Gli autori desiderano ringraziare il Dott. Charles Luetje per la fornitura del T-labirinto e la sala comportamento. Questo lavoro è supportato dalla American Heart Association (a YA), l&#39;Istituto Nazionale per il Disturbo neurologici e colpo di Grant R01NS64269 (a RGZ), e Pew Charitable Trust (a RGZ).

1. Introduzione In questo video, ci mostrerà due saggi comportamentali utilizzando Drosophila per dimostrare la misura di locomozione e le funzioni di apprendimento e memoria che sono compromesse nei disordini neurodegenerative. In primo luogo, mostreremo come il comportamento motorio può essere misurata con il test negativo geotassi. In secondo luogo, si valuterà la capacità di apprendimento e la memoria vola utilizzando positivamente phototactic che sono addestrati ad associare la luce con un gusto amaro avversivo e poi testato 6 ore dopo per valutare le funzioni di memoria. Infine, si discutono le implicazioni ei limiti di questi test comportamento. 2. Attrezzature e reagenti <ol><li> Vola lavoro <ul><li> Ambito stereo (Zeiss) </li><li> Pennelli piccoli per spingere le mosche </li><li> Drosophila anidride carbonica (CO 2) dell&#39;apparecchio di anestesia (Geneseesci, Inc) </li></ul></li><li> Geotassi test negativo <ul><li> 28,5 x 95 polistirolo Vial mm (Capitol Vial, Inc.) </li><li> Mini-allarme timer / cronometro (VWR International) </li><li> Penne Sharpie </li><li> Nastro adesivo </li></ul></li><li> Avversiva fototassi Soppressione Assay <ul><li> Chinino cloridrato (Sigma Aldrich, numero CAS: 6119-47-7) </li><li> Acqua distillata </li><li> Digital scala di misurazione per la diluizione precisa in peso </li><li> Connettori rapidi Disconnetti, polietilene ad alta densità (Nalgene VWR Catalog No. 62868-021) </li><li> 15 Centrifuga Tubo mL (VWR International), tagliata in segno di 2 ml da fine chiuso per adattarsi con la Quick Disconnect adattatore connettore per fonte di luce </li><li> Singolo canale 200 pipetter microlitri per caricare soluzione di chinino su carta da filtro rivestimento della camera </li><li> T-Maze (Simple sistemi comportamentali; Figura 1) </li><li> Foglio di alluminio </li><li> Sorgente luminosa (Zeiss) </li><li> Una lampada con luce rossa. </li><li> Filtro di carta </li><li> Mini-allarme timer / cronometro (VWR International) </li></ul></li></ol> 3. Preparazione delle mosche <ul><li> Le mosche sono mantenuti su standard di farina di mais-agar-melassa, lievito di media a 25 ° C 12 ore su un ciclo luce / buio. </li><li> Vola Virgin sono isolati in anestesia anidride carbonica nel giorno della eclosion. Per gli studi di invecchiamento, le mosche sono mantenuti in gruppi di venti per fiala e trasferito in una fiala fresco ogni 3 giorni. E &#39;importante utilizzare le mosche fratello dalla croce stessa dei genitori per gli studi di invecchiamento, di minimizzare le differenze derivanti da substrato genetico. </li><li> Per entrambi i test, le mosche sono sessuato e mantenuti in gruppi di dieci mosche per flaconcino. La differenza di genere sul comportamento è significativo ed è consigliabile non mescolare le mosche maschio e femmina in uno studio di dati potrebbe essere difficile da interpretare e riprodurre 6. </li><li> Per il saggio di geotassi negativo, mosche vengono ordinate in gruppi di dieci per flaconcino e testato un&#39;ora dopo l&#39;anestesia. E &#39;importante per le mosche di recuperare completamente da anestesia in quanto ciò potrebbe avere un effetto sulle attività locomotoria. </li><li> Per il saggio di APS, vola di ogni gruppo vengono inseriti in una fiala vuota polistirolo inumidito con acqua carta da filtro per sei ore prima che il test viene eseguito. Questo assicura che le mosche sono affamati prima che il test e sarà più percettivo al gusto avverse. Poco prima del test viene eseguito, ogni volare da un gruppo di dieci è posto in una provetta vuota centrifuga 15 ml, che sono state limitate in modo impreciso, per evitare la fuga. </li></ul> 4. Geotassi test negativo <ul><li> Geotassi è generalmente misurata per 10-20 gruppi di dieci persone del genotipo stesso o di trattamento (100-200 vola totale per ciascun genotipo / trattamento) 7. Gruppi sorta di dieci