Questo lavoro è supportato dal National Institutes of Health (NIH R01 AI46435) e la RMRCE (NIH AI065357).

Il protocollo che segue è scritto per la produzione e l&#39;uso di un ATS basato sul virus Sindbis MRE16. L&#39;ATS è stato progettato per esprimere la GFP nel vettore zanzara Aedes aegypti. cDNA cloni infettive di un certo numero di alphaviruses (virus Sindbis, virus Chikungunya, O&#39;nyong-nyong virus, virus dell&#39;encefalite equina occidentale) sono attualmente disponibili che sono stati progettati come ATS (Tabella 1). Per ottenere i migliori risultati del DNA plasmidico è amplificato nei batteri come SURE batteri competenti (Stratagene / Agilent Technologies) per evitare indesiderati ricombinazione e la perdita del cDNA virale. Tutti i plasmidi clone infettive hanno un batteriofago T7 o SP6 promotore presso l&#39;immediato 5 &#39;del cDNA virale per la trascrizione del full-length RNA genomico e di una endonucleasi di restrizione unico al 3&#39; per la trascrizione deflusso. Per ogni ATS, gli utenti devono utilizzare il DNA appropriato dipendente batteriofagi RNA polimerasi e endonucleasi di restrizione unico per la trascrizione in vitro del genoma virale RNA. 1. Generazione di RNA infettive da clone cDNA. <ol><li> Linearizzare il 5μg del clone infettivo plasmide (p5&#39;dsMRE16 / GFP) con 20 unità di enzima di restrizione XhoI in una reazione a 100 ul. Incubare per 2-3h a 37 ° C </li><li> Purificare il DNA linearizzato utilizzando Qiagen QIAprep Spin Miniprep protocollo di purificazione alternativi Kit, eluizione di DNA da Spin Column con 50 microlitri di acqua RNasi-free. Concentrazione plasmide dovrebbero essere circa 1,0 mcg / mL. </li><li> In un RNasi-free tubo 0,2 ml PCR, set-up a 50 microlitri reazione di trascrizione utilizzando Ambion Kit MAXIscript per protocollo, come segue. <ul><li> 22,5 microlitri RNasi-free dH 2 O <ul><li> Modello 5,0 microlitri di DNA linearizzato (1,0 mg / mL) </li><li> 2,5 microlitri 10mM ATP </li><li> 2,5 microlitri 10mM CTP </li><li> 2,5 microlitri 10mM UTP </li><li> 2,5 microlitri 1 mM GTP </li><li> 2,5 microlitri 10mM tappo analogico (m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) G) </li><li> 5,0 microlitri di buffer trascrizione 10X </li><li> 5,0 microlitri T7 o SP6 mix polimerasi </li></ul></li><li> Totale 50,0 microlitri </li></ul></li><li> Incubare la reazione di trascrizione per 1 ora a 37 ° C. Dopo l&#39;incubazione, la reazione deve essere utilizzato immediatamente per l&#39;elettroporazione di cellule BHK-21. Preparazione del cellule BHK-21 per l&#39;elettroporazione dovrebbero iniziare durante la reazione di incubazione trascrizione. </li></ol> 2. Generazione di virus da RNA infettive <ol><li> Trypsinize due 70-80% confluenti 150 centimetri 2 (T-150) Pallone BHK-21 cellule per ATS. </li><li> Trasferire tutte le cellule in una provetta da centrifuga da 15 ml. </li><li> Agglomerare le cellule mediante centrifugazione a 2000 rpm, 10 min, 4 ° C in una centrifuga da tavolo tradizionali. </li><li> Risospendere le cellule in PBS sterile senza Mg + + e Ca + +. Ripetere i passi 2.3 e 2.4 fino a quando le cellule sono state lavate tre volte con PBS. </li><li> Risospendere il pellet cellule 0,5 ml di MEM contenente 10% FBS. </li><li> Diluire 10 celle con 90 microlitri MEM microlitri con il 10% FBS e contare su un emocitometro. Se necessario, le cellule diluire a 2,5-12,5 x 10 7 cellule / ml con MEM contenente 10% FBS. </li><li> Per un freddo ghiaccio 0,2 centimetri cuvetta elettroporazione, aggiungere 400 microlitri di sospensione cellulare e 20 microlitri reazione di trascrizione. Pulire condensa cuvetta. </li><li> Pulse la cuvetta due volte: 450V, 1200Ω, 150 uF. Usiamo un manipolatore Electro Cell, Harvard Apparatus modello ECM630. </li><li> Posizionare l&#39;intero contenuto della cuvetta in un centimetro 25 2 fiasco di coltura contenente 5 ml di MEM con il 10% FBS. </li><li> Pallone incubare (s) a 37 ° C con 5% di CO 2. </li><li> Monitorare l&#39;infezione quotidiano utilizzando un microscopio invertito a fluorescenza con adeguate set di filtri (es. GFP filtro: lunghezza d&#39;onda di eccitazione = 460-490 nm, emissione = lunghezza d&#39;onda di 510-550 nm o DsRed filtro: lunghezza d&#39;onda di eccitazione = 460-560 nm, emissione = lunghezza d&#39;onda&gt; 590 nm). </li><li> Quando fluorescenza suggerisce infezione è confluenti e / o CPE è visibile in tutto il pallone, raccogliere il contenuto del flacone, aggiungere il 30% FBS, aliquota, se necessario, e conservare a -80 ° C. Se lo si desidera, lisati di cellule possono essere cancellati per centrifugazione (2000 rpm, 10 min, 4 ° C) prima dell&#39;aggiunta di FBS. </li><li> Passaggio del virus almeno una volta attraverso un pallone nuovo di cellule per aumentare il titolo del virus per le analisi successive alimentazione sangue. </li></ol> 3. Per os infezione di zanzare <ol><li> Mescolare sangue (di solito acquistata de-fibrinated sangue di pecora) e coltura cellulare sospensione del virus derivato dal punto 2.13. Titolo finale del virus nel sangue pasto tipicamente dovrebbe essere ~ 1x10 7 unità placca formando (PFU) / mL per infezione midgut efficiente della zanzara. Per stimolare le zanzare a congestionare, adenosina 5&#39;-trifosfato (ATP) può essere aggiunto a una concentrazione finale di 0.02M. </li><li> Le zanzare possonodevono essere privato di acqua e zucchero prima dell&#39;infezione per stimolarli ad alimentare in modo efficiente il sangue da un alimentatore artificiale. Durata della privazione dovrebbero essere stabiliti in precedenza per ridurre al minimo la mortalità. Tempi dipenderanno specie di zanzare, l&#39;umidità del ecc insectary Come punto di partenza, togliere 24h 12h zucchero e acqua prima al feed. Questo protocollo utilizza l&#39;acqua con camicia in vetro feeders17 con circolare acqua a 37 ° C. Una membrana intestinale suina (cioè lavati a fondo salsiccia involucro disponibile nei negozi di alimentari più) viene posto sulla bocca di alimentazione e il pasto è pipettato nella camera. Vari disegni, membrane e protocolli sono disponibili per i tipi di vettori differenti. </li><li> Le zanzare sono ordinati per selezionare solo quelle zanzare gonfio di sangue. Engorged zanzare vengono trasferiti in un cartone con organza sulla parte superiore e le zanzare sono incubate a 28 ° C, il 75-80% di umidità relativa fino trattati per l&#39;espressione della GFP. </li></ol> 4. Inoculazione intratoracica delle zanzare Inoculazione intratoracica è un metodo alternativo per infettare il artropodi. Questo metodo viene utilizzato quando la divulgazione attraverso il midgut non è necessaria. (Metodo descritto di seguito, ma la tecnica non viene mostrato in questo esperimento visivo). <ol><li> Un piccolo numero di zanzare (5-10) viene aspirato dalle gabbie un&#39;azienda nella tubi di plastica in mano. I tubi sigillati tenendo verranno messi a 4 ° C per 15 minuti per raffreddare le zanzare. </li><li> 2 5 zanzare sarà versato dal tubo su un piatto di vetro Petri poggia su ghiaccio. Mettere il coperchio sulla piastra Petri quando non in uso o se le zanzare cominciano a muoversi. Durante la movimentazione delle zanzare, è necessario prestare attenzione a contare e tenere traccia del numero di zanzare viene manipolato. Come le zanzare sono rovesciato sul tavolo freddo, il numero totale sarà registrato su un bancone di laboratorio. </li><li> L&#39;ago viene preparato sciogliendo tubo capillare di vetro utilizzando specifici Nanoject e un estrattore ago. </li><li> Impostare il Nanoject II microinjector secondo le istruzioni del produttore per la consegna di 69 nL inoculo. La cura deve essere esercitata quando l&#39;inoculo nel disegno l&#39;ago in modo che l&#39;ago non sia danneggiato. </li><li> Utilizzando un microscopio da dissezione, inserire l&#39;ago nel torace della zanzara e attivare il Nanoject per l&#39;inoculazione. La cura deve essere esercitata quando inoculare le zanzare in modo che l&#39;ago non penetra completamente la zanzara e uscire dall&#39;altra parte, provocando la successiva morte della zanzara. Controllare ogni zanzara per essere sicuri che l&#39;inoculo è entrato prima di rimuoverla dal ago. </li><li> Dopo l&#39;inoculazione, mentre la zanzara è ancora impalato sul ferro, è posto in una scatola di carta di partecipazione mediante