ol><li> Etichettare una piastra di agar sangue, tre Middlebrook 7H10 piatti, brodo Middlebrook 7H9, una soluzione salina tra tubo di vetro e perle micropiastra AST con gli identificatori appropriati (per esempio, il nome del paziente, il numero di cartella clinica) nel BSL2. </li><li> Etichetta l&#39;agar sangue e 7H10 placcato come il &quot;controllo della purezza&quot;. Conta delle colonie periodica degli inoculo sono raccomandati per garantire che un&#39;adeguata concentrazione di organismi viene utilizzato nel test. Conta delle colonie, quando eseguite dovranno avere due dei piatti 7H10 etichettati con &quot;conta 1 / 1 colonia&quot; e &quot;contare 1 / 50 colonia&quot;. </li></ol> 2. Tecnologo preparati per andare in BSL3 <ol><li> Appropriati dispositivi di protezione individuale è necessario lavorare in BSL3 e comprende solid-front camice, copricapo, guanti, copriscarpe, e un respiratore. Ciascuna istituzione dovrebbe stabilire il proprio piano di protezione delle vie respiratorie in collaborazione con l&#39;Ufficio Igiene Industriale loro istituzione. Nel nostro laboratorio, abbiamo respiratori diversi disponibili, tra cui respiratori alimentati ad aria purificata (PAPRs) e montato con filtri HEPA, N95 mezza faccia respiratori. </li></ol> 3. Preparazione della cappa di sicurezza biologica <ol><li> Nel BSL3, preparare la cappa di sicurezza biologica (BSC) per la disinfezione della superficie e mettendo un tovagliolo di carta imbevuto di disinfettante circa 6 centimetri dal pannello di sfiato aria. </li><li> Posizionare un contenitore per rifiuti a sinistra, e nephlometer piccole e vortex sulla destra. </li><li> Loop inoculo, pipetors e suggerimenti sono posti accanto al tovagliolo di carta. </li><li> Mettere un rack con l&#39;organismo (in brodo o su terreno solido) e il 0,5 di serie McFarland sul tovagliolo di carta. </li></ol> 4. Calibrazione del nefelometro <ol><li> Posizionare un tubo di vetro salina perla tra nel nefelometro e impostare lo strumento a zero usando il vuoto salina interpolazione. </li><li> Posizionare il 0,5 standard di McFarland nel nefelometro e calibrare secondo le istruzioni del produttore. </li></ol> 5. Preparazione dell&#39;inoculo <ol><li> Lavorare nel colonie raschiare BSC dal terreno solido utilizzando un&#39;ansa sterile nel adeguatamente etichettati salina tubo tra perle di vetro fino a ≥ 0,5 McFarland standard si ottiene. </li><li> Ispezionare visivamente il campione, e confrontare allo standard McFarland. </li><li> Esempio Vortex per 30-60 secondi. </li><li> Lasciare l&#39;inoculo di stabilirsi per 15 minuti (impostare un timer). </li></ol> 6. Inoculazione del micropiastra <ol><li> Regolare l&#39;inoculo con soluzione salina tra brodo usando il nefelometro calibrato al McFarland 0,5 in passi 4.1 e 4.2. Questo deve essere completato entro 30 minuti (secondo le specifiche del produttore). </li><li> Utilizzare un 200 pipetter microlitri e un lungo puntale resistente aerosol per rimuovere 100 l di inoculo dal rd TOP 1 / 3 della soluzione salina tubo tallone interpolazione. Inoculare il brodo Middlebrook 7H9. Lentamente vortice il brodo inoculato 7H9 per 20 secondi. </li><li> Rimuovere la piastra microtiter AST dalla confezione del produttore. NON USARLO se l&#39;essiccante è blu o se la confezione di alluminio è danneggiato. </li><li> Preparare una diluizione 1:50 tubo per l&#39;uso più tardi nella preparazione della diluizione 1:50 pipettando 50 ml di acqua sterile in una provetta sterile. </li><li> Versare cautamente l&#39;inoculo 7H9 brodo in un trogolo. Evitare di generare aerosol. </li><li> Posizionare la micropiastra AST con l&#39;etichetta rivolto verso l&#39;alto. </li><li> Usare un 12-canale pipetter per aggiungere 100 microlitri della inoculo a ciascun pozzetto. </li><li> Preparare le diluizioni per la conta delle colonie: <ol type="a"><li> L&#39;1 / 1 diluizione è preparato dal controllo positivo (H12) con striature 1 loop microlitri sul piatto 7H10 denominata &quot;1 / 1&quot;. </li><li> L&#39;1 / 50 di diluizione è preparati inoculando un loop 1 microlitri dal pozzetto del controllo positivo (H12) e vorticoso nel tubo con 50 ml di tubo di acqua preparata in precedenza. Streak 1 ml di questa diluizione alla piastra etichetta &quot;1 / 50&quot;. </li></ol></li><li> Inoculare le piastre purezza dal trogolo pipettando 50 microlitri su un agar sangue senza anticoagulante e 7H10 piastra e strisciare per l&#39;isolamento. </li><li> Postoun sigillo adesivo sul micropiastra AST. Premere con decisione su ogni bene per assicurare un&#39;adeguata tenuta utilizzando il retro bianco della tenuta. Evitare pieghe. </li><li> Disinfettare la micropiastra strofinando con un tovagliolo di carta imbevuto di un disinfettante tubercolicida e microstrips posto in un sacchetto di plastica e chiudere con una saldatura a caldo o nastro. <ol type="a"><li> Il sacchetto di plastica funge da contenitore secondario per garantire che tutti brodo è contenuto dovrebbe esserci una perdita o fuoriuscita del piatto principale. </li></ol></li></ol> 7. Disinfezione dei materiali e cabina di sicurezza biologica <ol><li> Per evitare di produrre aerosol, attraverso un altro posto sulla parte superiore della vasca inoculato prima di inserirlo delicatamente nel contenitore degli scarti. </li><li> Disinfettare