La zootecnia esperto fornito da Tina Martin e David Albright è apprezzati. Questa ricerca è stata sostenuta da finanziamenti T32-AI-07285 (HN), NIH R25 2GM064133 (TCL), 1R03-HD061671-01, R24-AI-059830-06 dal NIH.

1. Animali X. laevis x X. Gilli ibridi LG-6 e LG-15 cloni isogenetic 1 sono dalla nostra colonia di riproduzione presso l&#39;Università di Rochester (http://www.urmc.rochester.edu/smd/mbi/xenopus/index.htm). LG-6 e LG-15 condividono lo stesso aplotipo MHC eterozigote (a / c) ma si differenziano a minori di istocompatibilità (H) loci. Progenie di questi cloni sono prodotti da gynogenesis, in cui le uova diploidi prodotte dalla femmina sono attivati ​​da UV-irradiati spermatozoi (nessun contributo del DNA per la progenie). L&#39;uso di guanti è facoltativo. Alcune persone preferiscono non li indossano perché è più difficile da maneggiare le rane (scivoloso) e in effetti sembra di fare le rane a disagio. 2. Purificazione di gp96 da 15 / 0 tumorale (Tumor ed esprime sia minore H-Ags) Gp96 purificazione è stato descritto in precedenza 2, 3. In breve, gp96 è purificato dal frazionamento solfato di ammonio 50-70%, seguita da Ancona-sefarosio e DEAE cromatografia. Circa 20-50 mg di proteina possono essere ottenuti per 1 ml di tessuto tumorale. La purezza del preparato è determinata dalla SDS-PAGE e colorazione argento. 3. Elicitazione e Harvest di leucociti peritoneale (PL) dalla minore H-Ag-disparati LG-6 Rane <ol><li> Crescere un 25 mL notte E. Cultura Coli in un tubo da 50 ml conici a 37 ° C con agitazione. </li><li> Il calore giorno successivo uccidere i batteri da bollire per 1 ora. </li><li> Centrifugare il caldo ha ucciso E. Coli per 15 min a 2.000 giri (1.500 g) a 4 ° C. </li><li> Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet batterico in 1 / 10 ° volume cultura originale (2,5 ml) in APBS. A questo punto la coltura batterica è pronto per l&#39;uso e deve essere utilizzato entro 24 ore. </li><li> Iniettare intraperitoneale (ip) 200 (per una rana 2 pollici) o 300 ml (per una rana 3 pollici) del calore uccisi per la preparazione batterica rana con un calibro 25 5 / 8 ago. </li><li> Tre giorni dopo l&#39;iniezione PL vengono raccolte a lavaggio intraperitoneale. </li><li> Prima della raccolta PL, rane adulte sono anestetizzati per immersione in una soluzione acquosa 0,1% di metano solfonato tricaine (TMS, MS-222) tamponato con bicarbonato di sodio per un massimo di 5 minuti fino a quando tutti i movimenti cessa (la durata dipende dalla dimensione ed età). Animali scia entro 10-20 minuti dopo il trattamento. </li><li> Disinfettare l&#39;addome della rana con una piccola quantità di etanolo al 70%. </li><li> Iniettare 5 ml (per una rana 2 pollici) o 10 ml (per una rana 3 pollici) di APBS sterile pre-riscaldato a temperatura ambiente nella cavità peritoneale con una calibro 18 1 ½ ago. Rimuovere l&#39;ago e massaggiare delicatamente la rana per un minuto per assicurarsi che il buffer iniettato in equilibrio con il liquido nella cavità del corpo. </li><li> Utilizzare un nuovo 18 gauge 1 ½ una siringa senza ago per raccogliere il liquido peritoneale, che a goccia dalla parte posteriore dell&#39;ago in un ambiente pulito tubo da 50 ml. Assicurati di recuperare la maggior quantità di volume iniziale iniettato possibile. Stare attenti ad evitare i vasi sanguigni nella zona centrale della regione addominale. </li><li> Una volta PL vengono raccolte mettere la rana in un contenitore con acqua bassa fino a quando è sveglio a quel punto può essere rimesso nella sua gabbia. </li></ol> 4. Trasferimento pulsare e adottivi del Lg-6 Pls Into Naive Lg-6 Destinatari <ol><li> Lavare la PL volta con APBS freddo e centrifugare li a 1.000 giri (750 g) per 10 minuti a 4 ° C. </li><li> Rimuovere il supernatante e risospendere il PL in APBS. </li><li> Il polso del PL con gp96 ad una concentrazione di 1 mg gp96 per 5 x 10 5 PL. </li><li> Una volta che la quantità appropriata di gp96 viene aggiunto al PL, mescolarli pipeting e incubare in ghiaccio