Vorrei ringraziare il Dipartimento di Ricerca e Studi Laurea per fornire fondi per sostenere la mia ricerca e del Dipartimento di Medicina comparativa per la vigilanza e l&#39;assistenza. Vorrei anche a riconoscere il Dipartimento di Fisiologia per il loro sostegno e la guida così come gli studenti e tecnici nel mio laboratorio per il loro aiuto. Infine, vorrei ringraziare il mio post-dottorato mentore, il Dr. Charles E. Murry, per l&#39;opportunità di formazione durante i quali ho imparato il microchirurgia del mouse.

<ol><li> Sterili strumenti chirurgici (Tabella 1) e 3 &quot;applicatori di cotone con punta sono disposti su un underpad sterile. Lo sterilizzatore tallone (Germinator 500) è acceso. </li><li> Topi (età:&gt; 6 settimane, peso:&gt; 18g) sono anestetizzati con una iniezione ip di 20μl / g BW di tribromoethanol (250mg/kg, durata - circa 40 minuti). </li><li> Quando i topi non rispondono alla punta pizzico, un lubrificante sterile (Tears rinnovata) è applicato agli occhi per proteggerli dalla disidratazione e il lato sinistro del petto è rivestita con depilatorio (ad esempio Nair) per rimuovere pelo dalla pelle. </li><li> Il depilatoria viene lavato via con acqua corrente calda e betadine / alcool tampone è usato per disinfettare l&#39;area chirurgica. </li><li> Il mouse è posizionato su una calda pad DeltaPhase isotermici che è fissato a un tavolo di plexiglass. Ogni arto è immobilizzato con del nastro e un filo spesso viene posta orizzontalmente sotto i denti superiori per tenere la mascella superiore al suo posto. </li><li> Il tavolo è in posizione verticale e una luce a fibre ottiche è brillato direttamente sulla regione del collo per l&#39;illuminazione transesofagea. Ciò richiede un posizionamento preciso in modo che l&#39;apertura della gola è visto come un orifizio ben illuminato, permettendo così la trachea da visualizzare per facilitare l&#39;inserimento del tubo in PE. </li><li> Il tubo viene poi collegato al ventilatore (collegato ad un 95% O 2 / 5% di CO 2) per amministrare costante ventilazione a pressione positiva (TOPO ventilatore; tasso di 125 atti / min, picco di pressione inspiratoria 10-12 cm H 2 O; nota * : le impostazioni variano a seconda ceppo e sesso 1-3). Una volta che la ventilazione è confermata dai movimenti del torace sincrono, la connessione è fissato per il pad con del nastro adesivo per evitare estubazione durante l&#39;intervento. </li><li> Utilizzando pinze a denti per tirare la pelle in alto e lontano dal petto, una lama # 10 bisturi sterile collegato ad un manico # 3 bisturi viene utilizzato per fare un&#39;incisione 1,5 centimetri in parallelo pelle allo sterno. </li><li> Curve microscissors Vanna sono usati per tagliare i muscoli pettorali e fare un piccolo buco nel muscolo intercostale. </li><li> Dritto, microscissors smussato sono usati per tagliare a 3 costole. </li><li> Uno speculum 9 millimetri oftalmico pediatrica è utilizzata per ritirare la gabbia toracica. </li><li> Utilizzando la pinza curva, tirare il pericardio lontano dal cuore e usare la pinza dentata di strappare delicatamente aperta. </li><li> Utilizzando la porta aghi Castroviejo, un punto di 6 millimetri conico 3 / 8 fili degli aghi del 8-0 sutura polietilene sotto discendente anteriore dell&#39;arteria coronarica (lungo l&#39;asse del cuore) perpendicolare ad esso. <ol><li> Per una legatura temporanea che può essere rimossa per riperfusione a tempo, una sterile 0,5-1cm pezzo di PE90 è posto sul cuore in parallelo per l&#39;arteria coronaria. La sutura, che è stato prima in loop sotto l&#39;arteria coronaria, viene poi legata al tubo. Nel momento in cui deve essere rilasciata, la legatura è allentato. Questo può essere ripetuto a piacere e il tempo di occlusione / riocclusione può essere modificata 4. A seconda della lunghezza del protocollo e il tipo di anestesia utilizzato, l&#39;integrazione può essere necessario. </li><li> Per una occlusione permanente, la legatura cucita sotto l&#39;arteria coronaria è semplicemente legato. Sbiancamento e discinesia sono evidenti e l&#39;estremità lunga della sutura viene tagliato 5-10. </li><li> Per l&#39;iniezione intramiocardico (s), una siringa sterile Hamilton con un ago sterile da 30 gauge smussato è introdotto nella base del cuore sopra l&#39;area di lesione sul lato destro della legatura. L&#39;ago viene poi avanzate nella zona di lesione e ritirata leggermente in modo che la smussatura può essere visto circa nella zona di confine. Alcune delle soluzione nella siringa (2-3μl) viene iniettato nel cuore e l&#39;ago viene tenuto in posizione. La siringa è ritirato un altro 1-3mm e il resto della soluzione viene iniettata. La siringa è tenuto in posizione fino a quando il bleb che è formato dalla soluzione dissipa. L&#39;ago viene poi rimossa. Se non vi è alcun sanguinamento, un cotton-applicatore con la punta è leggermente premuto sul sito inserimento dell&#39;ago fino a quando il sanguinamento si ferma 5-7. </li></ol></li><li> Una volta che le manipolazioni del miocardio sono state completate, la costola divaricatori vengono rimosse e la cavità toracica è chiuso con 2-3 punti di sutura materasso utilizzando 6-0 sutura surgipro. </li><li> Due-tre punti di sutura materasso sono poi messi a chiudere i muscoli pettorali, 1-3 gocce del 0,25% 1:10 marcaine in soluzione salina sterile (mouse 0.1ml/25g) viene applicato al muscolo e poi 2-3 suture materassi sono fatti per chiudere la pelle. </li><li> Il mouse viene rimosso dal ventilatore. Una volta respirazione ritmica, rapido, poco profondo è verificata, il mouse può essere estubato. </li><li> 0,5 ml soluzione salina calda sterile viene iniettata nello spazio sottocutaneo dorsale e il mouse è posizionato su un blocco del riscaldamento in una gabbia fino a quando non riprende la mobilità (minimo 1 ora). </li><li> Per gli esperimenti di sopravvivenza, i topi sono rimessi nelle loro gabbie e restituita al vivaio fino al momento del sacrificio. Durante i primi 2 