mosche di sesso femminile o maschile per un apparato di CO 2 l&#39;anestesia e il luogo di ogni gruppo in un flaconcino a parte. Attendere almeno un&#39;ora per le mosche di recuperare da anestesia. </li><li> Preparare l&#39;apparato arrampicata per ogni gruppo, in modo che due fiale polistirolo vuote sono verticalmente uniti da nastro di fronte all&#39;altra. E &#39;importante assicurarsi che le aperture dei flaconcini sono perfettamente allineati tra loro per fornire una superficie piana di arrampicata per le mosche. </li><li> Per il flacone inferiore, misurare una distanza verticale di 8 cm al di sopra della superficie inferiore e contrassegnare ogni fiala disegnando un cerchio lungo l&#39;intero perimetro del flaconcino. </li><li> Trasferimento di un gruppo di dieci vola nel flacone inferiore attentamente impedire la fuga di una mosca. Coprire immediatamente il flacone inferiore con la fiala superiore e nastro in modo sicuro in prossimità del contatto con aperture. Lasciare le mosche per acclimatarsi alla nuova impostazione per 1 minuto prima di effettuare il test. </li><li> Battere delicatamente la vola verso il fondo del flaconcino e misurare il numero di mosche che possono salire sopra il marchio da 8 cm per 10 secondi dopo il rubinetto. </li><li> Ripetere questo test lo stesso gruppo dieci volte, consentendo periodo di riposo per 1 minuto tra ogni prova. </li><li> Registrare il numero di mosche per ogni gruppo che hanno superato gli 8 cm marchio come unpercentuale totale di mosche. </li></ul> 5. Avversiva fototassi saggio di soppressione (APS Assay) Originariamente adattato da Le Bourg e Buecher (2002) 4, questa analisi sfrutta il comportamento positivo phototactic in treno vola a loro di associarsi luce con stimoli avversi (in questo caso, il gusto amaro del chinino). Dopo una formazione / condizionamento fase, mosche wild-type in grado di associare l&#39;area illuminata con gusto repulsivo e evitarlo. Vola con compromessa capacità di apprendimento non riuscirà a fare questa associazione. Inoltre, il saggio APS può essere utilizzato anche per misurare la memoria a breve termine funzione di mosche 5 sottoponendo già vola addestrati per la stessa prova 6 ore dopo condizionamento per verificare la loro abilità nel ricordare il compito imparato. <ol><li> Preparazione della soluzione di chinino <ul><li> Sciogliere chinina cloridrato in acqua distillata per ottenere una soluzione 0,1 M magazzino (1.98g in 50mL di acqua distillata). Soluzione di riserva possono essere conservati a -20 ° C per un massimo di un anno in piccole aliquote </li><li> Preparare una soluzione di lavoro di 1 microM diluendo la soluzione madre in acqua distillata. </li></ul></li><li> Preparazione del T-Maze <ul><li> T-labirinto è costituito dalla colonna centrale con la botola e due camere indipendenti, una camera di &quot;dark&quot; e una camera &quot;illuminata&quot; (Figura 1). </li><li> Preparazione Camera: prendere due tubi 15ml centrifuga di plastica e tagliate a 2 ml marchio dal fondo chiuso concluderà con una sega manuale. Montare gli adattatori connettore ad ogni estremità, e sigillare il collegamento con parafilm. L&#39;adattatore alla fine del tubo serve come lo slot di ingresso per la sorgente di luce a collo d&#39;oca. Collegare un tubo con la sorgente di luce e questo tubo sarà la camera &quot;illuminata&quot;. Avvolgere il tubo altre con un foglio di alluminio per fungere da camera &quot;oscura&quot;. </li><li> Aggiungi 180uL o di acqua distillata o di soluzione di chinino per filtrare carta e porre in camera di luce. </li><li> Assemblare la T-labirinto avvitando le camere luminose e scure su ogni lato della colonna centrale, con la botola in mezzo chiuso (Figura 1). </li><li> Inserire la fonte di luce nella camera illuminata. </li></ul></li><li> Formazione vola a sopprimere fototassi con stimoli avversi <ul><li> Svitare la camera oscura dal T-labirinto e trasferire una mosca in questa camera e subito avvitare il tubo di nuovo al buio labirinto. </li><li> Spegnere le luci in sala e accendere la spia rossa. </li><li> Consentire al volo per acclimatare nella camera oscura per 30 secondi e lentamente accendere