per 1 ora. </li><li> Centrifugare le cellule sia a 1000 rpm per 10 min a 4 ° C o a 14.000 rpm per 1 min di togliere qualunque legato gp96. </li><li> Lavare la PL 3X con APBS fredda per assicurare che non residuale gp96 sinistra. </li><li> Risospendere il PL pulsata ad una concentrazione di 5 x 10 5 PL per 300 ml. </li><li> Adoptively trasferimento PL mediante iniezione ip utilizzando calibro 25 5 / 8 ago. Iniettare 300 ul di PL pulsata (5 x 10 5 cellule) per animale. </li><li> Le rane dovranno essere innescato almeno 3 giorni prima di continuare con innesto di pelle o esperimenti sfida tumore. </li></ol> 5. Innesto della pelle Assay Il rigetto del trapianto della pelle è una realtà consolidata nel saggio Xenopus 4, 5, 6. In Xenopus, un destinatario rifiuta la pelle del donatore visualizzazione di 1 o 2 mismatch aplotipo MHC entro 18-22 giorni a 21-22 ° C. Al contrario, i trapianti di pelle tra LG e LG-6-15 cloni che differiscono solo per piccoli H-Ags vengono respinte più lentamente (più di 30 giorni). Tuttavia, questo rifiuto è accelerata nei pazienti that sono stati vaccinati contro il donatore minore H-Ags sia da un innesto di pelle precedente o tramite l&#39;immunizzazione con gp96 purificata dal donatore. Nessun rifiuto a tutti si verifica quando il donatore e il ricevente sono geneticamente identici (ad esempio, gli animali clonati o completamente inbred). Pertanto, questa semplice tecnica è molto potente per la caratterizzazione in vivo risposte immunitarie provocato da gp96. <ol><li> Anestetizzare rana donatore, come descritto in 3.7. Nota: solo le precauzioni minime devono essere prese dal Xenopus produrre potente anti-microbico peptidi (ad esempio, magainin) nella pelle che elimina la necessità per un totale di procedure asettiche. Infatti, il trattamento della rana con qualsiasi disinfettante sarebbe dannoso per la pelle. Inoltre, Xenopus non hanno alcun agenti patogeni che possono essere trasferiti agli esseri umani. Pertanto, l&#39;uso di guanti è facoltativo. Tuttavia, tutti gli strumenti di dissezione utilizzati devono essere sterilizzati in autoclave e tutte le soluzioni devono essere sterili. </li><li> Tagliare e rimuovere una piccola (20 mm x 5 mm) pezzo di pelle ventrale (cute addominale che sembra argentato per la presenza di irridophore cellule pigmentate) da un LG-15 rana donatore con le forbici. </li><li> Posizionare la pelle in un APBS Petridish contenimento e tenerlo in ghiaccio. Manipolare il tessuto della pelle molto delicatamente, evitare di tenere in tra le pinze. </li><li> Utilizzando un rasoio o le forbici tagliare i singoli innesti in 5 mm x 5 pezzi mm. Tenere i frammenti in APBS sul ghiaccio. </li><li> A questo punto la rana donatore viene inserito in un contenitore con acqua bassa fino a quando è sveglio e poi viene messo in acqua contenenti antibiotici (Penstrep a una concentrazione di 5 mg / L). La rana è tenuto in acqua con gli antibiotici per due giorni ea quel punto si ritorna in acqua normale. La piccola ferita nel sito in cui è stata rimossa la pelle non ha bisogno di essere cucite e guarisce entro una settimana. </li><li> Anestetizzare l&#39;LG-6 destinatario rana. </li><li> Fai una piccola incisione sulla dorsale (posteriore) della pelle del destinatario e inserire il 5 mm x 5 innesto mm sotto la pelle con la parte argentea alto. Fare attenzione a non introdurre bolle d&#39;aria di grandi dimensioni sotto la pelle perché può portare allo spostamento o addirittura la perdita del trapianto. </li><li> Assicurati di notare le marcature forbici e pinze sul innesti, perché quelli non sono conteggiati come rigetto una volta che il punteggio comincia. </li><li> 24 ore più tardi una parte della pelle ospitare sovrapposizione deve essere rimosso dal trapianto. </li><li> Anestetizzare l&#39;LG-6 destinatario rana. Gestire l&#39;animale, come descritto al punto 5.1. </li><li> Utilizzando le forbici autoclave ritagliare una finestra intorno al trapianto in modo che l&#39;innesto può essere liberamente