giorni, il cibo è inumiditoimmessi sul pavimento della gabbia per facilitare l&#39;alimentazione (in modo da non dover arrivare fino che possono provocare dolore) e la buprenorfina deve essere somministrato ogni 6-12h. Post-operatorio comprende anche il monitoraggio quotidiano per la prima settimana per verificare la mobilità adeguata, governare, e le abitudini alimentari. </li><li> Gli strumenti chirurgici sono puliti con etanolo e inserita nel tallone sterilizzatore prima dell&#39;intervento successivo. </li><li> Al momento del sacrificio, i topi vengono anestetizzati con sodio pentobarbital (65mg/ml; 55-65 mg / kg). Quando un piano adeguato di anestesia viene raggiunto, la cavità toracica è aperta. </li><li> Mentre il cuore batte ancora, una siringa con un ago 23 gauge contenente cloruro di potassio a freddo (KCl, 30 mm) o 2,3-butanedione monoxime (BDM; 10mM) viene utilizzato per forare la regione posteriore basale del ventricolo e la soluzione è lentamente iniettato nella camera fino a quando il cuore è arrestato in diastole. </li><li> Una volta che il cuore è rimosso, una siringa contenente PBS viene utilizzato per perfusione retrograda lavare il cuore per rimuovere il sangue che rimane. Per gli studi acuti, alla fine del periodo di riperfusione, il LAD è ri-legatura nel punto di occlusione originale. Una soluzione contenente 1% di Evan blu viene iniettato nell&#39;aorta. Una volta che il cuore è estratto, è tagliato trasversalmente in 3 sezioni di uguale spessore, incubate in 1% 2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro, e ripreso per le analisi morfometriche 11. Per gli studi cronici, il cuore viene poi immerso in fissativo, poi elaborati e integrati secondo le procedure di routine. Le diapositive possono essere colorati istologicamente e ripreso per l&#39;analisi morfometrica (utilizzando Scion, NIH immagine J, o Image Pro Plus) 9,10,12. </li></ol> Rappresentante dei risultati: Se fatto correttamente, i tassi di sopravvivenza nei topi (maschi: età 8-10 settimane, 22-28g; femmine: età 10-12 settimane, 20-26g) sono: oltre il 90% in acuto ischemia / riperfusione e precondizionamento ischemico esperimenti, oltre 85% in studi permanente legatura dell&#39;arteria, e circa il 80% per iniezioni intramiocardiche. Dal trauma precoce è più visibile da cambiamenti metabolici piuttosto che strutturale, la determinazione dimensione infartuale in ischemia / riperfusione e ischemico esperimenti precondizionamento viene eseguita infondendo l&#39;1% di Evan colorante blu in aorta che perfusione del cuore che non è fornito dal LAD ( Figura 1A). Una volta che il cuore viene rimosso e trasversalmente tagliato a metà, il tessuto è incubato in 1% di soluzione di cloruro di 2,3,5-trifeniltetrazolio per misurare la dimensione dell&#39;infarto (Figura 1B). Le aree sono misurati utilizzando Scion o NIH software di imaging che può essere calibrato utilizzando un micrometro fotografato allo stesso ingrandimento. Questi numeri sono usati per calcolare l&#39;area a rischio / ventricolo sinistro e infarto dimensioni / area a rischio 11. Differenze di ceppo può portare a variazioni di peso corporeo e le dimensioni del cuore e quindi occorre prestare attenzione a queste misure per normalizzare il peso del cuore, peso corporeo, o la lunghezza della tibia ai fini comparativi. Permanente risultati legatura dell&#39;arteria lordo cambiamenti strutturali quali necrosi, parete assottigliamento e dilatazione della camera. Confronto degli effetti del trattamento e / o temporali dell&#39;infarto e necrosi rispetto al ventricolo sinistro, zona camera, parete sinistra del setto e spessore della parete ventricolare libera nel modello occlusione permanente (Figura 2A) può essere misurata utilizzando Scion o NIH di imaging software. Colorazione del collagene con picrosirius rosso / verde veloce (Figura 2B) può essere utilizzato per misurare la fibrosi insterstitial che è correlato agli indici funzionali di 8-10 irrigidimento della parete. L&#39;immagine in Figura 3 rappresenta la distribuzione della soluzione 6ul (Evan blu) iniettato nella zona di confine del cuore dopo legatura dell&#39;arteria permanente. Si noti che si procede nella direzione della lesione così come verso la base e anche transmurally. <img src="/files/ftp_upload/2581/2581fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. A. Evan &#39;s Blu iniettata nell&#39;aorta prima escissione. Questa immagine mostra le regioni perfusi del cuore (macchiato) e la zona occlusa (senza macchia). Evan B.&#39; s Blue e colorazione TTC acuta da ischemia / riperfusione. Questa è un&#39;immagine rappresentativa (20x) che mostra la distribuzione colorante blu che macchiato le regioni non occluse così come colorazione TTC del tessuto metabolicamente vitali (rosso). Aree necrotiche non macchia e così rimangono pallidi (descritto). <img src="/files/ftp_upload/2581/2581fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. A. ematossilina e eosina. Questa è un&#39;immagine rappresentativa (20x) della colorazione H &amp; E di un cuore topo tagliati trasversalmente in tutta la regione infarto a 4 giorni dopo l&#39;infarto miocardico (20x). Il * denota necrosi dei tessuti, le frecce indicano tessuto di granulazione, RV = ventricolo destro e ventricolo LV = sinistra. B. Picrosirius rosso e veloce verde macchia. Si tratta di unrappresentante immagine (20x) di picrosirius rosso / veloce colorazione verde di una sezione del cuore del mouse a 4 settimane post-infarto miocardico. Il verde citoplasma macchie e le fibre di collagene sono rossi. <img src="/files/ftp_upload/2581/2581fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Blu di Evan distribuzione colorante macchia seguenti 6ul iniezione intramiocardico. Questa è un&#39;immagine rappresentativa che mostra la distribuzione globale e transmurale della tintura blu di Evan tutto il cuore segue 6ul iniezione intramiocardico alla zona di confine subito dopo la legatura dell&#39;arteria coronaria (12x).

