Il ITSN, PI3K-C2β, e vettori di controllo utilizzati in questo protocollo sono disponibili presso gli autori, su richiesta, per scopi non commerciali solo. Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Chang-Deng Hu per la gentile consulenza e dei reagenti utilizzati per stabilire il protocollo BiFC in laboratorio O&#39;Bryan. KAW è stata sostenuta da un finanziamento della Fondazione Jerome Lejeune. Lavoro in laboratorio O&#39;Bryan è sostenuto da finanziamenti della (HL090651) NIH, DOD (PR080428), la Fondazione San Baldrick, e la Fondazione Jerome Lejeune.

A. BiFC calibrazione <ol><li> Scegli un fluoroforo. Fluorofori Ci sono molteplici, come ad esempio YFP e Venere, che funzionano bene come BiFC partner di fusione (Tabella 1). Estremità amino-e carbossi-terminale di Venere sono in grado di formare un complesso a 37 ° C, mentre i frammenti BiFC YFP richiedono una pre-incubazione a 30 ° C al fine di facilitare la formazione di fluoroforo 2. Questo incubazione a bassa temperatura può alterare alcuni processi cellulari e dovrebbero essere presi in considerazione quando si sceglie frammenti. Vettori per la fusione Venere al carbossi-terminale di proteine ​​sono disponibili presso Addgene ( <a href="http://www.addgene.org/pgvec1">http://www.addgene.org/pgvec1</a> ; seepBiFC-VN173 e pBiFC-VC155) insieme a costrutti aggiuntivi per l&#39;uso come controlli, ad esempio, <a href="http://www.addgene.org/pgvec1?f=c&amp;identifier=22012&amp;atqx=BiFC&amp;cmd=findpl">pBiFC-bJunVN173</a> e pBiFC-bFosVC155 2. Ulteriori vettori, tra cui amino-terminale vettori di Venere (pFLAG-VN173 e Pha-VC155), sono disponibili sul seguente sito: <a href="http://people.pnhs.purdue.edu/%7Ehu1/">http://people.pnhs.purdue.edu/ hu1 ~ /</a> . </li><li> Etichetta la proteina di interesse. BiFC I frammenti sono fusi alle estremità amino-e carbossi-terminale delle proteine ​​candidato. Alcune proteine ​​non possono consentire tagging alle estremità a causa di distorsioni della funzione della proteina. Per esempio, molti membri della superfamiglia delle GTPasi Ras sono lipidi modificati al carbossi-terminale precludendo così l&#39;attaccamento dei frammenti BiFC a tal fine. Quindi, è importante avere un&#39;idea di come l&#39;attaccamento dei frammenti BiFC possono influenzare la funzione delle proteine ​​di interesse. Se non è chiaro come tagging una proteina influenza la sua funzione di molteplici combinazioni devono essere testati. Oltre al frammento BiFC, un linker peptide può essere incluso per aumentare la flessibilità tra il fluoroforo frammentato e le proteine ​​candidato. Mentre i siti clonazione multipla (MCS) nei vettori BiFC codificare brevi tratti di aminoacidi che possono fornire una sufficiente flessibilità, la RSIAT, KQKVMNH, e linker RPACKIPNDLKQKVMNH sono stati utilizzati con successo in esperimenti BiFC 3,9 </li><li> Determinare le condizioni di trasfezione. Prima di testare mutanti multipli, un paio di esperimenti di controllo deve essere eseguito. Le prime due combinazioni BiFC che dovrebbero essere processati sono due proteine ​​wild-type che sono noti per interagire e una wild-type e mutanti che non interagiscono. L&#39;utilizzo di questi due combinazioni, diverse quantità di DNA e tempi di transfezione dovrebbero essere testati per determinare le condizioni ottimali per la rilevazione di un segnale BiFC per le proteine ​​candidato. Vi consigliamo di test 0.25ug, 0.5ug, 1.0ug di ciascun costrutto BiFC per un singolo bene di un piatto ben 6. Il giorno dopo la trasfezione le