visualizzati. Fare attenzione a non toccare la pelle del donatore o di indurre emorragie. Lasciate che la rana di recuperare, come descritto in 5.5. </li><li> Avviare segnando l&#39;innesto subito facendo uno schizzo. Il rigetto del trapianto cutaneo è determinato dalla percentuale di distruzione del irridophores sulla pelle innestata. </li><li> Gli innesti devono essere controllati ogni 2-3 giorni, ma gli animali non hanno bisogno di essere anestetizzati per questo. Per visualizzare gli innesti, le rane devono essere collocati in un petridish sotto un microscopio da dissezione. </li></ol> 6. Tutto-mount Immunohistology di pelle trapiantato Rana con tutto il montaggio immunohistology è stato descritto in precedenza 6. In breve, la rana è anestetizzato e posto sotto il microscopio su un tovagliolo di carta sterile pre-bagnato con acqua rana (l&#39;area di lavoro è anche asetticamente preparato). La pelle viene poi trapiantato raccolte insieme ad una piccola quantità di cute circostante ospite e si è macchiato con anticorpi in modo simile a colorazione delle cellule per l&#39;analisi di citometria a flusso 6. Strumenti in autoclave e tamponi sterili devono essere utilizzati. Dopo la colorazione della pelle è posto su un vetrino da microscopio e delicatamente pressato con una scivolata di copertura. A questo punto la pelle può essere visualizzato usando un microscopio a fluorescenza per diverse popolazioni cellulari che hanno infiltrato l&#39;innesto. Al termine della procedura la rana è tenuto in acqua con gli antibiotici come descritto nella sezione 5.5. ed è tornato in acqua normale. La piccola ferita sinistra dove la pelle è stato rimosso guarisce entro una settimana. 7. Caratterizzazione dei leucociti del sangue <ol><li> Prima di togliere il sangue dalla rana, si ha la necessità di preparare &quot;aghi di vetro&quot; tirando sterile pipette Pasteur a fuoco. L&#39;estremità sottile della pipetta è acuito con lo stereomicroscopio. La pipetta viene poi collegato ad un tubo di plastica aspirazione. Tutti gli strumenti come le pinze e le forbici devono essere sterilizzati in autoclave prima dell&#39;uso. </li><li> Anche preparare ghiacciata 10 ml di soluzione di eparina APBS e con l&#39;aggiunta di 50 unità di eparina per 1 ml di APBS. Tenere la soluzione su ghiaccio. Tutte le soluzioni utilizzate devono essere sterili. </li><li> Anestetizzare rana come descritto in 3.7, e seguire le stesse procedure di trattamento degli animali, come descritto al punto 5.1. . </li><li> Tagliare la pelle sopra il piede posteriore per esporrela vena dorsale tarso. </li><li> Riempire la pipetta Pasteur con 1-2 mL di soluzione APBS + eparina. </li><li> Inserire la &quot;ago di vetro&quot; nella vena e iniziare a raccogliere il sangue lentamente aspirando con la bocca. E &#39;importante avere APBS soluzione di eparina + nel &quot;ago di vetro&quot; in quanto questo impedisce la coagulazione del sangue e intasamento sulla punta dell&#39;ago. </li><li> 1 a 2 ml di sangue può essere ottenuto da una rana di medie dimensioni. </li><li> La piccola incisione sulla gamba della rana non ha bisogno di essere cucito e la ferita guarisce entro una settimana. </li><li> Centrifugare il sangue a 1.000 rpm per 10 minuti a 4 ° C. </li><li> Rimuovere il supernatante e lavare le cellule 1X con 10 ml di APBS freddo. </li><li> Sovrapposizione 2 ml di sangue (1-5 x 10 6 celle) su 1 ml di Ficoll HISTOPAQUE 1,077 (Sigma), pre-riscaldato a temperatura ambiente al fine di separare i leucociti del sangue dai globuli rossi. </li><li> Centrifugare 20 min a 1.000 giri al minuto a temperatura ambiente, senza freno, e raccogliere quindi la banda dei leucociti. </li><li> Lavare le cellule 2X con APBS per centrifugazione a 1.400 rpm per 10 minuti a 4 ° C per rimuovere i residui di Ficoll. </li><li> A questo punto le cellule sono pronte per essere colorate con anticorpi per l&#39;analisi di citometria a flusso, o da utilizzare per il test in coltura in vitro. </li></ol> 8. Tumore Trapianto