Questo protocollo è stato approvato dal animale ed è conforme alle linee guida e regolamenti stabiliti dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa alla East Carolina University.

Malattia coronarica continua ad essere un epidemiologico e fiscalmente rilevante problema di sanità pubblica. Notevole la ricerca di base è ancora necessaria per capire i meccanismi con cui lesioni e rimodellamento procedere e come potenziali terapie possono modulare questi processi, se si vuole essere sviluppate per uso clinico. Roditori sono più comunemente utilizzati e la vasta gamma di topi geneticamente modificati, rende disponibile questa specie un modello più attraente. Anche se ci sono differenze tra topi e altre specie, ci sono molti vantaggi a un modello murino. L&#39;uso di un ambito semplice dissezione o lente d&#39;ingrandimento e condizioni ben illuminata per consentire la vascolarizzazione facilmente essere visto (per informazioni dettagliate anatomia del sistema vascolare, vedere Salto-Téllez et al., 2004 13). Per ridurre il rischio di mortalità post-operatoria, è molto importante evitare di recidere vasi di grandi dimensioni in quanto il volume totale del sangue di un topo 25g è inferiore a 2 ml 14. In caso di eccessivo sanguinamento si verifica, l&#39;applicazione delicata di pressione o cauterizzazione individuare può essere usato per fermare l&#39;emorragia. Questa procedura può anche essere modificata in diversi modi. Per esempio, i topi possono essere anestetizzati con isoflurano, ketamina / xylazina, o sodio pentobarbital e un&#39;adeguata selezione è determinata dalla durata del protocollo 15-18. La punta pizzico riflesso è l&#39;indice più utilizzato della profondità dell&#39;anestesia. Inoltre, per aumentare la probabilità di sopravvivenza a lungo termine, alcuni ricercatori utilizzano farmaci antiaritmici, come lidocaina per ridurre l&#39;incidenza di aritmie letali 19,20 però, si deve tener conto che questo è stato di recente dimostrato di avere proprietà antiapoptotiche in un acuto modello 21. Inoltre, per ridurre il dolore post-operatorio, analgesici come la buprenorfina può essere somministrato per le prime 48 ore dopo l&#39;intervento 3,16,17,22,23. Per mantenere la temperatura corporea durante l&#39;intervento chirurgico (soprattutto per i più protocolli), una sonda rettale in serie con una piastra elettrica è spesso usato al posto del pad isotermici. Per ischemia / riperfusione e / o pre-ischemico o postconditioning: la durata dell&#39;occlusione (s) e riperfusione (s) può essere modificata, per occlusione permanente, la dimensione dell&#39;infarto può essere modificato regolando la posizione della legatura; e per le iniezioni intramiocardiche (es. cellule, proteine), ci possono essere posizioni di iniezione 1-3 e il volume per iniezione può essere fino a 15 microlitri 24. Se le cellule vengono iniettate, il calibro dell&#39;ago utilizzato (di solito 26-30) 5,25,26 deve essere scelto in base alle dimensioni delle celle in modo che il diametro interno dell&#39;ago è grande abbastanza per evitare Sheering. Per evitare confonde a causa di processi infiammatori innescati da l&#39;intervento, alcuni ricercatori hanno riferito di usare una trappola che viene manipolato ex vivo per occludere e reperfuse il cuore in petto un topo chiuso in qualsiasi momento dopo l&#39;intervento chirurgico 27-29. Più recentemente, Gao et al. 30 hanno dimostrato che l&#39;occlusione temporanea e permanente può essere eseguito senza la necessità di ventilazione e di alcuni laboratori hanno iniziato ad utilizzare gli ultrasuoni per eseguire chiuso petto intramiocardico iniezioni 25,31. Dal momento che il primo studio che dimostrano la fattibilità di legatura dell&#39;arteria coronarica nei topi è stato pubblicato da Johns e Olson nel 1954 32, molti altri hanno adottato questo modello e modificato per studiare vari aspetti del danno miocardico e rimodellamento 3,33-45. La natura di topi in termini di dimensioni, capacità riproduttiva, e relativamente meno spese per l&#39;acquisto e la manutenzione rendono questa specie uno strumento interessante per una vasta gamma di studi fisiologici e fisiopatologici. Come la miniaturizzazione della tecnologia per l&#39;imaging in vivo degli anticipi 46-49, così come mezzo per eseguire ed analizzare su larga scala genomica e proteomica, screening di farmaci, l&#39;efficacia di terapie basate sulle cellule e / o di proteine ​​così come biomateriali 50-64, combinato con la gamma sempre più ampia di manipolazioni genetiche offerta da topi specifiche ubiquitaria o tessuto transgenici o mutanti / eliminazione diretta, il modello murino di infarto miocardico senza dubbio continuerà ad essere uno strumento prezioso nella valutazione lesione acuta rimodellamento cardiaco e lungo termine. Pertanto, non vi è valore indiscutibile di essere in grado di effettuare questi esperimenti in modo affidabile e riproducibile.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Long Vanna Scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>George Tiemann</td>