un piccolo foro nel fianco che è collegato con cotone o un tappo di sughero in tutti gli altri. </li><li> Quando le zanzare hanno inoculato e messo in cartone (fino a circa il 50 per scatola), con attenzione nastro il tappo in atto per evitare il rilascio accidentale delle zanzare. Posizionare i cartoni in un bidone presa sicura prima di incubazione ulteriormente nel insectary a 28 ° C e 80% di umidità relativa. </li></ol> 5. Infezione monitoraggio delle zanzare <ol><li> Posizionare la scatola di carta mantenimento a 4 ° C per circa 15 minuti per immobilizzare le zanzare. </li><li> Trasferire un piccolo numero di zanzare (5-10 alla volta) a un tavolo freddo adattati per essere utilizzati su un microscopio a fluorescenza. </li><li> Esaminare e ordinare le zanzare in base alla presenza o assenza di fluorescenza. Inoltre, fluorescente di intensità può essere utilizzato come una misura quantitativa procura di infezione. Tessuti zanzara come midguts, ghiandole salivari, di grasso corporeo può essere sezionato e monitorati per fluorescenza. </li><li> Se del caso, il ritorno zanzare selezionati al cartone carta per continuare l&#39;incubazione di zanzare infette. </li></ol> 6. Trasmissione Assay (salivazione Costretto a dimostrare la trasmissione del virus) <ol><li> Privare le zanzare di fonte zucchero per 24 ore prima da sfamare. </li><li> Rimuovere le gambe e le ali </li><li> Per un tubo di 50 microlitri capillare che è stato riscaldato, tirato e tagliato ad una estremità, aggiungere 3-5 ml di olio di immersione Cargille tipo B o 10% di siero-soluzione di saccarosio. </li><li> Inserire la proboscide nel tubo. Se si utilizza l&#39;olio, le goccioline di saliva si vedrà a trasudare dalla proboscide. Un ml di una soluzione pilocarbine 1% in PBS e Tween 80 0,1% può essere applicato al torace per stimolare. </li><li> Dopo 60-90 minuti, togliere le zanzare e conservare per l&#39;isolamento del virus, se necessario. </li><li> Rimuovere la soluzione dal tubo per centrifugazione in un tubo contenente 100 ul 20% di FBS-PBS. </li><li> Filtro sterile l&#39;inoculo attraverso un filtro a siringa da 0,2 micron e quindi utilizzare il filtrato l&#39;inoculo di infettare le cellule in coltura. </li></ol> BIOSICUREZZA NOTA: Questo protocollo descriveun metodo per la generazione, l&#39;identificazione e il monitoraggio zanzare infette. Sulla base delle vostre strutture (ad esempio un tavolo freddo, impianto di contenimento, ecc) e l&#39;approvazione IBC, si può essere limitata ad esaminarle solo dopo aver rimosso le ali e le gambe per evitare la fuga. SINV a base di ATS può essere generata e utilizzata in un ambiente BSL2. L&#39;uso di ATS, basata su alphaviruses altri come la Chikungunya virus o virus dell&#39;encefalite equina occidentale richiederà BSL3 strutture. 7. Rappresentante Risultati Una panoramica di espressione di un gene marcatore (GFP) utilizzando il 5&#39;dsMRE16 ATS / GFP è mostrata in Figura 1. Espressione della GFP in BHK-21 e C6/36 (Aedes albopictus), le cellule è mostrato nella Figura 2 in determinati momenti dopo l&#39;infezione di cellule con 5&#39;dsMRE16 / GFP virus a 0,01 molteplicità di infezione. Figura 3 è una panoramica di infezione da virus alfavirus e ATS nella zanzara, quando il virus è espresso attraverso un pasto di sangue infettiva. La Figura 4 mostra la preparazione di un pasto di sangue con ~ 10 7 pfu / ml di virus ATS seguita da infezione orale di Aedes aegypti. Corpo vista intera di zanzara infetta e parti del corpo selezionato a 10 giorni dall&#39;infezione utilizzando un microscopio a epifluorescenza (Figura 5). Rilevazione di tali pratiche e DsRed in midguts di zanzare infette dopo l&#39;infezione con virus ATS 5&#39;dsMRE16 esprimere ogni gene marcatore fluorescente (Figura 6). Test di trasmissione con zanzare infette con 5&#39;dsMRE16 / GFP ATS virus (Figura 7). Tabella 1. ATS attualmente progettati per l&#39;espressione genica nelle zanzare. <table border="1"><tbody><tr><td>&nbsp; Alfavirus </td><td> ATS </td><td> Zanzara </td><td> Riferimento </td></tr><tr><td> Sindbis Virus </td><td> TE / 3&#39;2J e TE / 5&#39;2J </td><td> Aedes aegypti </td><td> 12 </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Ochlerotatus triseriatus </td><td> 13 </td></tr><tr><td></td><td> 3&#39;dsMRE16 e 5&#39;dsMRE16 </td><td> A. aegypti </td><td> 5 </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Culex tritaeniorhynchus </td><td> 5 </td></tr><tr><td></td><td> 5&#39;dsTR339 </td><td> A. aeg ypti </td><td> 2 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Virus Chikungunya </td><td> 3&#39;dsCHIKV e 5&#39;dsCHIKV </td><td> A. aegypti / A. albopictus </td><td> 20 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> O&#39;nyong nyong virus </td><td> 5&#39;dsONNV </td><td> Anopheles gambiae </td><td> 1,9 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Encefalite equina occidentale virus </td><td> 5&#39;dsWEEV. McMillan </td><td> Culex tarsalis </td><td> Stauft et al. Inediti </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Vantaggi / svantaggi di usare ATS per l&#39;espressione genica nelle zanzare. <table border="1"><tbody><tr><td> Vantaggi: </td></tr><tr><td> Produzione rapida di virus ad alto titolo </td></tr><tr><td> Ospitare un&#39;ampia gamma (SINV) </td></tr><tr><td> Alto tasso di replicazione RNA </td></tr><tr><td> Elevati livelli di espressione del transgene </td></tr><tr><td> Relativa facilità di manipolare geni </td></tr><tr><td> Stabile, l&#39;espressione genica persistente negli insetti </td></tr><tr><td> Patologia minima negli insetti </td></tr><tr><td></td></tr><tr><td> Svantaggi: </td></tr><tr><td> A breve termine la modalità di espressione nelle cellule dei vertebrati </td></tr><tr><td> Forte effetto citopatico sulle cellule dei vertebrati </td></tr><tr><td> Gene restrizioni di dimensione (&lt;1Kb, idealmente) </td></tr><tr><td> Alcuni alphaviruses richiedono BSL3 contenimento </td></tr></tbody></table><img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: Panoramica della produzione di virus ATS in cellule BHK-21 utilizzando p5&#39;dsMRE / GFP GFP SINV esprimere. Seguendo la trascrizione in vitro, genomica ATS RNA è elettroporate in cellule BHK-21, dove viene salvato virus. Il virus ATS può quindi essere utilizzato per infettare le zanzare. PSC = promotore subgenomic. Tre ATS specie di RNA sono trascritti nel cells, la genomica, subgenomic 1 e 2 subgenomic RNA. C (capside), glicoproteine ​​E1 ed E2 sono assemblati con ATS genoma per generare virus infettivo. <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: L&#39;espressione di GFP in zanzara (C6/36), le cellule dopo l&#39;infezione con SINV 5&#39;dsMRE16 / GFP virus. <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3: Panoramica di una infezione da virus ATS nelle zanzare porta alla trasmissione del virus. <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4: ATS SINV 5&#39;dsMRE16 infezione esponendo le zanzare per un pasto di sangue infettiva. <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5: ATS SINV 5&#39;dsMRE16 / GFP infezione a 10 giorni dall&#39;infezione. Rilevamento intero corpo di GFP mostra che il virus è sfuggito midgut e diffuso ai tessuti secondari. La figura mostra anche l&#39;espressione della GFP in parti del corpo scelto che è anche indicativo di una infezione disseminata. <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6: ATS SINV 5&#39;dsMRE16 / GFP e 5&#39;dsMRE16 / infezione DsRed di midguts in momenti specifici di post-infezione. Midguts di solito hanno diversi focolai di infezione precoce dopo aver ingerito un pasto di sangue contenente virus che si diffonde in tutto il midgut posteriore in tempi successivi post-infezione. <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig7.jpg" alt="Figura 7" /> Figura 7: Riconoscimento di ATS 5&#39;dsMRE16 / GFP nella saliva della zanzara a partire da 8 giorni dall&#39;infezione. Saggio è stato progettato per mostrare la trasmissione del virus ATS e mostra che il 5&#39;dsMRE16 / GFP virus può esprimere stabilmente GFP per tutto il periodo di incubazione estrinseca nella zanzara. Il pannello di sinistra mostra una zanzara salivazione in un tubo capillare, il pannello centrale mostra C6/36 cellule infette con la saliva a 1 giorno e pannello di destra 3 giorni dopo l&#39;infezione.