cellule monitorare al microscopio a fluorescenza per determinare il tempo ottimale per lo sviluppo del segnale. Il <a href="http://www.addgene.org/pgvec1?f=c&amp;identifier=22012&amp;atqx=BiFC&amp;cmd=findpl">pBiFC-bJunVN173</a> e pBiFC-bFosVC155 2 costrutti sono utili controlli positivi per BiFC e sono disponibili da Addgene (vedi sopra). Inoltre, l&#39;analisi Western Blot deve essere eseguita per confermare l&#39;espressione pari dei costrutti. Condizioni devono essere scelto in modo che un segnale di fluorescenza si osserva tra le due proteine ​​wild-type, ma poco o nessun segnale si osserva tra il tipo selvaggio e le proteine ​​mutanti. Infine, è meglio tenere espressione della proteina più basso possibile per evitare interazioni non specifiche. </li><li> Determinare se l&#39;aggiunta dei frammenti BiFC altera la localizzazione delle proteine ​​di interesse. Ogni costruire BiFC contiene sia un epitopo HA o tag BANDIERA. Immunostain transefected cellule sia per l&#39;epitopo HA o tag FLAG così come anche la proteina endogena (se possibile) per determinare se il tag BiFC riguarda la localizzazione delle proteine ​​di interesse. </li></ol> B. Placcatura e Transfection delle cellule <ol><li> Cellule COS (1.3x10 5) sono placcati ciascuno su una piastra inferiore di vetro Matek e due pozzi di un 6-pozzetti per campione. Consentono alle cellule di riposare una notte a 37 ° C. Tipi di cellule alternative più rilevanti per le proteine ​​candidato di interesse possono anche essere utilizzati. </li><li> Preparare DNA per trasfezione. Noi di solito utilizzare Lipofectamine (Invitrogen) per trasfezioni COS. Tuttavia, altri reagenti può essere più appropriato per la linea cellulare di interesse. Dal momento che la miscela di trasfezione sarà diviso tra un piatto fondo di vetro e due pozzi di un 6-pozzetti, utilizzare la giusta quantità di DNA per tenere conto di questa divisione. Diluire DNA in 250uL di siero libero (SF) DMEM. Aggiungi PCP a 1 / 5 del numero totale di DNA BiFC come controllo trasfezione. Per la quantificazione BiFC, solo le cellule che sono positivi per PCP saranno analizzati per la presenza di un segnale BiFC. Da notare che gli spettri PCP sovrapposizione con alcune delle coppie BiFC nella tabella 1, quindi un controllo alternativo trasfezioneforse necessario. Diluire Lipofectamine in 250uL SF DMEM (10uL Lipofectamine/1ug del DNA). Mescolare il DNA e le diluizioni Lipofectamine. Incubare a temperatura ambiente per 20 min. Nota: Il Lipofectamine: rapporto di DNA può variare a seconda del tipo di cellula. Utilizzare il metodo appropriato per la trasfezione della linea cellulare di interesse. </li><li> Lavare le cellule 2x con caldi SF DMEM. Aggiungere 2 ml di SF DMEM per ogni piatto fondo di vetro o anche di un 6-ben piatto. </li><li> Dividere ogni miscela di trasfezione in modo uniforme tra un piatto fondo di vetro e due pozzi di un 6-ben piatto. </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C per 5 ore. </li><li> Rimuovere i supporti di trasfezione e sostituirli con i media completo (DMEM +10% FBS). </li><li> Cellule incubare una notte a 37 ° C. La lunghezza della transfezione fase di incubazione varia a seconda dei livelli di espressione delle proteine ​​di interesse. Incubazione prolungata può risultare non in modo specifico l&#39;interazione questa fase dovranno essere determinati empiricamente. </li></ol> C. La preparazione di cellule per l&#39;imaging <ol><li> Le cellule sono inizialmente esaminati al microscopio epifluorescente per garantire