di analisi <ol><li> Circa una settimana prima del disgelo esperimento in un lotto fresco di cellule 15 / 0 tumore e fare in modo che le cellule iniziano a crescere bene. Terreno di coltura è succintamente descritto nella sezione successiva e più in dettaglio in 3. </li><li> Espandere il 15 / 0 cellule tumorali. </li><li> Il giorno dell&#39;esperimento, contare le cellule e determina morte cellulare per esclusione tripan blu. La morte cellulare deve essere inferiore al 5%. Lavare le cellule 1X a APBS freddo, e centrifugare a 1.000 rpm a 4 ° C per 10 min. </li><li> Risospendere le cellule in terreno di coltura del tumore ad una densità di 5 x 10 5 15 / 0 cellule per 300 ml. </li><li> Trapianto di 5 x 10 5 cellule in 300 microlitri di volume per rana per iniezione sottocutanea con un calibro 25 5 / 8 ago su un lato della dorsale (posteriore) lato dell&#39;animale. </li><li> La crescita del tumore avrà inizio entro 2-3 settimane dopo la sfida del tumore. La comparsa del tumore iniziale deve essere notato e il volume del tumore deve essere registrato ogni 2-3 giorni. Volume del tumore (altezza x larghezza x lunghezza) è misurata con le pinze. </li><li> Una volta che il tumore cresce a 3.500 mm 3 o la rana inizia a guardare letargico, ha bisogno di essere l&#39;eutanasia per evitare disagi. </li></ol> 9. Reagenti necessari: <ul><li> Anfibio soluzione tampone fosfato (APBS): 6,6 g / L di NaCl, 1,15 g / L di Na 2 HPO 4, 0,2 g / l KH 2 PO. il pH a 7,5 con NaOH 10N e filtro sterilizzato attraverso filtro 0,2 micron. </li><li> Tricaine solfonato metano (TMS, MS-222) (Crescent ricerca CAS # 886-86-2 sostanze chimiche). </li><li> Bicarbonato di sodio (Fisher Scientific S-233-500). </li><li> HISTOPAQUE-1077 (Sigma-Aldrich 10771-100 ml) </li><li> Eparina sale di sodio (Sigma-Aldrich H3149-50KU) </li><li> Terreno di coltura per Xenopus 15 / 0 tumori [vedi 3 per ulteriori dettagli]: 1 l di media basale Iscove DMEM (Invitrogen Gibco-11965) con 10 Insulina ml, 10 ml aminoacidi non essenziali, 10 mL di penicillina-streptomicina; 10 mcg / ml di kanamicina, 3 mL di primatone (Sheffield Products Division), 1 ml di β2-mercaptoetanolo, e 3,02 g di NaHCO 3 in acqua (pH 7,0). Questo mezzo è diluito a osmolarità anfibi con l&#39;aggiunta di 30% di acqua bidistillata ed integrata con 5% di siero fetale bovino, il 20% superantant da una A6 linea di Xenopus cellule renali, e lo 0,25% del normale Xenopus siero. </li></ul> 10. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/2026/2026fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Analisi stereomicroscopio di rigetto del trapianto cutaneo 12 giorni dopo il trapianto. LG-6 rana clonato ricevuto un trapianto di pelle da entrambi (A) un MHC-identico LG-6 (non mostra alcun rifiuto) o (B) un MHC-disparati donatori consanguinei (80% rifiuto). Le frecce indicano le cellule pigmentate iridophore argenteo marcatura sani (non respinte) del tessuto innestato. (*) Mark of non forcipe a causa di rifiuto. <img src="/files/ftp_upload/2026/2026fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Gp96 facilita la cross-presentazione di antigeni tumorali in Xenopus. LG PL-15 (5 x 10 5) sono stati pulsata per 1 ora su ghiaccio sia con APBS (controllo negativo), 1 mg di gp96 ricombinante purificata da E. Mcg cultura Coli, o 1 o 0,5 di gp96 purificata da 15 / 0 tessuto tumorale. Dopo 3 lavaggi, le cellule sono state trasferite in adoptively LG-15 pazienti adulti (1 x 10 6 / individuale). Tre giorni dopo, dal vivo 15 / 0 cellule tumorali (5 x 10 5) sono statitrapiantati per iniezione sottocutanea. Ogni curva rappresenta la cinetica della crescita tumorale in una rana. Giorni dopo sfida, quando i tumori sono stati monitorati prima apparizione, e la dimensione del tumore è stata determinata periodicamente con un (lunghezza x larghezza x spessore) pinza.