tutti i materiali tra cui nephlometer, vortex, lastre, tubi, ecc strofinando giù con un disinfettante tubercolicida e aspettare il momento opportuno per assicurare la disinfezione secondo le istruzioni del produttore prima di togliere dal BSC. Per esempio, Prospray, il disinfettante tubercolicida usiamo, richiede 15 minuti per uccidere micobatteri. </li><li> Mettere il recipiente scartare in un sacchetto di rischio biologico e sigillare prima di sterilizzazione in autoclave. </li></ol> 8. Incubazione <ol><li> Piastre devono essere incubate con i media verso il basso e si deve prestare attenzione per evitare fuoriuscite o spruzzi liquidi. </li><li> Incubare la micropiastra AST piatto, 7H10 e piastre di agar sangue in un incubatore 35-37 ° C con il 5-10% di CO 2 con 5-10% di CO 2 nel laboratorio BSL2. <ol class="lalpha"><li> Nel nostro laboratorio, questo è accettabile perché la piastra è ben sigillato e dentro un sacchetto di plastica sigillato. </li></ol></li><li> Non più di 2 piastre di microtitolazione AST dovrebbe essere impilati in incubatrice secondo le istruzioni del produttore. </li></ol> 9. Rappresentante risultati Interpretazione dei risultati: Sigillato AST micropiastre possono essere letti manualmente usando uno specchio come un aiuto o con un lettore di piastre automatizzata, ad esempio il Vizion (Diagnostica TREK). Le lastre possono essere esaminata non appena 7 giorni dopo l&#39;inoculazione. Esaminare i pozzetti di controllo della crescita in posizioni H11 e H12 per determinare se sono positivi (cioè, hanno un deposito di cellule sul fondo del pozzo). Se i pozzi di controllo della crescita non sono positivi, reincubare la piastra e riesaminare periodicamente (es., giorno 10, giorno 14) fino a quando i pozzi di controllo della crescita sono positivi. <ol type="a"><li> Specchio leggere: <ol type="i"><li> Luogo sigillato AST micropiastra sulla piattaforma; </li><li> Leggi pozzetti di controllo della crescita dopo 7 giorni di incubazione, se invece è negativo, reincubare AST micropiastra; </li><li> Se i controlli di crescita sono accettabili, quindi leggere il farmaco contenente pozzi. Per per ogni farmaco, registrare la prima diluizione che non ha una crescita confrontando i pozzi della droga con il controllo della crescita. </li><li> La crescita appare come torbidità o come un deposito di cellule in fondo a un pozzo. </li></ol></li><li> Strumento di lettura: seguire le istruzioni del produttore, le istruzioni che seguono sono un esempio di come la lettura sarebbe stato fatto con la piattaforma Vizion: <ol type="i"><li> Log in </li><li> Utilizzare una piastra &quot;MYCOTB&quot; AST software. </li><li> Luogo piatto sigillato con il codice a barre rivolto verso l&#39;utente. La crescita appare come torbidità o come un deposito di cellule in fondo a un pozzo. </li><li> Leggi controlla la crescita, se questo è negativo, reincubare AST micropiastra, se positiva leggere la piastra toccando lo schermo con il primo pozzo di ogni farmaco che non mostra crescita. </li></ol></li></ol> Leggi le piastre purezza. La piastra di agar sangue dovrebbe mostrare alcuna crescita dopo 48 ore e la piastra di purezza 7H10 dovrebbe avere crescita confluente di un tipo di organismo. Se contaminati, il test AST microtiter deve essere ripetuta da una coltura pura. Calcolare la conta delle colonie dal controllo positivo utilizzando la tabella sottostante: Colony Conte chiave <table border="1"><tbody><tr><td> # Colonie contate sulla piastra denominata &quot;1 / 1&quot; </td><td> # Colonie contate sulla piastra denominata &quot;1 / 50&quot; </td><td> Inoculo conteggio delle colonie (ufc / ml) </td></tr><tr><td> &lt;50 </td><td> 0 </td><td> &lt;5 X 10 4 </td></tr><tr><td> 50-100 </td><td> 0-2 </td><td> 5 x 10 4 a 1 x 10 5 </td></tr><tr><td> &gt; 100 </td><td> ≤ 10 </td><td> 1 x 5-5 Ottobre X 10 5 </td></tr><tr><td> &gt; 100 </td><td> &gt; 10 </td><td> &gt; 5 X 10 5 </td></tr></tbody></table> Ci possono essere uscita con l&#39;acido para-aminosalicilico in alcuni ceppi di Mycobacterium tubercolosis. Questo può essere interpretato, cercando in tutti i pozzetti che sono pellet e con il primo pozzo che ha la stessa dimensione del pellet come la diluizione successiva, come il punto finale. La resistenza è rara con questo farmaco. <img src="/files/ftp_upload/3094/3094fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Risultati rappresentativi utilizzando la piastra MYCOTB. <table border="1"><tbody><tr><td> Droga abbreviazione </td><td> Droga </td><td> MIC μ / ml </td></tr><tr><td> OFL </td><td> ofloxacina </td><td> 16 </td></tr><tr><td> MXF </td><td> moxifloxacina </td><td> 8 </td></tr><tr><td> RIF </td><td> rifampin </td><td> &gt; 16 </td></tr><tr><td> AMI </td><td> amikacina </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> STR </td><td> streptomicina </td><td> 16 </td></tr><tr><td> RFB </td><td> rifabutina </td><td> 8 </td></tr><tr><td> PAS </td><td> acido p-aminosalicilico </td><td> ≤ 0,5 </td></tr><tr><td> ETH </td><td> etionamide </td><td> 5 </td></tr><tr><td> CYC </td><td> cicloserina </td><td> 4 </td></tr><tr><td> INH </td><td> isoniazide </td><td> 2 </td></tr><tr><td> KAN </td><td> kanamicina </td><td> 1,2 </td></tr><tr><td> EMB </td><td> etambutolo </td><td> 4.0 </td></tr></tbody></table>