la fonte di luce illumina la camera illuminata. Aprire lentamente la botola che separa le due camere. </li><li> Se la mosca si dirige verso la camera illuminata entro 10 secondi, è considerato positivamente phototactic ed è pronto per essere addestrato per l&#39;analisi. Fallimento in fototassi indica problemi nel sistema visivo e vola con fototassi negativi devono essere esclusi dal test. </li><li> Per la soppressione avversivo fototassi (APS) la formazione, tocca al volo che ha dimostrato fototassi positivo ritorno alla camera oscura, chiudere la botola e spegnete la luce. Attendere 30 secondi di acclimatazione. Durante questo tempo mettere carta da filtro con una soluzione di chinino nella camera illuminata. Aprire lentamente la botola e accendere la luce. Lasciare che il cammino volare nella camera di chinino rivestito illuminata. Dopo un minuto, toccare il volo di ritorno alla camera oscura e ripetere questo 9 volte di più. (In genere, tipo selvatico vola evitare la camera illuminata dopo 3 o 5 studi di formazione.) </li><li> Immediatamente dopo l&#39;allenamento, cinque studi di prova sarà condotta. In ogni prova, prova, attendere 10 secondi dopo la luce è accesa per il volo addestrati a camminare verso la camera illuminata. Il mancato piedi dalla fiala illuminata sarà registrato come &quot;Pass&quot;, che equivale a &quot;compito appreso attraverso rinforzo&quot;. Il tasso Pass più di cinque prove consecutive viene registrato e mostrato sotto nella figura 2 come PC0 (0 condizionamento post ora). </li></ul></li><li> La valutazione a breve termine funzione di memoria in Flies <ul><li> Dopo una formazione iniziale e PC0 registrazioni, ogni volo è posto di nuovo nella sua fiala cibo originale e tenuti da parte per sei ore. </li><li> Sei ore di formazione post, sottopone ogni volare a 5 studi ancora allo stesso modo di prima, e registrare il numero di volte al volo evita (pass) o va in (non riuscito) il flacone illuminato. Questo tasso di passaggio viene registrato come PC6 (6 ore dopo condizionamento), che è un indicatore della memoria a breve termine. </li></ul></li></ol> 6. Interpretazione dei dati e analisi statistica <ol><li> Geotassi test negativo <ul><li> I dati grezzi generati da questa analisi rappresenta il numero di mosche che attraversano l&#39;8-cm marchio in 10 secondi in ogni gruppo. Convertire questa percentuale e per calcolare il tasso medio di passaggio per ogni gruppo di oltre 10 sessioni. </li><li> Dati sono rappresentati graficamente come un pass rate medio per gruppo (genotipo, trattamento, ecc) con l&#39;errore standard della media (SEM). </li><li> Differenze tra i gruppipuò essere determinata per essere statisticamente significativo o non si utilizza un test t di Student o ANOVA. </li></ul></li><li> Avversiva fototassi Soppressione Assay <ul><li> I dati grezzi di questa analisi è rappresentato come il numero di volte ogni volo evita la camera illuminata in cinque prove successive. Il tasso di passaggio è calcolato come la percentuale di prove evitare di successo nel corso degli studi clinici totale. Calcolare il tasso medio di passare in questo modo per un minimo di 15 mosche per gruppo. </li><li> I dati vengono rappresentati graficamente come il tasso medio di passare PC0 (subito dopo il condizionamento; indicatore di &quot;apprendimento&quot;) o il tasso medio di passare PC6 (6 ore dopo il condizionamento; indicatore &quot;memoria&quot;) con i rispettivi SEM. </li><li> Indici di apprendimento e memoria vengono confrontate tra i gruppi sia di tipo selvatico e &quot;geneticamente manipolati-benigno&quot; gruppo (come la GFP iperespressione di aria) in modo appropriato. </li></ul></li></ol> 7. Rappresentante Risultati In questo esperimento video, stiamo valutando deficit di apprendimento e la memoria e il motore nelle mosche iperespressione umano Tau nel sistema nervoso centrale e confrontando le loro prestazioni a quelle delle mosche overesprimenti GFP. Sovraespressione neuronale del Tau umani in Drosophila ha dimostrato di causare gravi vacuolizzazione nel cervello 8 e portare a significativi deficit di apprendimento e di funzioni di memoria 9. Come mostrato nella Figura 