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	<li>Kobel, H. R., Pasquier, D. u., L, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperdiploid+species+hybrids+for+gene+mapping+in+Xenopus.">Hyperdiploid species hybrids for gene mapping in Xenopus.</a> Nature. 279, 157-158 (1979).</li><li>Robert, J., Menoret, A., Basu, S., Cohen, N., Srivastava, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+conservation+of+the+molecular+and+immunological+properties+of+the+chaperones+gp96+and+hsp70.">Phylogenetic conservation of the molecular and immunological properties of the chaperones gp96 and hsp70.</a> Eur J Immunol. 31, 186-195 (2001).</li><li>Robert, J., Gantress, J., Cohen, N., Maniero, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+as+an+experimental+model+for+studying+evolution+of+hsp--immune+system+interactions.">Xenopus as an experimental model for studying evolution of hsp--immune system interactions.</a> Methods. 32, 42-53 (2004).</li><li>Chardonnens, X., Pasquier, D. u., L, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+skin+allograft+tolerance+during+metamorphosis+of+the+toad+Xenopus+laevis:+a+possible+model+for+studying+generation+of+self+tolerance+to+histocompatibility+antigens.">Induction of skin allograft tolerance during metamorphosis of the toad Xenopus laevis: a possible model for studying generation of self tolerance to histocompatibility antigens.</a> Eur J Immunol. 3, 569-573 (1973).</li><li>Du Pasquier, L., Bernard, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+suppression+of+the+allogeneic+histocompatibility+reactions+during+the+metamorphosis+of+the+clawed+toad+Xenopus.">Active suppression of the allogeneic histocompatibility reactions during the metamorphosis of the clawed toad Xenopus.</a> Differentiation. 16, 1-7 (1980).</li><li>Ramanayake, T., Simon, D. A., Frelinger, J. G., Lord, E. M., Robert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+study+of+T-cell+responses+to+skin+alloantigens+in+Xenopus+using+a+novel+whole-mount+immunohistology+method.">In vivo study of T-cell responses to skin alloantigens in Xenopus using a novel whole-mount immunohistology method.</a> Transplantation. 83, 159-166 (2007).</li><li>Robert, J., Ramanayake, T., Maniero, G. D., Morales, H., Chida, A. S., S, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+conservation+of+glycoprotein+96+ability+to+interact+with+CD91+and+facilitate+antigen+cross-presentation.">Phylogenetic conservation of glycoprotein 96 ability to interact with CD91 and facilitate antigen cross-presentation.</a> J Immunol. 180, 3176-3182 (2008).</li><li>Robert, J., Gantress, J., Rau, L., Bell, A., Cohen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minor+histocompatibility+antigen-specific+MHC-restricted+CD8+T+cell+responses+elicited+by+heat+shock+proteins.">Minor histocompatibility antigen-specific MHC-restricted CD8 T cell responses elicited by heat shock proteins.</a> J Immunol. 168, 1697-1703 (2002).</li><li>Morales, H., Robert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+techniques+for+comparative+study+of+antiviral+T-cell+responses+in+the+amphibian+Xenopus.">In vivo and in vitro techniques for comparative study of antiviral T-cell responses in the amphibian Xenopus.</a> Biol Proced Online. 10, 1-8 (2008).</li><li>Maniero, G. D., Robert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+conservation+of+gp96-mediated+antigen-specific+cellular+immunity:+new+evidence+from+adoptive+cell+transfer+in+xenopus.">Phylogenetic conservation of gp96-mediated antigen-specific cellular immunity: new evidence from adoptive cell transfer in xenopus.</a> Transplantation. 78, 1415-1421 (2004).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