<ol>
	<li>Wengenack, N., Hall, L., Labombardi, V., Parrish, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+New+Sensititre+(MYCOTB)+MIC+Plate+for+the+Susceptibility+Testing+of+Mycobacterium+tuberculosis+(Mtb)+to+First+and+Second+Line+Drugs.">Evaluation of the New Sensititre (MYCOTB) MIC Plate for the Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis (Mtb) to First and Second Line Drugs.</a> , (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HHS+Publication+No.+(CDC)+21-112:+Biosafety+in+Microbiological+and+Biomedical+Laboratories+(BMBL).">HHS Publication No. (CDC) 21-112: Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL).</a> U.S. Department of Health and Human Services Centers for Disease and Preventions. , (2009).</li><li>Morcillo, N., Imperiale, B., Digiulio, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+MGIT+960+and+the+colorimetric-based+method+for+tuberculosis+drug+susceptibility+testing.">Evaluation of MGIT 960 and the colorimetric-based method for tuberculosis drug susceptibility testing.</a> Int J Tuberc Lung Dis. 14, 1169-1175 (2010).</li><li>Bemer, P., Bodmer, T., Munzinger, J., Perrin, M., Vincent, V., Drugeon, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicenter+Evaluation+of+the+MB/BACT+System+for+Susceptibility+Testing+of+Mycobacterium+tuberculosis.">Multicenter Evaluation of the MB/BACT System for Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis.</a> J Clin Microbiol. 42, 1030-1034 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SENSITITRE+MYCOTB+Susceptibility+Plate:+For+Mycobacterium+Susceptibility+Testing.">SENSITITRE MYCOTB Susceptibility Plate: For Mycobacterium Susceptibility Testing.</a> Product Insert. , (2010).</li><li>CLSI. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Susceptiblity Testing of Mycobacteria, Nocardia, and Other Aerobic Actinomycetes; Approved Standard. Document M24-A. , (2003).</li><li>Sullivan, N., Sotos, J., Anhalt, K., Allen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+results+from+a+new+TREK+Sensititre+Mycobacterium+tuberculosis+MIC+plate+(MYCOTB).">Preliminary results from a new TREK Sensititre Mycobacterium tuberculosis MIC plate (MYCOTB).</a> , (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VersaTREK+MYCO+SUSCEPTIBLITY+KIT.">VersaTREK MYCO SUSCEPTIBLITY KIT.</a> Product insert. , 7115-7160 (2008).</li><li>Parrish, N. M., Carroll, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+the+Clinical+Mycobacteriology+Laboratory+in+the+Diagnosis+and+Management+of+Tuberculosis+in+Low+Prevalance+Settings.">The Role of the Clinical Mycobacteriology Laboratory in the Diagnosis and Management of Tuberculosis in Low Prevalance Settings.</a> J Clin Microbiol. , (2010).</li><li>Kam, K. M., Sloutsky, A., Yip, C. W., Bulled, N., Zingol, M., Espinal, M., Kim, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+critical+concentrations+of+second-line+anti-tuberculosis+drugs+with+clinical+and+microbiological+relevance.">Determination of critical concentrations of second-line anti-tuberculosis drugs with clinical and microbiological relevance.</a> Int J Tubercl Lung Dis. 14, 282-288 (2010).</li><li>Woods, G. L., Warren, N. G., Inderlied, C. B., Murray, P. R., Barron, E. J., Jorgensen, J. H., Landry, M. L., Pfaller, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+Test+Methods:+Mycobacteria,+Nocardia,+and+Other+Actinomycetes.">Susceptibility Test Methods: Mycobacteria, Nocardia, and Other Actinomycetes.</a> Manual of Clinical Microbiology. , 1223-1247 (2007).</li><li>Bergmann, J. S., Woods, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+ESP+Culture+System+II+for+Testing+Susceptibilities+of+Mycobacterium+tuberculosis+Isolates+to+Four+Primary+Antituberculosis+Drugs.">Evaluation of the ESP Culture System II for Testing Susceptibilities of Mycobacterium tuberculosis Isolates to Four Primary Antituberculosis Drugs.</a> J Clin Microbiol. 36, 2940-2943 (1998).</li></ol>