che il controllo positivo è fluorescente. In caso contrario, può essere necessario per dare il tempo supplementare le cellule a 37 ° C fino a quando il segnale viene osservato. </li><li> Lavare le cellule 3x con PBS (pH 7,4). Alle cellule nel piatto fondo di vetro aggiungere 2% paraformaldeide (pH 7,4). Fissare le cellule per 10 minuti sul ghiaccio. Lavare le cellule 3x con PBS (pH 7,4). Conservare le cellule a 4 ° C coperto con 1 ml di PBS (pH 7,4). Cellule non devono essere fissati per l&#39;imaging, ma una volta che i frammenti BiFC riforma uno fluoroforo intatto è irreversibile analisi impedendo così di interazioni dinamiche 3. Inoltre, tenete a mente che le cellule non fissate continuerà a sviluppare segnale. Lisare le cellule del 6 ben piatto e preparare lisati per l&#39;analisi Western Blot. E &#39;importante che tutte le cellule sono preparati allo stesso tempo in modo che le cellule lisate sono rappresentativi delle cellule immagine. </li></ol> D. Imaging Cellule <ol><li> L&#39;intensità della fluorescenza sarà calcolata per cella. Assicurati di cellule singole immagini. </li><li> PCP è stato incluso come controllo tranfection e soltanto le cellule positive PCP vengono selezionati per l&#39;analisi dei segnali BiFC. Facciamo l&#39;ipotesi che se la cella è transfettate con PCP, è anche trasfettate con i costrutti BiFC. Questo approccio garantisce che le cellule immaginato che la mancanza di un segnale BiFC sono negativi a causa della mancanza di una interazione tra le proteine ​​di interesse e non a causa di mancanza di uno o entrambi i costrutti di espressione BiFC in quella cella. </li><li> Usiamo un Zeiss LSM 510 microscopio confocale per l&#39;imaging cellulare. Quando si utilizza questo microscopio è importante mantenere lo zoom, foro stenopeico, il guadagno del rivelatore, amplificatore offset, dimensione del frame, velocità di scansione, media scansione e potenza del laser coerente. Quando si utilizza un qualsiasi sistema di imaging è importante mantenere le impostazioni costante in modo che la fluorescenza è comparabile tra i campioni. Inoltre, nel quantificare la fluorescenza è importante che i pixel non sono saturi. </li></ol> E. Quantificare fluorescenza <ol><li> Fluorescenza può essere quantificato con qualsiasi software di imaging. Utilizziamo ImageJ, che è liberamente disponibile presso il NIH (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Aprire file di immagine in ImageJ. Vai a misure AnalyzeSet. Selezionare le caselle per l&#39;Area e il valore medio grigio nella finestra di misure. </li><li> Utilizzando lo strumento &#39;selezione a mano libera&#39;, tracciare un contorno intorno al bordo della cella intera nel canale PCP. </li><li> Lasciando questo schema in atto, spostamento verso il canale YFP. Vai a AnalyzeMeasure. Il valore medio Gray è la somma dei valori di grigio di tutti i pixel della selezione diviso per il numero di pixel (cioè, l&#39;intensità media di fluorescenza per area della cellula). </li><li> Per ogni immagine disegnare un cerchio nel canale YFP in una zona che non contiene una cella. Effettuare una misurazione per questa area come sfondo. Sottrarre lo sfondo di ogni immagine. </li><li> Media il valore medio grigio meno lo sfondo per tutte le celle ripreso in un campione. Questo sarà l&#39;intensità media di fluorescenza per una popolazione di cellule. Vi suggeriamo di circa 60 cellule in tre esperimenti devono essere quantificati. </li></ol> F. Rappresentante dei risultati: Il nostro laboratorio si concentra sul