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+double+subgenomic+chikungunya+virus+infectious+clone+to+express+heterologous+genes+in+Aedes+aegypti+mosquitoes.">Development and characterization of a double subgenomic chikungunya virus infectious clone to express heterologous genes in Aedes aegypti mosquitoes.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 35, 1162-1162 (2005).</li><li>Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+inducing+or+inhibiting+apoptosis+on+Sindbis+virus+replication+in+mosquito+cells.">Effects of inducing or inhibiting apoptosis on Sindbis virus replication in mosquito cells.</a> J. Gen. Virol. 89, 2651-2651 (2008).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

I metodi qui presentati consentono ai ricercatori di seguire l&#39;infezione di un alfavirus in colture cellulari di zanzara e la zanzara femmina adulta. I vantaggi e gli svantaggi di usare virus ATS sono riassunti nella Tabella 2. Un clone ATS infettive possono essere geneticamente manipolate per esprimere qualsiasi governo indiano e sono stati utilizzati per esprimere gli anticorpi a catena singola, soppressori di RNAi, RNA antisenso targeting dei geni endogeni, e pro-apoptotici proteine. Se un giornalista non viene utilizzato, allora la parte di imaging di questo metodo non è rilevante. Tuttavia, molti degli stessi protocolli sono necessari per il soccorso virus ATS, propagazione e infezione zanzara. Ci sono limiti nella dimensione massima del transgene, quando inserito in un sistema di trasduzione alfavirus. I vincoli dimensioni variano a seconda del ceppo parentale utilizzato per generare l&#39;ATS, ma di solito sono circa 1kb anche se geni reporter più grandi come lucciola luciferasi sono stati utilizzati nella costruzione di ATS per l&#39;uso in zanzare. Laboratori di ricerca con una modesta quantità di virologia di fondo dovrebbe essere in grado di utilizzare ATS in seguito questi protocolli. Una serie di laboratori di ricerca hanno già fatto con SINV basato ATS.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>27104</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MAXIscript Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AB1312</td>
<td>Be sure to use a kit containing the appropriate polymerase for your construct.</td>
</tr>
<tr>
<td>Cap Analogue (m7G(5')ppp(5')G)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AM8050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nanoject II nanoliter injector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond Scientific</td>
<td>3-000-204</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electro Cell Manipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>ECM 630</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