2A, 10 giorni maschio o femmina vola sovraesprimono umano Tau hanno deficit motorio significativo rispetto ai pari età GFP sovraesprimono mosche. Inoltre, queste mosche non associare la luce con gusto amaro come dimostrato dal tasso di PC0 passare rispetto al gruppo di controllo, così come non ricordare questa associazione, come indicato dalla diminuzione del tasso di passaggio PC6 (Figura 2B). Questo esperimento conferma ulteriormente che i modelli di Drosophila possono essere usati per studiare le malattie neurodegenerative umane e ricapitola alcuni dei fenotipi comportamentali osservati negli esseri umani e mammiferi. <img src="/files/ftp_upload/2504/2504fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. T-Maze di installazione per analisi avversivo Soppressione fototassi. A. L&#39;impostazione generale sperimentale per l&#39;esperimento APSA con la sorgente luminosa collegata al tubo &quot;illuminato&quot; falco, foderato con carta da filtro e il tubo &quot;dark&quot; a sinistra (coperto in fogli), separati da una botola. B. Durante la fase di test e allenamenti, la mosca è nella camera oscura e la botola aperta dopo la luce è accesa nella camera illuminata. <img src="/files/ftp_upload/2504/2504fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Risultati rappresentativi dal geotassi negativo e sperimentare APS con iperespressione di mosche GFP o Tau con un pan-neuronale driver. A. Nel test geotassi negativo, 10 giorni di età maschile (colonna blu) o femmina (colonna rossa) vola sovraesprimono GFP ha mostrato una maggiore attività di arrampicata di Tau-sovraesprimono mosche. B. di 20 giorni vecchia femmina vola iperespressione GFP ha mostrato una migliore apprendimento (PC0) e memoria (PC6) le funzioni di Tau iperespressione di mosche.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Sia geotassi negativo e saggi APS sono robusti test comportamentali per misurare le variazioni locomotore o di apprendimento e capacità di memoria derivanti da manipolazioni genetiche o ambientali. Tuttavia, ci sono alcuni svantaggi di questi saggi che attendono un&#39;ulteriore ottimizzazione. Nel saggio geotassi negativo, le mutazioni in alcuni geni può rendere gravi disfunzioni motorie nelle mosche. In tali casi, le mosche difficilmente può scalare i muri, in risposta alla forza di gravità su agitazione. Saggi di altro comportamento che, direttamente misurare il movimento può essere più appropriato. Questi test includono il comportamento riflesso di raddrizzamento che misura la paralisi e il sequestro 10, e il comportamento optomotor 11 che registra la perdita di coordinazione motoria. Nel saggio APS, l&#39;ostacolo prima può essere vola a caso fermarsi all&#39;ingresso della camera illuminata, senza andare avanti. Questo diventa più un problema se l&#39;invecchiamento è una delle condizioni studiate, dal momento che vola più anziani sono meno attivi in ​​generale e tendono a fermarsi e riposare per lunghi periodi di tempo. In questo caso lo sperimentatore deve fornire stimoli meccanici di promuovere la libera, che non è sempre efficace. In secondo luogo, si potrebbe sostenere che la mancata andare ai risultati camera illuminata da una perdita di fototassi positivo. Questo è raramente il caso, in quanto il lavoro precedente ha mostrato che vola tornare indietro alla capacità di risposta luce una volta che il negativo rafforzare viene rimosso 4. In terzo luogo, la durata del contatto con lo stimolo avversivo può variare da prova a prova. Questa variazione di solito può essere ridotto circonda la parete interna della camera con carta da filtro imbevuto di prevenire vola da evitare il chinino. Inoltre, lo sperimentatore può garantire che ogni volo passano abbastanza tempo a contatto con la carta da filtro, aumentando la quantità di tempo trascorso nella camera da diversamente specificato 1 minuto. In sintesi, geotassi negativo e saggi APS sono modi veloci e semplici per valutare deficit comportamentali e quantitativamente indicare locomotore e di apprendimento e le capacità di memoria in Drosophila. Questi test sono particolarmente utili nella modellazione umana malattie neurodegenerative in Drosophila.