Un esempio della micropiastra AST che controlla la crescita positiva è illustrato nella figura 1 e il punto finale MIC (mg / ml) per ogni farmaco è cerchiato. Uno studio condotto nel nostro laboratorio hanno indicato che il metodo microtiter AST piastra è equivalente al metodo gold standard proporzione agar per testare la sensibilità del Mycobacterium tuberculosis. Più veloce comunicazione dei risultati è stato ottenuto con micropiastra AST microtiter rispetto al metodo tradizionale proporzione agar con l&#39;interpretazione finale per piastra AST microtitolazione e proporzione metodo agar a 14 e 21 giorni, respectively.The AST micropiastra ha il vantaggio di test prima e farmaci di seconda linea contemporaneamente che può aiutare a prevenire ritardi eccessivi con ceppi resistenti. La piastra microtiter AST è anche molto più facile da impostare e leggere che l&#39;APM e sia uno specchio manuale e un sistema semi-automatico come il Vizion può essere utilizzato per leggere le piastre. La disponibilità di un valore di MIC per testare la resistenza ai farmaci TB può fornire preziose informazioni ai medici nuove rispetto al valore tradizionale concentrazione critica, soprattutto per quelli isolati con suscettibilità &quot;borderline&quot;.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> AST micropiastre e sigillo adesivo </td><td> Diagnostica TREK, Cleveland Ohio </td><td> MYCOTB </td></tr><tr><td> McFarland 0,5 di serie </td><td> Diagnostica TREK, Cleveland, Ohio </td><td> E1041 </td></tr><tr><td> Middlebrook 7H10 piastre </td><td> Pescatore </td><td></td></tr><tr><td> Piastre di agar sangue </td><td> Pescatore </td><td></td></tr><tr><td> Sterile loop microlitri 1 </td><td> Pescatore </td><td></td></tr><tr><td> Anse sterili 10 L </td><td> Pescatore </td><td></td></tr><tr><td> Sensititre Saline-Tween perline di vetro brodo </td><td> Diagnostica TREK, Cleveland, Ohio </td><td> 27143 </td></tr><tr><td> 7H9 OADC brodo </td><td> Diagnostica TREK, Cleveland, Ohio </td><td> T3440 </td></tr><tr><td> Puntali lungo </td><td> Pescatore </td><td></td></tr><tr><td> Trogoli sterile </td><td> Diagnostica TREK, Cleveland, Ohio </td><td></td></tr><tr><td> M. tuberculosis </td><td> ATCC </td><td> 27294 </td></tr><tr><td> Pipeters: 1000, 200, 20μL </td><td> Pescatore </td><td></td></tr><tr><td> Consigli 1000, 20, 20 l </td><td> Pescatore </td><td></td></tr><tr><td> Multicanale Pipetter </td><td> Pescatore </td><td></td></tr><tr><td> Incubatore di CO% 05-10 febbraio </td><td> Pescatore </td><td></td></tr><tr><td> Sacchetti di plastica, piccoli, CO 2 permeabile </td><td> Poly plastica, Delano, PA </td><td></td></tr><tr><td> TB disinfettante (Come ad esempio ProSpray C-60) </td><td> Certol internazionale, Commerce City, CO </td><td> PSC60/32 </td></tr><tr><td> Specchio Box Reader </td><td> Pescatore </td><td></td></tr></tbody></table>