multi-dominio proteico ponteggi, intersectin (ITSN) che interagisce con numerose proteine ​​di regolare molteplici vie biochimiche e segnalazione 10,11,12,13,14. ITSN contiene due Eps15 omologia (EH) i domini, una regione avvolto a spirale, e cinque omologia Src 3 (SH3) domini. L&#39;isoforma più di ITSN contiene anche omologia Dbl (DH) e Pleckstrin omologia (PH) i domini che agiscono in concerto come un fattore di scambio del nucleotide guanina per Cdc42 15. Questa struttura modulare promuove la proteina: interazioni proteina e ITSN rende un candidato ideale per esperimenti di BiFC. La localizzazione subcellulare di ITSN possono alterare i suoi partner vincolante e pertanto alterare le vie regolato da ITSN (unpublished dati). Recentemente, il nostro laboratorio ha dimostrato che ITSN regola la sopravvivenza neuronale attraverso la regolamentazione di un romanzo di classe II PI3K, PI3K-C2β 11. L&#39;amino-terminale pro-dominio ricco di PI3K-C2β contiene due siti di legame per ITSN di SH3 domini. Mediante co-immunoprecipitazione con ITSN e PI3K-C2β mutanti troncamento abbiamo dimostrato che è ITSN SH3A e domini SH3C interagire con la regione amino-terminale di PI3K-C2β. Successivamente, abbiamo usato BiFC per visualizzare la localizzazione subcellulare di questo complesso. ITSN era fuso con la amino-terminale di Venere (pFLAG-VN173) e PI3K-C2β costruisce fuso al carbossi-terminale di Venere (PHA-VC155). Come ulteriore controllo negativo, un non-specifico peptide è stata fusa a Pha-VC155. VN-ITSN e VC-PI3K-C2β formato un complesso BiFC con una distribuzione punteggiano (Figura 2A, pannelli superiori). Le mutazioni nel dominio Pro-ricco di PI3K-C2β che distruggono co-precipitazione di ITSN e PI3K-C2β diminuito il segnale BiFC (Figura 2A, pannelli inferiori) 11. Questa differenza di segnale tra BiFC ITSN e le due PI3K-C2β proteine ​​non è dovuto a differenze di espressione della proteina (Figura 2B). <img src="/files/ftp_upload/2643/2643fig1.jpg" alt="Figura 1" /> . Figura 1 In BiFC, un fluoroforo (in questo caso Venere) è diviso in aminoacidi (VN) - e carbossi (VC)-terminale finisce. Questi fini si fondono per due proteine ​​di interesse. Quando le due proteine ​​interagiscono, i frammenti VN e VC riassociare conseguente ricostituzione del fluoroforo e la fluorescenza nei siti di interazione. BiFC è un esempio specifico del test di complementazione proteica frammento (APC) utilizzato per misurare la proteina: interazioni delle proteine ​​5. <img src="/files/ftp_upload/2643/2643fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. ITSN e PI3K-C2β formano un complesso BiFC. A. VN-tagged ITSN è stato co-tranfected con VC-tagged PI3K-C3β WT o prolina ricco di dominio mutante (PI3K-C2β-PA). ITSN e WT-PI3K C2β formano un complesso (verde). PCP (rosso) è stato utilizzato come controllo di transfezione B. è stato effettuato un Western Blot per dimostrare espressione pari dei costrutti. Il VC-tagged costrutti HA tag. <img src="/files/ftp_upload/2643/2643table1.jpg" alt="Tabella 1" /> Tabella 1. Ci sono diversi vettori che sono compatibili con BiFC. YN155: 1-155aa di YFP; YC155: 155-238aa di YFP; YN173: 1-172aa di YFP; YC173, 173-238aa di YFP; VN155: 1-154aa di Venere; VC155: 155-238 di Venere; VN173: 1-172aa di Venere; VC173: 173-238aa di Venere; CN155 1-154aa della PCP; CC155 155-238aa della PCP, GN173: 1-172aa di GFP, CitN155: 1-155aa di Citrino, CitC155: 155-238aa di citrino, CitN173: 1-172aa di Citrino, CitC173: 173-238aa di Citrino, CerN173: 1-172aa di Cerulean 2,3,9.