<table border="1"><tbody><tr><th> Materiale </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commento </th></tr><tr><td> Polistirolo Vial </td><td> Vial Campidoglio, Inc. </td><td> 28Fly </td><td> 28,5 x 95 Vial polistirolo mm, qualità dei materiali importanti, male se troppo scivoloso per le mosche a salire. </td></tr><tr><td> Dissezione stereoscopio </td><td> Zeiss </td><td> 000000-1432-979 </td><td> 2 filiali a collo d&#39;oca guida di luce (12V/30W) </td></tr><tr><td> Chinino cloridrato </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 6119-47-7 </td><td> Sciogliere in acqua distillata. </td></tr><tr><td> Quick Disconnect Connettori </td><td> Nalgene (VWR) </td><td> 62868-021 </td><td> Polietilene ad alta densità </td></tr><tr><td> T-Maze </td><td> Semplici sistemi comportamentali </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Singolo canale 200 microlitri pipetta </td><td> Eppendorf </td><td> 022443305 </td><td></td></tr></tbody></table>

assaying locomotor, learning, and memory deficits in drosophila models of neurodegeneration

I progressi nei metodi di genetica hanno permesso lo studio dei geni coinvolti in malattie neurodegenerative umane utilizzando Drosophila come sistema modello 1. La maggior parte di queste malattie, tra cui l&#39;Alzheimer, il Parkinson e la malattia di Huntington sono caratterizzati da età-dipendente deterioramento delle funzioni di apprendimento e memoria e coordinazione motoria 2. Qui usiamo test comportamentali, tra cui il test negativo geotassi 3 e il test di soppressione phototaxic avversivo (APS test) 4,5, per mostrare che alcune delle caratteristiche di comportamento associato neurodegenerazione umana può essere riassunta nelle mosche. Nel test geotassi negativo, la tendenza naturale di mosche a muoversi contro la gravità, quando agitato è utilizzata per studiare i geni o le condizioni che possono ostacolare la capacità locomotoria. Nel saggio APS, le funzioni di apprendimento e la memoria sono testati in modo positivo-phototactic vola addestrati per associare la luce con gusto amaro avverso e, quindi, evitare questa tendenza altrimenti naturale a muoversi verso la luce. Test questi addestrati vola 6 ore dopo la formazione è utilizzata per valutare le funzioni di memoria. L&#39;utilizzo di questi saggi, il contributo di fattori genetici o ambientali verso lo sviluppo di neurodegenerazione può essere facilmente studiato in mosche.

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Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Test per misurare il comportamento delle funzioni locomotore, apprendimento, memoria e abilità in<em&gt; Drosophila</em&gt;.

Deficit Locomotore dosaggio, apprendimento e memoria in Drosophila Modelli di neurodegenerazione

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

33.5K Views.  University of Miami, Miller School of Medicine. Test per misurare il comportamento delle funzioni locomotore, apprendimento, memoria e abilità in Drosophila.

Video: Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

An Automated Rapid Iterative Negative Geotaxis Assay for Analyzing Adult Climbing Behavior in a Drosophila Model of Neurodegeneration

Neurodegenerative diseases are frequently associated with a progressive loss of movement ability, reduced life span, and age-dependent neurodegeneration. To understand the mechanism of these cellular events, and their causal relationships with each other, Drosophila melanogaster, with its sophisticated genetic tools and diverse behavioral features, are used as disease models for assessing neurodegenerative phenotypes. Here we describe a high-throughput method to analyze Drosophila adult negative geotaxis behavior, as an indication for possible motor defects associated with neurodegeneration. An automated machine is designed and developed to drive fly synchronization using an initial electric impulse, later allowing the recording of negative geotaxis behavior over a course of secs to mins. Images from the digitally recorded video are then processed with the self-designed RflyDetection software for statistical data manipulation. Different from the manually controlled negative geotaxis assay based on single fly, this precise, fast, and high-throughput protocol allows data acquisition from more than hundreds of flies simultaneously, providing an efficient approach to advance our understanding in the underlying mechanism of locomotor deficits associated with neurodegeneration.