antimicrobial susceptibility testing of mycobacterium tuberculosis complex for first and second line drugs by broth dilution in a microtiter plate format

La rilevazione rapida della resistenza antimicrobica è importante nel tentativo di controllare l&#39;aumento della resistenza Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Test di suscettibilità antimicrobica (AST) di Mtb è stata tradizionalmente eseguita con il metodo di agar proporzione o testando macrobroth su uno strumento come il BACTEC (Becton Dickinson, Sparks, MD), VersaTREK (Diagnostica TREK, Cleveland, OH) o BacT / ALERT (bioMérieux, Hazelwood, MO). Il metodo delle proporzioni agar, mentre considerato lo standard &quot;oro&quot; di AST, è laborioso e richiede il calcolo della resistenza effettuando la conta delle colonie su agar contenenti droga rispetto al drug-free agar. Se vi è una crescita ≥ 1% sul farmaco contenente medio rispetto al drug-free medio, l&#39;organismo è considerato resistente a quel farmaco. I metodi macrobroth richiedono strumentazione e rompere punto di prova (&quot;critical&quot;) concentrazioni del farmaco per i farmaci di prima linea (isoniazide, etambutolo, rifampicina e pirazinamide). Il metodo qui descritto è disponibile in commercio in un formato da 96 pozzetti micropiastra [MYCOTB (Diagnostica TREK)] e contiene concentrazioni crescenti di 12 antimicrobici usati per il trattamento della tubercolosi inclusi sia prima (isoniazide, rifampicina, etambutolo) e farmaci di seconda linea (amikacina, cicloserina, etionamide, kanamicina, moxifloxacina, ofloxacina, acido para-aminosalicilico, rifabutina, e streptomicina). Pirazinamide, un farmaco di prima linea, non è incluso nella piastra microtiter a causa della sua necessità di condizioni di prova acida. Vantaggi del sistema micropiastra includono sia la facilità di configurazione e veloce girare intorno a tempo (14 giorni) rispetto al rapporto tradizionale agar (21 giorni). Inoltre, la piastra può essere impostato da inoculo preparato utilizzando brodo o terreno solido. Poiché il formato micropiastra è nuova e da Mtb presenta sfide di sicurezza unici nel laboratorio, questo protocollo si descrive come impostare in modo sicuro, incubare e leggere la micropiastra.