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	<li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+molecular+interactions+by+fluorescence+complementation.">Visualization of molecular interactions by fluorescence complementation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 449-456 (2006).</li><li>Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+fluorescent+protein+fragments+for+bimolecular+fluorescence+complementation+analysis+under+physiological+conditions.">Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions.</a> Biotechniques. 40, 61-66 (2006).</li><li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol Cell. 9, 789-798 (2002).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Michnick, S. W., Remy, I., Campbell-Valois, F. X., Vallee-Belisle, A., Pelletier, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+protein-protein+interactions+by+protein+fragment+complementation+strategies.">Detection of protein-protein interactions by protein fragment complementation strategies.</a> Methods Enzymol. S328, 208-230 (2000).</li><li>Michnick, S. W., MacDonald, M. L., Westwick, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetic+strategies+to+delineate+MAP+kinase+signaling+pathways+using+protein-fragment+complementation+assays+(PCA).">Chemical genetic strategies to delineate MAP kinase signaling pathways using protein-fragment complementation assays (PCA).</a> Methods. 40, 287-293 (2006).</li><li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+FRET:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends Biochem Sci. 32, 407-414 (2007).</li><li>Ciruela, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+methods+in+the+study+of+protein-protein+interactions+in+living+cells.">Fluorescence-based methods in the study of protein-protein interactions in living cells.</a> Curr Opin Biotechnol. 19, 338-343 (2008).</li><li>Hu, C. D., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multiple+protein+interactions+in+living+cells+using+multicolor+fluorescence+complementation+analysis.">Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis.</a> Nat Biotechnol. 21, 539-545 (2003).</li><li>Martin, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersectin+regulates+epidermal+growth+factor+receptor+endocytosis,+ubiquitylation,+and+signaling.">Intersectin regulates epidermal growth factor receptor endocytosis, ubiquitylation, and signaling.</a> Mol Pharmacol. 70, 1643-1653 (2006).</li><li>Das, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neuron+survival+through+an+intersectin-phosphoinositide+3'-kinase+C2beta-AKT+pathway.">Regulation of neuron survival through an intersectin-phosphoinositide 3'-kinase C2beta-AKT pathway.</a> Mol Cell Biol. 27, 7906-7917 (2007).</li><li>Mohney, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersectin+activates+Ras+but+stimulates+transcription+through+an+independent+pathway+involving.">Intersectin activates Ras but stimulates transcription through an independent pathway involving.</a> JNK. J Biol Chem. 278, 47038-47045 (2003).</li><li>Tong, X. K., Hussain, N. K., Adams, A. G., O'Bryan, J. P., McPherson, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersectin+can+regulate+the+Ras/MAP+kinase+pathway+independent+of+its+role+in+endocytosis.">Intersectin can regulate the Ras/MAP kinase pathway independent of its role in endocytosis.</a> J Biol Chem. 275, 29894-29899 (2000).</li><li>Adams, A., Thorn, J. M., Yamabhai, M., Kay, B. K., O'Bryan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersectin+an+adaptor+protein+involved+in+clathrin-mediated+endocytosis,+activates+mitogenic+signaling+pathways.">Intersectin an adaptor protein involved in clathrin-mediated endocytosis, activates mitogenic signaling pathways.</a> J Biol Chem. 275, 27414-27420 (2000).</li><li>O'Bryan, J. P., Mohney, R. P., Oldham, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitogenesis+and+endocytosis:+What's+at+the+INTERSECTIoN?.">Mitogenesis and endocytosis: What's at the INTERSECTIoN?.</a> Oncogene. 20, 6300-6308 (2001).</li><li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+AP-1+NF-kappaB+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET.">Visualization of AP-1 NF-kappaB ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 151-156 (2008).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