L&#39;anfibio Xenopus è un unico versatile non mammiferi modello per studiare l&#39;immunità. Il suo largo uso nella ricerca biomedica e immunologico ha prodotto in molti strumenti di ricerca importanti come i cloni MHC definito LG-6 e LG-15 così come diverse linee cellulari e anticorpi monoclonali. L&#39;utilizzo di questi strumenti che abbiamo stabilito diversi in vitro e in vivo per studiare la capacità delle proteine ​​heat shock come gp96 di mediare potente Ag-specifici anti-minori H-Ag ed anti-tumore risposte delle cellule T 7. Questo modello di sistema ci consente di esaminare ulteriormente le proprietà immunologiche gp96 durante l&#39;adescamento e le fasi delle cellule effettrici. Per quanto riguarda la fase di adescamento, studi iniziali di queste risposte usato vaccinazione sottocutanea con purificata gp96 che ha richiesto due iniezioni di 10 mg gp96 a intervalli di due settimane prima del test in vivo come la pelle innesto o trapianto di tumore 2, 8. In confronto, il cross-presentazione metodo che abbiamo sviluppato 7 e sono attualmente in uso è più conveniente ed efficiente. I molteplici vantaggi di questa strategia di adescamento includono il tempo e la quantità di proteine ​​necessarie per ciascun esperimento. Per esempio al fine di immunizzare un animale ci vogliono 4 settimane e 20 mg di gp96, mentre con adescamento PL abbiamo bisogno di solo 3 giorni e 0,5 a 1 mg di proteina. Inoltre vi è una minore variabilità, perché l&#39;adescamento è costituito da una sola iniezione di PL pulsata con gp96. Questo è un passo fondamentale, perché se l&#39;ago viene estratta troppo rapidamente durante una delle vaccinazioni per iniezione sottocutanea, una frazione significativa di proteine ​​può essere perso quindi causando una maggiore variabilità individuale. Importante, questo cross-presentazione test fornisce un modo per approfondire i meccanismi della risposta immunitaria gp96-mediata. Per esempio, possiamo anche modulare l&#39;espressione di alcune molecole come la classe Ia sulla superficie del PL prima pulsazione con gp96 per indagare il loro ruolo nella risposta immune mediata gp96 e primerizzazione delle cellule T. Il processo di interiorizzazione gp96 può anche essere studiato da pre-incubazione PL con anticorpi o concorrenti interferire con i recettori endocitico 7. Per quanto riguarda la fase effettrice, il modello di Xenopus non è adatto solo per caratterizzare effettori cellule immunitarie in vitro mediante citometria a flusso, uccidendo e saggi di proliferazione 8, 9, ma fornisce anche potenti in vivo come la minore H-Ag-disparati innesti cutanei e tumori trapianto di test. Entrambi questi test sono ben stabiliti nel modello di Xenopus tuttavia ci sono alcuni passaggi critici che devono essere seguite. Per esempio nella cura innesto cutaneo test speciali devono essere pagati quando si maneggia l&#39;innesto soprattutto quando si taglia fuori dalla finestra della pelle sovrapposizione di accoglienza. La finestra deve essere leggermente più piccolo rispetto alla stessa innesto in modo che l&#39;innesto non cadere. Inoltre, durante il trapianto del tumore è importante iniettare prima metà degli animali di controllo seguiti da quelli sperimentali e di terminare con la seconda metà delle rane di controllo. Questo farà sì che il tumore è valida durante il processo di iniezione e produrrà dati più consistenti. Il fatto che questo modello di sistema si basa su animali clonati permette inoltre di estendere gli studi di cellule effettrici stimolato da HSP mediante trasferimento adottivo di cellule 10. In sintesi, i metodi presentati qui evidenziare la rana Xenopus come un eccezionale non mammiferi sistema modello per studiare HSP come gp96 ruolo nella sorveglianza immunitaria e le risposte immunitarie.

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<td>Reagents needed:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
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<td>Amphibian Phosphate Buffered Saline (APBS): </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
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<td>NaCl, 1.15 g/L </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Na2HPO4, 0.2 g/L </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
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<td>KH2PO </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