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Antimicrobial Susceptibility Testing of Mycobacterium Tuberculosis Complex for First and Second Line Drugs by Broth Dilution in a Microtiter Plate Format

Test di suscettibilità antimicrobica di Mycobacterium tuberculosis è impegnativo, ma fondamentale per la cura del paziente. Questo formato micropiastra offre test di 12 farmaci antimicobatterici e fornisce minima concentrazione inibente (MIC) valori, che sarà di aiuto nel trattamento appropriato.

Test di suscettibilità antimicrobica del complesso Mycobacterium tuberculosis delle droghe prima e seconda linea per diluizione brodo in un formato micropiastra

The rapid detection of antimicrobial resistance is important in the effort to control the increase in resistant Mycobacterium 
tuberculosis (Mtb). ...

antimicrobial-susceptibility-testing-mycobacterium-tuberculosis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

38.1K Views.  Mayo Clinic. Test di suscettibilità antimicrobica di Mycobacterium tuberculosis è impegnativo, ma fondamentale per la cura del paziente. Questo formato micropiastra offre test di 12 farmaci antimicobatterici e fornisce minima concentrazione inibente (MIC) valori, che sarà di aiuto nel trattamento appropriato.

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Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis 1, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms 2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) 5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms 7.
In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin 8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere 9. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc27000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen 9. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.
Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis forms drug tolerant biofilms when cultured in certain conditions. Here we describe methods for culturing M. tuberculosis biofilms and determining the frequency of drug tolerant persisters. These protocols will be useful for further studies into the mechanisms of drug tolerance in M. tuberculosis.

Crescita Mycobacterium tuberculosis I biofilm

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

The MODS method for diagnosis of tuberculosis and multidrug resistant tuberculosis

Patients with active pulmonary tuberculosis (TB) infect 10-15 other persons per year, making diagnosing active TB essential to both curing the patient and preventing new infections.  Furthermore, the emergence of multidrug resistant tuberculosis (MDRTB) means that detection of drug resistance is necessary for stopping the spread of drug-resistant strains.  The microscopic-observation drug-susceptibility (MODS) assay is a low-cost, low-tech tool for high-performance detection of TB and MDRTB.  The MODS assay is based on three principles: 1) mycobacterium tuberculosis (MTB) grows faster in liquid media than on solid media 2) microscopic MTB growth can be detected earlier in liquid media than waiting for the macroscopic appearance of colonies on solid media, and that growth is characteristic of MTB, allowing it to be distinguished from atypical mycobacteria or fungal or bacterial contamination 3) the drugs isoniazid and rifampicin can be incorporated into the MODS assay to allow for simultaneous direct detection of MDRTB, obviating the need for subculture to perform an indirect drug susceptibility test. Competing current diagnostics are hampered by low sensitivity with sputum smear, long delays until diagnosis with solid media culture, prohibitively high cost with existing liquid media culture methods, and the need to do subculture for indirect drug susceptibility testing to detect MDRTB.  In contrast, the non-proprietary MODS method has a high sensitivity for TB and MDRTB, is a relatively rapid culture method, provides simultaneous drug susceptibility testing for MDRTB, and is accessible to resource-limited settings at just under $3 for testing for TB and MDRTB.

The microscopic-observation drug-susceptibility (MODS) assay is a low-cost, low-tech tool for high-performance detection of tuberculosis (TB) and multidrug-resistant tuberculosis (MDRTB). This video describes the MODS liquid media culture method.

Il metodo MODS per la diagnosi di tubercolosi e di tubercolosi multiresistente

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Biologia

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments. An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification, target size selection, target labeling, and microarray hybridization within a single solution and into a single microfluidic chamber. A batch processing method is demonstrated with a 9-plex asymmetric master mix and low-density gel element microarray for genotyping multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). The protocol described here can be completed in 6 hr and provide correct genotyping with at least 1,000 cell equivalents of genomic DNA. Incorporating on-chip wash steps is feasible, which will result in an entirely closed amplicon method and system. The extent of multiplexing with an amplification microarray is ultimately constrained by the number of primer pairs that can be combined into a single master mix and still achieve desired sensitivity and specificity performance metrics, rather than the number of probes that are immobilized on the array. Likewise, the total analysis time can be shortened or lengthened depending on the specific intended use, research question, and desired limits of detection. Nevertheless, the general approach significantly streamlines microarray workflow for the end user by reducing the number of manually intensive and time-consuming processing steps, and provides a simplified biochemical and microfluidic path for translating microarray-based diagnostics into routine clinical practice.

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification and microarray hybridization into a single chamber, which significantly streamlines microarray workflow for the end user. Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments.