An Automated Rapid Iterative Negative Geotaxis Assay for Analyzing Adult Climbing Behavior in a Drosophila Model of Neurodegeneration

This step-by-step protocol analyzes Drosophila negative geotaxis behavior using an automated multi-cylinder system that hosts hundreds of flies and synchronizes their action by an electric motor. Upon synchronization, fly negative geotaxis behavior is assayed, digitally recorded, and analyzed using the self-designed RflyDetection software.

Un dosaggio di geotassi negativa iterativo rapido automatizzato per l'analisi del comportamento adulto arrampicata in un modello di Drosophila di neurodegenerazione

Neurodegenerative diseases are frequently associated with a progressive loss of movement ability, reduced life span, and age-dependent neurodegeneration. ...

Ricerca

Comportamento

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Dissezione e macchiatura immunofluorescente del corpo di fungo e del fotoricettore neuroni nel cervello adulto Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Biologia dello sviluppo

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the elucidation of the molecular mechanisms involved in cognitive diseases1-7. Learning and memory can be assayed in larvae to study the effect of neurodevelopmental genes8-10 and in flies to measure the contribution of adult plasticity genes1-7. Furthermore, the short lifespan of Drosophila facilitates the analysis of genes mediating age-related memory impairment5,11-13. The availability of many inducible promoters that subdivide the Drosophila nervous system makes it possible to determine when and where a gene of interest is required for normal memory as well as relay of different aspects of the reinforcement signal3,4,14,16.
Studying memory in adult Drosophila allows for a detailed analysis of the behavior and circuitry involved and a measurement of long-term memory15-17. The length of the adult stage accommodates longer-term genetic, behavioral, dietary and pharmacological manipulations of memory, in addition to determining the effect of aging and neurodegenerative disease on memory3-6,11-13,15-21.
Classical conditioning is induced by the simultaneous presentation of a neutral odor cue (conditioned stimulus, CS+) and a reinforcement stimulus, e.g., an electric shock or sucrose, (unconditioned stimulus, US), that become associated with one another by the animal1,16. A second conditioned stimulus (CS-) is subsequently presented without the US. During the testing phase, Drosophila are simultaneously presented with CS+ and CS- odors. After the Drosophila are provided time to choose between the odors, the distribution of the animals is recorded. This procedure allows associative aversive or appetitive conditioning to be reliably measured without a bias introduced by the innate preference for either of the conditioned stimuli. Various control experiments are also performed to test whether all genotypes respond normally to odor and reinforcement alone.

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

The method to measure adult Drosophila associative memory is described. The assay is based on the ability of the fly to associate an odor presented with a negative reinforcer (electric shock) and then recall this information at a later time, allowing memory to be measured.

Drosophila adulti olfattiva Shock Learning

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the ...

Neuroscienze

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the fly as an experimental system include its genetic tractability, short life span and the possibility to observe and quantitatively analyze complex behaviors. The expression of disease-linked genes in specific neuronal populations of the Drosophila brain, can be used to model human neurodegenerative diseases such as Parkinson's and Alzheimer's 5.
Dopaminergic (DA) neurons are among the most vulnerable neuronal populations in the aging human brain. In Parkinson's disease (PD), the most common neurodegenerative movement disorder, the accelerated loss of DA neurons leads to a progressive and irreversible decline in locomotor function. In addition to age and exposure to environmental toxins, loss of DA neurons is exacerbated by specific mutations in the coding or promoter regions of several genes. The identification of such PD-associated alleles provides the experimental basis for the use of Drosophila as a model to study neurodegeneration of DA neurons in vivo. For example, the expression of the PD-linked human &alpha;-synuclein gene in Drosophila DA neurons recapitulates some features of the human disease, e.g. progressive loss of DA neurons and declining locomotor function 2. Accordingly, this model has been successfully used to identify potential therapeutic targets in PD 8.
Here we describe two assays that have commonly been used to study age-dependent neurodegeneration of DA neurons in Drosophila: a climbing assay based on the startle-induced negative geotaxis response and tyrosine hydroxylase immunostaining of whole adult brain mounts to monitor the number of DA neurons at different ages. In both cases, in vivo expression of UAS transgenes specifically in DA neurons can be achieved by using a tyrosine hydroxylase (TH) promoter-Gal4 driver line 3, 10.