alphavirus transducing system:  tools for visualizing infection in mosquito vectors

Alfavirus sistemi di trasduzione (ATS) sono strumenti importanti per esprimere geni di interesse (GOI) durante l&#39;infezione. ATS sono derivati ​​da cloni di cDNA trasmessa dalle zanzare virus a RNA (alfavirus genere; famiglia togaviridae). Il genere alfavirus contiene circa 30 diverse specie di zanzare virus. Alphaviruses sono virus con involucro e contengono genomi a singolo filamento di RNA (~ 11,7 Kb). Alphaviruses trascrivere un mRNA subgenomic che codifica le proteine ​​strutturali del virus necessario per incapsidazione del genoma e la maturazione del virus. Alphaviruses sono di solito molto litiche nelle cellule dei vertebrati, ma persistente infettare le cellule suscettibili zanzara con un minimo citopatologia. Queste caratteristiche li rendono ottimi strumenti per l&#39;espressione genica in vettori di zanzara. L&#39;ATS più comuni in uso sono derivati ​​da virus Sindbis (SINV). Il tropismo specie gamma di SINV permette di infezione di insetti, uccelli e mammiferi cells8. Tuttavia, ATS sono state derivate da alphaviruses anche altri 9,10,20. L&#39;espressione genica degli Esteri è reso possibile mediante l&#39;inserimento di un ulteriore sito virale subgenomic iniziazione RNA o promotore. ATS in cui è posizionata una sequenza del gene esogeno 5 &#39;al geni virali strutturali viene utilizzata per l&#39;espressione della proteina stabile negli insetti. ATS, in cui è posizionata una sequenza di geni 3 &#39;ai geni strutturali, è utilizzato per attivare l&#39;espressione RNAi e nel silenzio di quel gene in insetti. ATS hanno dimostrato di essere strumenti preziosi per la comprensione vettore-patogeno interazioni, i dettagli molecolari di replicazione virale e cicli di manutenzione infettive 3,4,11,19,21. In particolare, l&#39;espressione di giornalisti fluorescenti e bioluminescenti è stato determinante per il tracciamento della infezione virale a trasmissione vettoriale e virus 5,14-16,18. Inoltre, il vettore risposta immunitaria è stata descritta utilizzando due ceppi di SINV progettati per esprimere GFP 2,9. Qui, vi presentiamo un metodo per la produzione di SINV contenente un reporter fluorescente (GFP) dal clone cDNA infettive. Infettive, full-length RNA trascritto dal clone linearizzato cDNA. Infettive RNA è introdotta all&#39;interno delle cellule bersaglio permissivo mediante elettroporazione. Cellule transfettate generare particelle virali infettive esprimere il governo indiano. Virus raccolto viene utilizzato per infettare le zanzare, come descritto qui, o altre specie ospite (non mostrata qui). Competenza Vector è valutato rilevando fluorescenza al di fuori del midgut o dalla trasmissione di monitoraggio del virus 7. L&#39;uso di un reporter fluorescente come il governo indiano consente per la stima conveniente di diffusione del virus in tutto una coltura cellulare, per la determinazione del tasso di infezione, la diffusione di zanzare esposti, trasmissione del virus dalla zanzara e fornisce un indicatore rapido di competenza vettoriale.

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Alphavirus Transducing System:  Tools for Visualizing Infection in Mosquito Vectors

Metodi di impiego di sistemi di trasduzione alfavirus esprimere reporter fluorescente in vitro e in zanzare adulte sono descritti. Questa tecnica può essere adattato per esprimere qualsiasi proteina di interesse in sostituzione o in aggiunta ad un giornalista.

Sistema alfavirus trasduzione: Strumenti per la visualizzazione di infezione in Vettori Mosquito

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection.  ATSs are derived from cDNA clones of ...

alphavirus-transducing-system-tools-for-visualizing-infection

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.7K Views.  Colorado State University. Metodi di impiego di sistemi di trasduzione alfavirus esprimere reporter fluorescente in vitro e in zanzare adulte sono descritti. Questa tecnica può essere adattato per esprimere qualsiasi proteina di interesse in sostituzione o in aggiunta ad un giornalista.

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Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the up- and down-regulation of gene expression rely on the transfection of stably maintained plasmids. While these have increased our understanding of Entamoeba virulence factors, the capacity to integrate exogenous DNA into genome, which would allow reverse genetics experiments, would be a significant advantage in the study of this parasite. The challenges presented by this organism include inability to select for homologous recombination events and difficulty to cure episomal plasmid DNA from transfected trophozoites. The later results in a high background of exogenous DNA, a major problem in the identification of trophozoites in which a bona fide genomic integration event has occurred. We report the development of a negative selection system based upon transgenic expression of a yeast cytosine deaminase and uracil phosphoribosyl transferase chimera (FCU1) and selection with prodrug 5-fluorocytosine (5-FC). The FCU1 enzyme converts non-toxic 5-FC into toxic 5-fluorouracil and 5-fluorouridine-5'-monophosphate. E. histolytica lines expressing FCU1 were found to be 30 fold more sensitive to the prodrug compared to the control strain.