Dimostrazione di un multi-resistente ai farmaci<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Amplificazione Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the etiological agent of TB, is refractory to rapid and lasting chemotherapy due to the presence of bacilli exhibiting phenotypic drug resistance. The charcoal agar resazurin assay (CARA) was developed as a tool to characterize active molecules discovered by high-throughput screening campaigns against replicating and non-replicating M. tuberculosis. Inclusion of activated charcoal in bacteriologic agar medium helps mitigate the impact of compound carry-over, and eliminates the requirement to pre-dilute cells prior to spotting on CARA microplates. After a 7-10 day incubation period at 37 &#176;C, the reduction of resazurin by mycobacterial microcolonies growing on the surface of CARA microplate wells permits semi-quantitative assessment of bacterial numbers via fluorometry. The CARA detects approximately a 2-3 log10 difference in bacterial numbers and predicts a minimal bactericidal concentration leading to &#8805;99% bacterial kill (MBC&#8805;99). The CARA helps determine whether a molecule is active on bacilli that are replicating, non-replicating, or both. Pilot experiments using the CARA facilitate the identification of which concentration of test agent and time of compound exposure require further evaluation by colony forming unit (CFU) assays. In addition, the CARA can predict if replicating actives are bactericidal or bacteriostatic.

The charcoal agar resazurin assay (CARA) is a semi-quantitative, medium-throughput method to assess activity of test agents against mycobacteria that are replicating, non-replicating, or both. The CARA permits rapid evaluation of time- and concentration-dependent activity and identifies parameters to pursue by colony forming unit (CFU) assays.

Visualizzazione del carbone Agar resazurina Assay per semi-quantitativa, medio-throughput enumerazione dei micobatteri

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

Sistema per l&#39;efficacia e la citotossicità Proiezione di inibitori di targeting intracellulare<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Un test compatibile high-throughput per valutare Drug efficacia contro macrofagi diversi passaggi<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method

As rates of multidrug-resistant (MDR) pathogens continue to rise, outpacing the development of new antimicrobials, novel approaches to treatment of MDR bacteria are increasingly becoming a necessity. One such approach is combination therapy, in which two or more antibiotics are used together to treat an infection against which one or both of the drugs may be ineffective alone. When two drugs, in combination, exert a greater than additive effect, they are considered synergistic. In vitro investigation of synergistic activity is an important first step in evaluating the possible efficacy of drug combinations. Two main in vitro synergy testing methods have been developed: the checkerboard array and the time-kill study. In this paper, we present an automated checkerboard array method that makes use of inkjet printing technology to increase the efficiency and accuracy of this technique, as well as a standard manual time-kill synergy method. The automated checkerboard array can serve as a high-throughput screening assay, while the manual time-kill study provides additional, complementary data on synergistic activity and killing.
The checkerboard array is a modification of standard minimum inhibitory concentration (MIC) testing, in which bacteria are incubated with antibiotics at different concentration combinations and evaluated for growth inhibition after overnight incubation. Manual performance of the checkerboard array requires a laborious and error-prone series of calculations and dilutions. In the automated method presented here, the calculation and dispensing of required antibiotic stock solution volumes are automated through the use of inkjet printer technology. In the time-kill synergy assay, bacteria are incubated with the antibiotics of interest, both together and individually, and sampled at intervals over the course of 24 h for quantitative culture. The results can determine whether a combination is synergistic and whether it is bactericidal, and provide data on inhibition and killing of bacteria over time.

Antimicrobial synergy testing is used to evaluate the effect of two or more antibiotics used in combination and is typically performed by one of two methods: the checkerboard array or the time-kill assay. Here, we present an automated, inkjet printer-assisted checkerboard array synergy technique and a classic time-kill synergy study.

Antimicrobica sinergia test di stampante a getto d'inchiostro-assistita Checkerboard automatizzato matrice e il metodo di Time-kill manuale

As rates of multidrug-resistant (MDR) pathogens continue to rise, outpacing the development of new antimicrobials, novel approaches to treatment of MDR ...