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Here we describe two assays that have been established to study age-dependent neurodegeneration of dopaminergic (DA) neurons in Drosophila: the climbing/startle-induced negative geotaxis assay which allows to study the functional effects of DA neurons degeneration and the tyrosine hydroxylase immunostaining which is used to identify and count DA neurons in whole brain mounts.

Valutare fenotipi neurodegenerative<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuroni dopaminergici mediante saggi arrampicata e Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such behavior is spontaneous locomotor activity. Here we describe our protocol that utilizes Drosophila population monitors and a tracking system that allows continuous monitoring of the spontaneous locomotor activity of flies for several days at a time. This method is simple, reliable, and objective and can be used to examine the effects of aging, sex, changes in caloric content of food, addition of drugs, or genetic manipulations that mimic human diseases.

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster are useful in studying genetic or environmental manipulations that affect behaviors such as spontaneous locomotor activity.&#160; Here we describe a protocol that utilizes monitors with infrared beams and data analysis software to quantify spontaneous locomotor activity.&#160;

Determinazione del locomotore attività spontanea in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

Drosophila melanogaster is an ideal model organism for studying various diseases due to its abundance of advanced genetic manipulation techniques and diverse behavioral features. Identifying behavioral deficiency in animal models is a crucial measure of disease severity, for example, in neurodegenerative diseases where patients often experience impairments in motor function. However, with the availability of various systems to track and assess motor deficits in fly models, such as drug-treated or transgenic individuals, an economical and user-friendly system for precise evaluation from multiple angles is still lacking. A method based on the AnimalTracker application programming interface (API) is developed here, which is compatible with the Fiji image processing program, to systematically evaluate the movement activities of both adult and larval individuals from recorded video, thus allowing for the analysis of their tracking behavior. This method requires only a high-definition camera and a computer peripheral hardware integration to record and analyze behavior, making it an affordable and effective approach for screening fly models with transgenic or environmental behavioral deficiencies. Examples of behavioral tests using pharmacologically treated flies are given to show how the techniques can detect behavioral changes in both adult flies and larvae in a highly repeatable manner.

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

The present protocol assesses the locomotor activity of Drosophila by tracking and analyzing the movement of flies in a hand-made arena using open-source software Fiji, compatible with plugins to segment pixels of each frame based on high-definition video recording to calculate parameters of speed, distance, etc.

Una semplice tecnica per analizzare l'attività locomotoria nella Drosophila

Drosophila melanogaster is an ideal model organism for studying various diseases due to its abundance of advanced genetic manipulation techniques and ...

Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and thus current therapeutic treatment strategies are not curative. Through the use of whole exome sequencing, an increasing number of genes have been identified to play a role in human locomotion. Despite identifying these genes, it is not known how these genes are crucial to normal locomotive functioning. Therefore, a reliable assay, which utilizes model organisms to elucidate the role of these genes in order to identify novel targets of therapeutic interest, is needed more than ever. We have designed a sensitized version of the negative geotaxis assay that allows for the detection of milder defects earlier and has the ability to evaluate these defects over time. The assay is performed in a glass graduated cylinder, which is sealed with a wax barrier film. By increasing the threshold distance to be climbed to 17.5 cm and increasing the experiment duration to 2 min&#160;we have observed a greater sensitivity in detecting mild mobility dysfunctions. The assay is cost effective and does not require extensive training to obtain highly reproducible results. This makes it an excellent technique for screening candidate drugs in Drosophila mutants with locomotion defects.

We present an optimized inexpensive and reliable negative geotaxis assay in Drosophila melanogaster as a model for neurodegenerative disorders. Being more sensitive to mild locomotor defects, this assay will help screen for potential genetic interactions and drug targets.

Analisi quantitativa dei difetti arrampicata in un modello Drosophila di malattie neurodegenerative

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and ...