<td>160-159</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro Dissecting Scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>George Tiemann</td>
<td>160-161</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Forceps &#x2013; straight, 1x2 teeth</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>George Tiemann</td>
<td>105-205</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Scalpel handle #3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>George Tiemann</td>
<td>105-64</td>
<td>#10 sterile blade</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps &#x2013; half curved serrated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>George Tiemann</td>
<td>160-19</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue Scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>George Tiemann</td>
<td>105-410</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Castroviejo Needle Holder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltex</td>
<td>18-1828</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cook Eye Speculum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltex</td>
<td>18-63</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Surgipro II 8-0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Suture Express</td>
<td>VP-900-X</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Prolene 6-0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Suture Express</td>
<td>8776</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Germinator 500 Bead Sterilizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellpoint Scientific</td>
<td>65369-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Deltaphase isothermal pad</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Braintree Scientific</td>
<td>39DP</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hamilton syringe - 25&mu;l</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton</td>
<td>80430</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>30 gauge beveled needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton</td>
<td>7803-07</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ventilator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kent Scientific</td>
<td>TOPO</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo. With the advent of genetic modifications to the whole organism or the myocardium and an array of biological and/or synthetic materials, there is great potential for any combination of these to assuage the extent of acute ischemic injury and impede the onset of heart failure pursuant to myocardial remodeling. 
Here we present the methods and materials used to reliably perform this microsurgery and the modifications involved for temporary (with reperfusion) or permanent coronary artery occlusion studies as well as intramyocardial injections. The effects on the heart that can be seen during the procedure and at the termination of the experiment in addition to histological evaluation will verify efficacy. 
Briefly, surgical preparation involves anesthetizing the mice, removing the fur on the chest, and then disinfecting the surgical area. Intratracheal intubation is achieved by transesophageal illumination using a fiber optic light. The tubing is then connected to a ventilator. An incision made on the chest exposes the pectoral muscles which will be cut to view the ribs. For ischemia/reperfusion studies, a 1 cm piece of PE tubing placed over the heart is used to tie the ligature to so that occlusion/reperfusion can be customized. For intramyocardial injections, a Hamilton syringe with sterile 30gauge beveled needle is used. When the myocardial manipulations are complete, the rib cage, the pectoral muscles, and the skin are closed sequentially. Line block analgesia is effected by 0.25% marcaine in sterile saline which is applied to muscle layer prior to closure of the skin. The mice are given a subcutaneous injection of saline and placed in a warming chamber until they are sternally recumbent. They are then returned to the vivarium and housed under standard conditions until the time of tissue collection. At the time of sacrifice, the mice are anesthetized, the heart is arrested in diastole with KCl or BDM, rinsed with saline, and immersed in fixative. Subsequently, routine procedures for processing, embedding, sectioning, and histological staining are performed. 
Nonsurgical intubation of a mouse and the microsurgical manipulations described make this a technically challenging model to learn and achieve reproducibility. These procedures, combined with the difficulty in performing consistent manipulations of the ligature for timed occlusion(s) and reperfusion or intramyocardial injections, can also affect the survival rate so optimization and consistency are critical.