An Automated Culture System for Use in Preclinical Testing of Host-Directed Therapies for Tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of tuberculosis (TB), was the most significant infectious disease killer globally until the advent of COVID-19. Mtb has evolved to persist in its intracellular environment, evade host defenses, and has developed resistance to many anti-tubercular drugs. One approach to solving resistance is identifying existing&#160;approved drugs that will boost the host immune response to Mtb. These drugs could then be repurposed as adjunctive host-directed therapies (HDT) to shorten treatment time and help overcome antibiotic resistance.
Quantification of intracellular Mtb growth in macrophages is a crucial aspect of assessing potential HDT. The gold standard for measuring Mtb growth is counting colony-forming units (CFU) on agar plates. This is a slow, labor-intensive assay that does not lend itself to rapid screening of drugs. In this protocol, an automated, broth-based culture system, which is more commonly used to detect Mtb in clinical specimens, has been adapted for preclinical screening of host-directed therapies. The capacity of the liquid culture assay system to investigate intracellular Mtb growth in macrophages treated with HDT was evaluated. The HDTs tested for their ability to inhibit Mtb growth were all-trans Retinoic acid (AtRA), both in solution and encapsulated in poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microparticles and the combination of interferon-gamma and linezolid. The advantages of this automated liquid culture-based technique over the CFU method include simplicity of setup, less labor-intensive preparation, and faster time to results (5-12 days compared to 21 days or more for agar plates).

Rapid and efficient quantification of intracellular M. tuberculosis growth is crucial for pursuing improved therapies against tuberculosis (TB). This protocol describes a broth-based colorimetric detection assay using an automated liquid culture system to quantify Mtb growth in macrophages treated with candidate host-directed therapies.

Un sistema di coltura automatizzato da utilizzare nei test preclinici di terapie dirette all'ospite per la tubercolosi

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of tuberculosis (TB), was the most significant infectious disease killer globally until the advent ...

<meta charset="utf8"></head><body>Saggio di screening ad alto rendimento per Mycobacterium abscessus utilizzando doppi reporter

Assay Development for High-Throughput Drug Screening Against Mycobacteria

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. Treatments are extremely ineffective and based on a multi-drug regimen, resulting in low patient compliance. Consequently, the scientific community is urged to identify new and effective drugs to treat these infections. One of the strategies employed to this end is drug repurposing - the process of identifying new therapeutic opportunities for existing drugs in the market, circumventing the time required to establish pharmacokinetic and safety profiles of new drugs. With most studies on drug development against Mab relying on traditional and time-consuming methods, an assay for high-throughput drug screening was developed against mycobacteria using an in house developed double-reporter strain of Mab. Using liquid-handling robotics, automated microscopy, and analysis, alongside in house developed double reporter strains, bacterial viability can be rapidly measured using two different readouts, luminescence and fluorescence, without adding reagents or performing any extra steps. This reduces time and variability between assays, a major advantage for high-throughput screenings. The described protocol was validated by screening a library of 1280 compounds. The obtained results were corroborated by the literature, with efficient detection of active compounds. Thus, this work fulfilled the aim of supplying the field with a new tool to help fight this extremely drug-resistant bacteria.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Protocollo scalabile di screening farmacologico per la scoperta efficiente dei trattamenti con M. abscessus

This study developed an assay for high-throughput screening against Mycobacterium abscessus with a&#160;recently created double reporter strain, using fluorescence and luminescence to assess bacterial viability quickly. This protocol will be relevant for researchers aiming to screen new drugs against this drug-resistant bacteria.

Sviluppo di saggi per lo screening di farmaci ad alto rendimento contro i micobatteri

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. ...

Test di suscettibilità antimicrobica del complesso Mycobacterium tuberculosis delle droghe prima e seconda linea per diluizione brodo in un formato micropiastra

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Crescita Mycobacterium tuberculosis I biofilm

Il metodo MODS per la diagnosi di tubercolosi e di tubercolosi multiresistente

Dimostrazione di un multi-resistente ai farmaci

Visualizzazione del carbone Agar resazurina Assay per semi-quantitativa, medio-throughput enumerazione dei micobatteri

Sistema per l'efficacia e la citotossicità Proiezione di inibitori di targeting intracellulare

Un test compatibile high-throughput per valutare Drug efficacia contro macrofagi diversi passaggi

Antimicrobica sinergia test di stampante a getto d'inchiostro-assistita Checkerboard automatizzato matrice e il metodo di Time-kill manuale

Un sistema di coltura automatizzato da utilizzare nei test preclinici di terapie dirette all'ospite per la tubercolosi

Sviluppo di saggi per lo screening di farmaci ad alto rendimento contro i micobatteri

Sviluppo di saggi per lo screening di farmaci ad alto rendimento contro i micobatteri