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health worldwide. Although mammalian models have provided important insights into the underlying mechanisms of pathogenicity, the complexity of mammalian systems together with their high costs are limiting their use. Therefore, the simple but well-established Drosophila model-system&#160;provides an alternative for investigating the molecular pathways that are affected in these diseases. Besides behavioral deficits, neurodegenerative diseases are characterized by histological phenotypes such as neuronal death and axonopathy. To quantify neuronal degeneration and to determine how it is affected by genetic and environmental factors, we use a histological approach that is based on measuring the vacuoles in adult fly brains. To minimize the effects of systematic error and to directly compare sections from control and experimental flies in one preparation, we use the &#39;collar&#39; method for paraffin sections. Neurodegeneration is then assessed by measuring the size and/or number of vacuoles that have developed in the fly brain. This can either be done by focusing on a specific region of interest or by analyzing the entire brain by obtaining serial sections that span the complete head. Therefore, this method allows one to measure not only severe degeneration but also relatively mild phenotypes that are only detectable in a few sections, as occurs during normal aging.

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Drosophila is widely used as a model system to study neurodegeneration. This protocol describes a method by which degeneration, as determined by vacuole formation in the brain, can be quantified. It also minimizes effects due to the experimental procedure by processing and sectioning control and experimental flies as one sample.

Messa Istologia per quantificare neurodegenerazione in<em&gt; Drosophila</em

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health ...

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

Many insights into the molecular mechanisms underlying learning and memory have been elucidated through the use of simple behavioral assays in model organisms such as the fruit fly, Drosophila melanogaster. Drosophila is useful for understanding the basic neurobiology underlying cognitive deficits resulting from mutations in genes associated with human cognitive disorders, such as intellectual disability (ID) and autism. This work describes a methodology for testing learning and memory using a classic paradigm in Drosophila known as courtship conditioning. Male flies court females using a distinct pattern of easily recognizable behaviors. Premated females are not receptive to mating and will reject the male&#39;s copulation attempts. In response to this rejection, male flies reduce their courtship behavior. This learned reduction in courtship behavior is measured over time, serving as an indicator of learning and memory. The basic numerical output of this assay is the courtship index (CI), which is defined as the percentage of time that a male spends courting during a 10 min interval. The learning index (LI) is the relative reduction of CI in flies that have been exposed to a premated female compared to na&#239;ve flies with no previous social encounters. For the statistical comparison of LIs between genotypes, a randomization test with bootstrapping is used. To illustrate how the assay can be used to address the role of a gene relating to learning and memory, the pan-neuronal knockdown of Dihydroxyacetone phosphate acyltransferase (Dhap-at) was characterized here. The human ortholog of Dhap-at, glyceronephosphate O-acyltransferase (GNPT), is involved in rhizomelic chondrodysplasia punctata type 2, an autosomal-recessive syndrome characterized by severe ID. Using the courtship conditioning assay, it was determined that Dhap-at is required for long-term memory, but not for short-term memory. This result serves as a basis for further investigation of the underlying molecular mechanisms.

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

This protocol describes a Drosophila learning and memory assay called courtship conditioning. This classic assay is based on a reduction of male courtship behavior after sexual rejection by a non-receptive premated female. This natural form of behavioral plasticity can be used to test learning, short-term memory, and long-term memory.

Condizionamento del corteggiamento di Drosophila come misura dell&#39;apprendimento e della memoria

Many insights into the molecular mechanisms underlying learning and memory have been elucidated through the use of simple behavioral assays in model ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

Purificazione di Trascrizioni e metaboliti<em&gt; Drosophila</em&gt; Teste

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Deficit Locomotore dosaggio, apprendimento e memoria in Drosophila Modelli di neurodegenerazione

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Un dosaggio di geotassi negativa iterativo rapido automatizzato per l'analisi del comportamento adulto arrampicata in un modello di Drosophila di neurodegenerazione

Dissezione e macchiatura immunofluorescente del corpo di fungo e del fotoricettore neuroni nel cervello adulto Drosophila melanogaster

Drosophila adulti olfattiva Shock Learning

Valutare fenotipi neurodegenerative

Determinazione del locomotore attività spontanea in

Una semplice tecnica per analizzare l'attività locomotoria nella Drosophila

Analisi quantitativa dei difetti arrampicata in un modello Drosophila di malattie neurodegenerative

Messa Istologia per quantificare neurodegenerazione in

Condizionamento del corteggiamento di Drosophila come misura dell'apprendimento e della memoria

Purificazione di Trascrizioni e metaboliti