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Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction

Numerose manipolazioni genetiche e / o iniezioni intramiocardiche di geni, proteine, cellule e / o biomateriali si sovrappongono la dimensione del tempo negli studi di acuta ischemia / riperfusione e rimodellamento cronica nel topo. Questo video illustra le procedure di microchirurgia per ischemia / riperfusione, permanente legatura delle arterie coronarie, e gli studi di iniezione intramiocardico.

Legatura dell&#39;arteria coronarica e di iniezione intramiocardico in un modello murino di infarto

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo.  With the advent of genetic modifications to ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

51.9K Views.  East Carolina University. Numerose manipolazioni genetiche e / o iniezioni intramiocardiche di geni, proteine, cellule e / o biomateriali si sovrappongono la dimensione del tempo negli studi di acuta ischemia / riperfusione e rimodellamento cronica nel topo. Questo video illustra le procedure di microchirurgia per ischemia / riperfusione, permanente legatura delle arterie coronarie, e gli studi di iniezione intramiocardico.

Video: Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction

Modified Technique for Coronary Artery Ligation in Mice

Myocardial infarction (MI) is one of the most important causes of mortality in humans1-3. In order to improve morbidity and mortality in patients with MI we need better knowledge about pathophysiology of myocardial ischemia. This knowledge may be valuable to define new therapeutic targets for innovative cardiovascular therapies4. Experimental MI model in mice is an increasingly popular small-animal model in preclinical research in which MI is induced by means of permanent or temporary ligation of left coronary artery (LCA)5. In this video, we describe the step-by-step method of how to induce experimental MI in mice.
The animal is first anesthetized with 2% isoflurane. The unconscious mouse is then intubated and connected to a ventilator for artificial ventilation. The left chest is shaved and 1.5 cm incision along mid-axillary line is made in the skin. The left pectoralis major muscle is bluntly dissociated until the ribs are exposed. The muscle layers are pulled aside and fixed with an eyelid-retractor. After these preparations, left thoracotomy is performed between the third and fourth ribs in order to visualize the anterior surface of the heart and left lung. The proximal segment of LCA artery is then ligated with a 7-0 ethilon suture which typically induces an infarct size ~40% of left ventricle. At the end, the chest is closed and the animals receive postoperative analgesia (Temgesic, 0.3 mg/50 ml, ip). The animals are kept in a warm cage until spontaneous recovery.

The surgical procedure used to induce experimental myocardial infarction in mice begins with left thoracotomy between the third and the fourth ribs in order to visualize the anterior surface of the heart and left lung. The left coronary artery is ligated, the chest is closed and the mouse is allowed to recover spontaneously.