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

We report development of a negative selection system in E. histolytica based upon transgenic expression of a chimeric protein (FCU1) and selection with the prodrug 5-fluorocytosine. The FCU1 protein is a fusion of yeast cytosine deaminase and uracil phosphoribosyltransferase. Expression of FCU1 resulted in increased E. histolytica sensitivity towards 5-fluorocytosine.

Sviluppo di un marcatore negativo selezionabile per Entamoeba histolytica</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that influence this interaction could lead to improved understanding of disease pathogenesis and thus influence vaccine or therapeutic design. Hence, the development 
of methods to probe this interaction would be useful. Recent advancements in fluorophores development1-3 and imaging technology4 can be exploited to 
improve our current knowledge on dengue pathogenesis and thus pave the way to reduce the millions of dengue infections occurring annually.

The enveloped dengue virus has an external scaffold consisting of 90 envelope glycoprotein (E) dimers protecting the nucleocapsid shell, 
which contains a single positive strand RNA genome5. The identical protein subunits on the virus surface can thus be labeled with an amine reactive dye and visualized 
through immunofluorescent microscopy. Here, we present a simple method of labeling of dengue virus with Alexa Fluor succinimidyl ester dye dissolved directly in a sodium 
bicarbonate buffer that yielded highly viable virus after labeling. There is no standardized procedure for the labeling of live virus and existing manufacturer&#x2019;s protocol 
for protein labeling usually requires the reconstitution of dye in dimethyl sulfoxide. The presence of dimethyl sulfoxide, even in minute quantities, can block 
productive infection of virus and also induce cell cytotoxicity6. The exclusion of the use of dimethyl sulfoxide in this protocol thus reduced this possibility. 
Alexa Fluor dyes have superior photostability and are less pH-sensitive than the common dyes, such as fluorescein and rhodamine2, making them ideal for 
studies on cellular uptake and endosomal transport of the virus. The conjugation of Alexa Fluor dye did not affect the recognition of labeled dengue 
virus by virus-specific antibody and its putative receptors in host cells7. This method could have useful applications in virological studies.

Taking advantage of the advancements in fluorophore development and imaging technology, a simple method of Alexa Fluor labeling of dengue virus was devised to visualize the early interactions between virus and cell.

Visualizzazione virus Dengue attraverso Alexa Fluor Etichettatura

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

piggyBac Transposon modifica del sistema di cellule primarie umane T

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Coltura Microglia dal Sistema Nervoso Centrale neonatale e adulti

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

The investigation of the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to understanding the pathogenic mechanisms of diseases caused by these organisms. Here we describe a procedure for protein extraction from Burkholderia species based on mechanical lysis using glass beads in the presence of ethylenediamine tetraacetic acid and phenylmethylsulfonyl fluoride in phosphate buffered saline. This method can be used for different Burkholderia species, for different growth conditions, and it is likely suitable for the use in proteomic studies of other bacteria. Following protein extraction, a two-dimensional (2-D) gel electrophoresis proteomic technique is described to study global changes in the proteomes of these organisms. This method consists of the separation of proteins according to their isoelectric point by isoelectric focusing in the first dimension, followed by separation on the basis of molecular weight by acrylamide gel electrophoresis in the second dimension. Visualization of separated proteins is carried out by silver staining.

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Members of the Burkholderia genus are pathogens of clinical importance. We describe a method for total bacterial protein extraction, using mechanical disruption, and 2-D gel electrophoresis for subsequent proteomic analysis.

Totale Estrazione di proteine ​​e 2-D elettroforesi su gel Metodi per<em&gt; Burkholderia</em&gt; Specie

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

Un approccio semplice ed efficiente per costruire Mutant vaccinia vettori di virus

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the development and persistence of many health related infections. One of the most well described and studied biofilms in human disease occurs in chronic pulmonary infection of cystic fibrosis patients. When studying biofilms in the context of the host, many factors can impact biofilm formation and development. In order to identify how host factors may affect biofilm formation and development, we used a static chambered coverglass method to grow biofilms in the presence of host-derived factors in the form of sputum supernatants. Bacteria are seeded into chambers and exposed to sputum filtrates. Following 48 hr of growth, biofilms are stained with a commercial biofilm viability kit prior to confocal microscopy and analysis. Following image acquisition, biofilm properties can be assessed using different software platforms. This method allows us to visualize key properties of biofilm growth in presence of different substances including antibiotics.