BiFC è un metodo eccellente per la visualizzazione di proteine: interazioni proteina nelle cellule intere e determinare la localizzazione subcellulare di questi complessi. I vantaggi di BiFC sono solo le proteine ​​che interagiscono sono fluorescenti, le interazioni transitorie sono stabilizzate, e post-processing dei dati di imaging è minimo. Due gli svantaggi di questo metodo sono il tempo di maturazione per l&#39;fluoroforo e l&#39;irreversibilità del complesso fluoroforo. In alcune applicazioni di questa irreversibilità può essere utilizzato come un vantaggio. Per esempio, si può usare un enzima e un attivatore di questo enzima nel complesso BiFC, con conseguente attivazione costitutiva. Si potrebbe poi determinare quali proteine ​​sono reclutati per questo complesso. Inoltre, l&#39;irreversibilità del complesso BiFC consente l&#39;identificazione delle interazioni deboli o transitori. Adeguati controlli sono importanti per l&#39;interpretazione di esperimenti BiFC. Vuoto vettori BiFC non dovrebbe essere usato come controllo come risultato di questi reagenti in fluorescenza di fondo elevato. Adeguati controlli includono l&#39;utilizzo di una mutazione in una delle proteine ​​di interesse che è noto per bloccare l&#39;interazione delle due proteine. Una proteina non correlate che non deve complesso con la proteina di interesse possono anche essere utilizzati. E &#39;anche importante che l&#39;analisi Western blot viene eseguita per assicurare che l&#39;espressione dei costrutti diversi è uguale e che le differenze nel segnale fluorescente non sono dovuti a diversi livelli di espressione della proteina. Alta espressione può anche portare a non specifiche interazioni e fluorescenza, e quindi livelli di espressione deve essere mantenuto relativamente basso. BiFC è un metodo pratico che è prontamente combinata con altre tecniche di fluorescenza. Per esempio, BiFC può essere combinata con immunofluorescenza standard di co-localizzazione di esaminare i complessi trimolecular anche se questo approccio è ancora nei limiti risoluzione del microscopio confocale. Recenti studi hanno combinato BiFC con FRET per consentire l&#39;analisi di complessi trimolecular di fattori di trascrizione 16. Per questa applicazione, una proteina CFP tag viene utilizzato come donatore e il complesso BiFC viene utilizzato come accettore (cioè YFP, Venere). Questo approccio consente il monitoraggio temporale di un complesso proteico e una proteina interagisce terzo di interesse. Queste combinazioni di tecniche permettono una grande versatilità nelle applicazioni della tecnologia BiFC per determinare le proteine: interazioni proteina. Definire la localizzazione di complessi proteici nella cellula è essenziale per decifrare i processi fisiologici. Così, BiFC rappresenta un ottimo strumento di aiutare questa comprensione.