Tecnica modificata di legatura dell&#39;arteria coronarica in Mouse

Myocardial infarction (MI) is one of the most important causes of mortality in humans1-3. In order to improve morbidity and mortality in patients with MI ...

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A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms at work during MI and developing effective therapeutic approaches requires methodology to reproducibly simulate the clinical incidence and reflect the pathophysiological changes associated with MI. Here, we describe a surgical method to induce MI in mouse models that can be used for short-term ischemia-reperfusion (I/R) injury as well as permanent ligation. The major advantage of this method is to facilitate location of the left anterior descending artery (LAD) to allow for accurate ligation of this artery to induce ischemia in the left ventricle of the mouse heart. Accurate positioning of the ligature on the LAD increases reproducibility of infarct size and thus produces more reliable results. Greater precision in placement of the ligature will improve the standard surgical approaches to simulate MI in mice, thus reducing the number of experimental animals necessary for statistically relevant studies and improving our understanding of the mechanisms producing cardiac dysfunction following MI. This mouse model of MI is also useful for the preclinical testing of treatments targeting myocardial damage following MI.

We introduce a surgical method to induce experimental ischemia/reperfusion (I/R) injury to simulate myocardial infarction (MI) in mouse models that allows for more clarity in positioning of the ligation on the left anterior descending artery (LAD) to increase the reproducibility of MI experiments in mice.

Un modello murino di ischemia miocardica e riperfusione lesioni da legatura della arteria discendente anteriore sinistra

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms ...

Ultrasound-guided Transthoracic Intramyocardial Injection in Mice

Murine models of cardiovascular disease are important for investigating pathophysiological mechanisms and exploring potential regenerative therapies. Experiments involving myocardial injection are currently performed by direct surgical access through a thoracotomy. While convenient when performed at the time of another experimental manipulation such as coronary artery ligation, the need for an invasive procedure for intramyocardial delivery limits potential experimental designs. With ever improving ultrasound resolution and advanced noninvasive imaging modalities, it is now feasible to routinely perform ultrasound-guided, percutaneous intramyocardial injection. This modality efficiently and reliably delivers agents to a targeted region of myocardium. Advantages of this technique include the avoidance of surgical morbidity, the facility to target regions of myocardium selectively under ultrasound guidance, and the opportunity to deliver injectate to the myocardium at multiple, predetermined time intervals. With practiced technique, complications from intramyocardial injection are rare, and mice quickly return to normal activity on recovery from anesthetic. Following the steps outlined in this protocol, the operator with basic echocardiography experience can quickly become competent in this versatile, minimally invasive technique.

Echocardiography-guided percutaneous intramyocardial injection represents an efficient, reliable, and targetable modality for the delivery of gene transfer agents or cells into the murine heart. Following the steps outlined in this protocol, the operator can quickly become competent in this versatile, minimally invasive technique.

Ultrasound-guided transtoracica intramiocardico iniezione nei topi

Murine models of cardiovascular disease are important for investigating pathophysiological mechanisms and exploring potential regenerative therapies. ...

Permanent Ligation of the Left Anterior Descending Coronary Artery in Mice: A Model of Post-myocardial Infarction Remodelling and Heart Failure

Heart failure is a syndrome in which the heart fails to pump blood at a rate commensurate with cellular oxygen requirements at rest or during stress. It is characterized by fluid retention, shortness of breath, and fatigue, in particular on exertion. Heart failure is a growing public health problem, the leading cause of hospitalization, and a major cause of mortality. Ischemic heart disease is the main cause of heart failure.
Ventricular remodelling refers to changes in structure, size, and shape of the left ventricle. This architectural remodelling of the left ventricle is induced by injury (e.g., myocardial infarction), by pressure overload (e.g., systemic arterial hypertension or aortic stenosis), or by volume overload. Since ventricular remodelling affects wall stress, it has a profound impact on cardiac function and on the development of heart failure. A model of permanent ligation of the left anterior descending coronary artery in mice is used to investigate ventricular remodelling and cardiac function post-myocardial infarction. This model is fundamentally different in terms of objectives and pathophysiological relevance compared to the model of transient ligation of the left anterior descending coronary artery. In this latter model of ischemia/reperfusion injury, the initial extent of the infarct may be modulated by factors that affect myocardial salvage following reperfusion. In contrast, the infarct area at 24 hr after permanent ligation of the left anterior descending coronary artery is fixed. Cardiac function in this model will be affected by 1) the process of infarct expansion, infarct healing, and scar formation; and 2) the concomitant development of left ventricular dilatation, cardiac hypertrophy, and ventricular remodelling.
Besides the model of permanent ligation of the left anterior descending coronary artery, the technique of invasive hemodynamic measurements in mice is presented in detail.