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

Visualizzare gli effetti di espettorato su biofilm di sviluppo utilizzando un modello Chambered coprioggetti

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability to role and adhere to the endothelial layer. Visualization of circulating cells by injection of fluorescent dyes or fluorophore-coupled antibodies is commonly used. Alternatively, fluorescent reporter mice can be used. Interactions of leukocytes, in particular lysozyme M+ (LysM+) monocytes, with the vessel wall play pivotal roles in promoting vascular dysfunction and arterial hypertension. We here present the technique to visualize and quantify leukocyte rolling and adhesion in carotid arteries in angiotensin II (AngII)-induced hypertension in mice by IVM.
The implantation of a catheter damages the vascular wall and leads to altered blood cell responses. We compared different injection techniques and administration routes to visualize leukocytes in a LysMCre+IRG+ mouse with widespread expression of red fluorescent protein and conditional expression of green fluorescent protein in LysM+ cells. To study LysM+ cell activation, we used AngII infused mice in which rolling and adhesion of leukocytes to the endothelium is increased. We either injected acridine orange using a jugular catheter or directly though the tail vein and compared the amount of rolling and adhering cells. We found that jugular catheter implantation per se increased the number of rolling and adhering LysM+ cells in sham-infused LysMCre+IRG+ mice compared to controls. This activation was augmented in AngII-infused mice. Interestingly, injecting acridine orange directly through the tail vein did not increase LysM+ cell adhesion or rolling in sham-infused mice. We thereby demonstrated the importance of transgenic reporter mice expressing fluorescent proteins to not interfere with in vivo processes during experimentation. Furthermore, tail vein injection of fluorescent tracers might be a possible alternative to jugular catheter injections.

This manuscript describes the use of transgenic reporter mice and different administration routes of fluorescent dyes in angiotensin II-induced hypertension using intravital video microscopy of blood vessels to evaluate the activation of immune cells and their ability to roll and adhere to the endothelium.

Visualizzazione del leucocita rotolamento e adesione in angiotensina II-infuso topi: tecniche e insidie

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian influenza (AI), Newcastle disease (ND), and infectious bursal disease (IBD), using bacterial artificial chromosome (BAC) mutagenesis or conventional recombination methods. The clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system has been successfully used in many settings for gene editing, including the manipulation of several large DNA virus genomes. We have developed a rapid and efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing pipeline to generate recombinant HVT. To maximize the potential use of this method, we present here detailed information about the methodology of generating recombinant HVT expressing the VP2 protein of IBDV. The VP2 expression cassette is inserted into the HVT genome via an NHEJ (nonhomologous end-joining)-dependent repair pathway. A green fluorescence protein (GFP) expression cassette is first attached to the insert for easy visualization and then removed via the Cre-LoxP system. This approach offers an efficient way to introduce other viral antigens into the HVT genome for the rapid development of recombinant vaccines.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is widely used as a vector platform for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases. This article describes a simple and rapid approach for the generation of recombinant HVT-vectored vaccines using an integrated NHEJ-CRISPR/Cas9 and Cre-Lox system.

Generazione di vettori ricombinanti Herpesvirus aviaria con CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian ...

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has a broad spectrum of applications. Detection of antigens allows for characterization and identification of multiple cell types. Located above the kidneys and encapsulated by a layer of mesenchymal cells, the adrenal gland is an endocrine organ composed by two different tissues with different embryological origins, the mesonephric intermediate mesoderm-derived outer cortex and the neural crest-derived inner medulla. The adrenal cortex secretes steroids (i.e., mineralocorticoids, glucocorticoids, sex hormones), whereas the adrenal medulla produces catecholamines (i.e., adrenaline, noradrenaline). While conducting adrenal research, it is important to be able to distinguish unique cells with different functions. Here we provide a protocol developed in our laboratory that describes a series of sequential steps required for obtaining immunofluorescence staining to characterize the cell types of the adrenal gland. We focus first on the dissection of the mouse adrenal glands, the microscopic removal of periadrenal fat followed by the fixation, processing and paraffin embedding of the tissue. We then describe sectioning of the tissue blocks with a rotary microtome. Lastly, we detail a protocol for immunofluorescent staining of adrenal glands that we have developed to minimize both non-specific antibody binding and autofluorescence in order to achieve an optimal signal.

Here we present a method to isolate adrenal glands from mice, fix the tissues, section them, and perform immunofluorescence staining.

Isolamento, fissazione e immunofluorescenza Imaging delle ghiandole adrenali Mouse

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...