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		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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		<tbody>
		
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>10-013</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal bovine serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>35-011-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Bottom Microwell dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Matek</td>
<td>P35G-1.5-14C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6-well dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>35-3846</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipofectamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18324020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>21-031-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Confocal Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>LSM510 META</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

bimolecular fluorescence complementation

Definire la distribuzione subcellulare di complessi di segnalazione è fondamentale per comprendere l&#39;output di quel complesso. Metodi convenzionali come immunoprecipitazione non forniscono informazioni sulla localizzazione spaziale dei complessi. Al contrario, BiFC controlla l&#39;interazione e la compartimentazione subcellulare di complessi proteici. In questo metodo, una proteina fluororescent è suddivisa in amino-e carbossi-terminale non fluorescente frammenti che vengono poi fuse per due proteine ​​di interesse. Interazione dei risultati proteine ​​ricostituzione del fluoroforo (Figura 1) 1,2. Una limitazione di BiFC è che una volta che il fluoroforo frammentato è ricostituito il complesso è irreversibile 3. Questa limitazione è vantaggioso nel rilevare interazioni transitoria o deboli, ma esclude l&#39;analisi cinetica di dinamiche complesse. Un ulteriore avvertimento è che il flourophore ricostituito richiede 30 minuti di maturare e di fluorescenza, di nuovo precludendo l&#39;osservazione di interazioni in tempo reale 4. BiFC è un esempio specifico del test di complementazione proteica frammento (PCA), che impiega proteine ​​giornalista come varianti proteina fluorescente verde (BiFC), la diidrofolato reduttasi, b-lattamasi, e luciferasi per misurare le proteine: interazioni proteina 5,6. Metodi alternativi per lo studio delle proteine: interazioni proteina nelle cellule includono fluorescenza co-localizzazione e Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) 7. Per la co-localizzazione, due proteine ​​sono contrassegnati individualmente o direttamente con un fluoroforo o mediante immunofluorescenza indiretta. Tuttavia, questo approccio porta a di fondo di non interagenti proteine ​​che lo rende difficile da interpretare co-localizzazione dei dati. Inoltre, a causa dei limiti di risoluzione della microscopia confocale, due proteine ​​possono apparire co-localizzati senza necessariamente interagire. Con BiFC, fluorescenza è osservato solo quando le due proteine ​​di interesse interagire. FRET è un altro ottimo metodo per lo studio delle proteine: interazioni delle proteine, ma possono essere tecnicamente difficile. FRET esperimenti richiedono il donatore e accettore di essere di luminosità simili e stechiometria nella cella. Inoltre, si deve tenere conto di sanguinare tramite del donatore nel canale accettore e viceversa. A differenza di FRET, BiFC ha poco fluorescenza di fondo, poco dopo l&#39;elaborazione dei dati di immagine, non richiede l&#39;iperespressione alto, e in grado di rilevare le interazioni deboli o transitorie. Risonanza trasferimento bioluminescenza energia (BRET) è un metodo simile a FRET tranne il donatore è un enzima (luciferasi ad esempio) che catalizza un substrato per diventare bioluminescenti così emozionante un accettore. BRET mancano i problemi tecnici di sanguinare attraverso e fluorescenza di fondo alto, ma manca la capacità di fornire informazioni spaziali a causa della mancanza di localizzazione del substrato ai compartimenti specifici 8. Nel complesso, BiFC è un metodo eccellente per la visualizzazione di localizzazione subcellulare di complessi proteici al fine di conoscere segnalazione compartimenti stagni.

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Bimolecular Fluorescence Complementation

La localizzazione subcellulare delle proteine ​​è importante nel determinare la regolazione spazio-temporale di segnalazione cellulare. Qui, descriviamo biomolecolare complementazione fluorescenza (BiFC) come un metodo semplice per il monitoraggio delle interazioni spaziali delle proteine ​​all&#39;interno della cellula.

Bimolecolari complementazione fluorescenza

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as ...

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

27.8K Views.  University of Illinois at Chicago. La localizzazione subcellulare delle proteine ​​è importante nel determinare la regolazione spazio-temporale di segnalazione cellulare. Qui, descriviamo biomolecolare complementazione fluorescenza (BiFC) come un metodo semplice per il monitoraggio delle interazioni spaziali delle proteine ​​all'interno della cellula.

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Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Time-lapse imaging di mitosi dopo la trasfezione di siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Ricerca

Biologia

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Biomolecolare fluorescenza complementazione (BiFC) Assay per interazione proteina-proteina nelle cellule Cipolla Utilizzando la Helios Gun Gene

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

Elettrosaldabili cellula visualizzate con microscopia a fluorescenza

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein (YFP) into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest. These constructs can then be co-transformed into Nicotiana benthamiana via Agrobacterium mediated transformation, allowing the transit expression of fusion proteins. The reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact 1-7. To test and validate the protein-protein interactions, BiFC can be used together with yeast two hybrid (Y2H) assay. This may detect indirect interactions which can be overlooked in the Y2H. Gateway technology is a universal platform that enables researchers to shuttle the gene of interest (GOI) into as many expression and functional analysis systems as possible8,9. Both the orientation and reading frame can be maintained without using restriction enzymes or ligation to make expression-ready clones. As a result, one can eliminate all the re-sequencing steps to ensure consistent results throughout the experiments. We have created a series of Gateway compatible BiFC and Y2H vectors which provide researchers with easy-to-use tools to perform both BiFC and Y2H assays10. Here, we demonstrate the ease of using our BiFC system to test protein-protein interactions in N. benthamiana plants.