Heart failure is the leading cause of hospitalization and a major cause of mortality. A model of permanent ligation of the left anterior descending coronary artery in mice is applied to investigate ventricular remodelling and cardiac dysfunction post-myocardial infarction. The technique of invasive hemodynamic measurements in mice is presented.

Legatura permanente dell&#39;arteria discendente anteriore sinistra coronarica nei topi: un modello di post-infarto rimodellante miocardico e insufficienza cardiaca

Heart failure is a syndrome in which the heart fails to pump blood at a rate commensurate with cellular oxygen requirements at rest or during stress. It ...

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow reserve (CFR) in humans. Reduced CFR is accompanied by marked intramyocardial and pericoronary fibrosis and is used as an indication of the severity of dysfunction. This study explores, step-by-step, the real-time changes measured in the coronary flow velocity, CFR and systolic to diastolic peak velocity (S/D) ratio in the setting of an aortic banding model in mice. By using a Doppler transthoracic imaging technique that yields reproducible and reliable data, the method assesses changes in flow in the septal coronary artery (SCA), for a period of over two weeks in mice, that previously either underwent aortic banding or thoracotomy. 
During imaging, hyperemia in all mice was induced by isoflurane, an anesthetic that increased coronary flow velocity when compared with resting flow. All images were acquired by a single imager. Two ratios, (1) CFR, the ratio between hyperemic and baseline flow velocities, and (2) systolic (S) to diastolic (D) flow were determined, using a proprietary software and by two independent observers. Importantly, the observed changes in coronary flow preceded LV dysfunction as evidenced by normal LV mass and fractional shortening (FS). 
The method was benchmarked against the current gold standard of coronary assessment, histopathology. The latter technique showed clear pathologic changes in the coronary artery in the form of peri-coronary fibrosis that correlated to the flow changes as assessed by echocardiography. 
The study underscores the value of using a non-invasive technique to monitor coronary circulation in mouse hearts. The method minimizes redundant use of research animals and demonstrates that advanced ultrasound-based indices, such as CFR and S/D ratios, can serve as viable diagnostic tools in a variety of investigational protocols including drug studies and the study of genetically modified strains.

Coronary flow reserve (CFR) is useful for assessment of myocardial oxygen demand and evaluation of cardiovascular risk. This study establishes a step-by-step transthoracic Doppler echocardiographic (TTDE) method for longitudinal monitoring of the changes in CFR, as measured from coronary artery in mice, under the experimental pressure overload of aortic banding.

Valutazione Ecografia base di coronaropatia Flow e flusso coronarico Reserve Utilizzando la pressione Sovraccarico modello nei topi

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow ...

Murine Left Anterior Descending (LAD) Coronary Artery Ligation: An Improved and Simplified Model for Myocardial Infarction

Ischemic heart disease (IHD), or acute coronary syndrome (ACS), is one of the leading causes of death in the United States. IHD is characterized by reduced blood supply to the heart, resulting in the loss of oxygen to and the ensuing necrosis of the heart muscle. The MI model has gained popularity for its use as a short-term ischemia-reperfusion model and a long-term permanent ligation model. Below, we describe a reliable method for the permanent ligation of the LAD. With mouse genetic engineering technology becoming more advanced, and with an increasing availability of quality murine surgical instruments, the mouse has become a popular model for MI surgeries. Our surgical model incorporates the use of an easily reversible anesthetic for the rapid recovery of the mouse; a minimally invasive endotracheal intubation without involving a tracheotomy; and a thoracentesis through the original thoracotomy site without creating an additional incision in the chest, as is done in some other methods, to effectively remove excess blood and air from the chest cavity. This method is comparatively less invasive than other methods, which dramatically reduces surgical and post-surgical complications and mortality and improves reproducibility.

Murine Left Anterior Descending LAD Coronary Artery Ligation: An Improved and Simplified Model for Myocardial Infarction

We provide a reliable method for left anterior descending artery (LAD) ligation in a mouse model. This method is comparatively less invasive than other methods, involving endotracheal intubation, a left-sided thoracotomy approach, and thoracentesis. This method can be used as a model for both acute and chronic myocardial infarction (MI).

Murino discendente anteriore sinistra (LAD) Coronary legatura dell&#39;arteria: una migliore e semplificata del modello di infarto miocardico

Ischemic heart disease (IHD), or acute coronary syndrome (ACS), is one of the leading causes of death in the United States. IHD is characterized by ...

Direct Re-implantation of Left Coronary Artery into the Aorta in Adults with Anomalous Origin of Left Coronary Artery from the Pulmonary Artery (ALCAPA)

Anomalous origin of the left coronary artery from the pulmonary artery (ALCAPA) is a rare congenital anomaly which is one of leading causes of myocardial ischemia and infarction in children. If left untreated, it results in a 90% mortality rate in the first year of life. In patients who survive to the adulthood, the coronary steal phenomenon and retrograde left-sided coronary flow provide a substrate for chronic subendocardial ischemia, which may lead to left ventricular dysfunction, ischemic mitral regurgitation, malignant ventricular arrhythmias, and sudden cardiac death. The average age of life-threatening presentation is 33 years and of sudden cardiac death 31 years. Therefore, surgical correction is highly recommended as soon as the diagnosis is made, regardless of age. In adult-type ALCAPA originating from the right-facing sinus of the pulmonary artery, direct re-implantation of the ALCAPA into the aorta is the more physiologically sound repair technique to re-establish the dual-coronary perfusion system and is recommended. This protocol describes the technique of direct re-implantation of adult-type ALCAPA into the aorta.

Direct Re-implantation of Left Coronary Artery into the Aorta in Adults with Anomalous Origin of Left Coronary Artery from the Pulmonary Artery ALCAPA

Surgical correction of ALCAPA is highly recommended, regardless of age or the degree of intercoronary collateralization. This protocol presents a technique for the direct re-implantation of adult-type ALCAPA into the aorta to re-establish the dual-coronary perfusion. Whenever feasible, direct re-implantation is preferred to other surgical correction techniques.

Diretto Re-impianto di sinistra coronarica nell&#39;aorta in Adulti con Anomala origine della coronaria sinistra dall&#39;arteria polmonare (ALCAPA)

Anomalous origin of the left coronary artery from the pulmonary artery (ALCAPA) is a rare congenital anomaly which is one of leading causes of myocardial ...

Percutaneous Contrast Echocardiography-guided Intramyocardial Injection and Cell Delivery in a Large Preclinical Model

Cell and gene therapy are exciting and promising strategies for the purpose of cardiac regeneration in the setting of heart failure with reduced ejection fraction (HFrEF). Before they can be considered for use, and implemented in humans, extensive preclinical studies are required in large animal models to evaluate the safety, efficacy, and fate of the injectate (e.g., stem cells) once delivered into the myocardium. Small rodent models offer advantages (e.g., cost effectiveness, amenability for genetic manipulation); however, given inherent limitations of these models, the findings in these rarely translate into the clinic. Conversely, large animal models such as rabbits, have advantages (e.g., similar cardiac electrophysiology compared to humans and other large animals), whilst retaining a good cost-effective balance. Here, we demonstrate how to perform a percutaneous contrast echocardiography-guided intramyocardial injection (IMI) technique, which is minimally invasive, safe, well tolerated, and very effective in the targeted delivery of injectates, including cells, into several locations within the myocardium of a rabbit model. For the implementation of this technique, we also have taken advantage of a widely available clinical echocardiography system. After putting in practice the protocol described here, a researcher with basic ultrasound knowledge will become competent in the performance of this versatile and minimally invasive technique for routine use in experiments, aimed at hypothesis testing of the capabilities of cardiac regenerative therapeutics in the rabbit model. Once competency is achieved, the whole procedure can be performed within 25 min after anaesthetizing the rabbit.

Novel therapeutic strategies in cardiac regenerative medicine require extensive and detailed studies in large preclinical animal models before they can be considered for use in humans. Here, we demonstrate a percutaneous contrast echocardiography-guided intramyocardial injection technique in rabbits, which is valuable for hypothesis testing the efficacy of such novel therapies.

L'iniezione intramiocardica ecocardiografia-guida percutanea contrasto e consegna delle cellule in un modello preclinico grande

Cell and gene therapy are exciting and promising strategies for the purpose of cardiac regeneration in the setting of heart failure with reduced ejection ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Misurazione di contrattilità isometrica dell'arteria mesenterica Mouse con filo Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine models of MI with permanent ligation of left-anterior descending (LAD) coronary artery closely mimics MI in humans. Murine models benefit from the extensive genetic engineering available nowadays. Here we propose a reproducible murine surgical model of myocardial infarction by permanent LAD coronary ligation. Our technique comprises anesthesia with ketamine/xylazine that can be rapidly reversed by administration of an antagonist, intubation without tracheotomy for mechanical-assisted ventilation, ventilation with application of extrinsic positive end-expiratory pressure (PEEP) to avoid alveolar collapse, a thoracotomy method limiting to the minimum surgical lesions made to skeletal muscles, and lung inflation without thoracentesis. This method is sparsely invasive, reproducible and reduces post-surgery mortality and complications.

Herein we describe a surgical procedure showing how to achieve permanent ligation of the left-anterior descending coronary artery in mice. This model is of high relevance to investigate the pathophysiology of myocardial infarction and the concomitant biological processes.

Modello di infarto miocardico Murine utilizzando la legatura permanente dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...