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a technique to test protein-protein interactions in plant. A yellow fluorescent protein (YFP) is split into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest via Gateway system, enabling expression of fusion proteins. Reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact.

Rilevamento delle interazioni proteiche in pianta utilizzando un gateway compatibile complementazione fluorescenza biomolecolare (BiFC) Sistema

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

Cryosectioning Yeast Communities for Examining Fluorescence Patterns

Microbes typically live in communities. The spatial organization of cells within a community is believed to impact the survival and function of the community1. Optical sectioning techniques, including confocal and two-photon microscopy, have proven useful for observing spatial organization of bacterial and archaeal communities2,3. A combination of confocal imaging and physical sectioning of yeast colonies has revealed internal organization of cells4. However, direct optical sectioning using confocal or two-photon microscopy has been only able to reach a few cell layers deep into yeast colonies. This limitation is likely because of strong scattering of light from yeast cells4.
Here, we present a method based on fixing and cryosectioning to obtain spatial distribution of fluorescent cells within Saccharomyces cerevisiae communities. We use methanol as the fixative agent to preserve the spatial distribution of cells. Fixed communities are infiltrated with OCT compound, frozen, and cryosectioned in a cryostat. Fluorescence imaging of the sections reveals the internal organization of fluorescent cells within the community.
Examples of yeast communities consisting of strains expressing red and green fluorescent proteins demonstrate the potentials of the cryosectioning method to reveal the spatial distribution of fluorescent cells as well as that of gene expression within yeast colonies2,3. Even though our focus has been on Saccharomyces cerevisiae communities, the same method can potentially be applied to examine other microbial communities.

We present a protocol for freezing and cryosectioning yeast communities to observe internal patterns of fluorescent cells. The method relies on methanol-fixing and OCT-embedding to preserve the spatial distribution of cells without inactivating fluorescent proteins within a community.

Criosezionamento Comunità di lievito per l&#39;esame di pattern di fluorescenza

Microbes typically live  in communities. The spatial organization  of cells within a community is believed to impact the survival and function of the  ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

L&#39;analisi citofluorimetrica di bimolecular Complementation Fluorescenza: A High Throughput Metodo quantitativo per studiare l&#39;interazione proteina-proteina

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

Interazioni proteina-proteina visualizzati tramite bimolecular complementazione fluorescenza in protoplasti di tabacco e foglie

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

In tempo reale Imaging del singolo Engineered RNA trascritti in cellule viventi Utilizzando Ratiometric bimolecolari Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in the x-y plane. Here a summary of the FIONA technique is reported and examples of research that have been performed using FIONA are briefly described. First, how to set up the required equipment for FIONA experiments, i.e., a total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), with details on aligning the optics, is described. Then how to carry out a simple FIONA experiment on localizing immobilized Cy3-DNA single molecules using appropriate protocols, followed by the use of FIONA to measure the 36 nm step size of a single truncated myosin Va motor labeled with a quantum dot, is illustrated. Lastly, recent effort to extend the application of FIONA to thick samples is reported. It is shown that, using a water immersion objective and quantum dots soaked deep in sol-gels and rabbit eye corneas (&#62;200 &#181;m), localization precision of 2-3 nm can be achieved.

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Single fluorophores can be localized with nanometer precision using FIONA. Here a summary of the FIONA technique is reported, and how to carry out FIONA experiments is described.

Imaging di fluorescenza con One nanometri Precisione (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

Genome-wide proteina-proteina interazione Screening per Protein-frammento Complementation Assay (PCA) in cellule viventi

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...