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<td>10N NaOH </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tricaine Methane Sulfonate (TMS, MS-222) </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Crescent Research Chemicals </td>
<td>CAS#886-86-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium bicarbonate </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific </td>
<td>S-233-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Histopaque-1077</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>10771</td>
<td>100ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Heparin Sodium Salt </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich </td>
<td>H3149-50KU</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Culture medium for Xenopus 15/0 tumors [see 3 for more details]:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Iscove DMEM basal medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco-Invitrogen </td>
<td>11965</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Insulin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Non-essential amino acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-streptomycin </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Kanamycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Primatone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sheffield Products Division</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
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<td>&beta;2-mercaptoethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaHCO3 </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>30% double distilled water </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5% featal bovine serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>20% superantant from a Xenopus kidney cell line A6 </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.25% of normal Xenopus serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Materials and Equipment:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 and 15 ml conical centrifuge tubes (sterile)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>25 gauge 5/8 Precision Glide sterile needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>18 gauge 1&frac12; Precision Glide sterile needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 ml Tuberculin Slip Tip Syringe sterile</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 ml Slip Tip Syringe sterile</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1.5 ml MicroCentrifuge tubes (sterile)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>60 X 15 mm Polystyrene Petri Dishes sterile</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Razor blades</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>25 X 75 mm X 1 mm Premium Microscope Slides </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 cm glass petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>9" Pasteur Pipetes Durex Borosilicate Glass Cotton Plugged Disposable</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tygon tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Two # 5 Swiss Jeweler&#x2019;s Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltex Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro Dissecting Spring Scissors McPherson-Vannas straight cutting edge 6 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Helios calipers </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
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<td>Dissecting microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>High intensity illuminator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hemacytometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Un-bunsen burner</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>37&deg;C shaking incubator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Centrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
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		</div>

comparative in vivo study of gp96 adjuvanticity in the frog xenopus laevis

Abbiamo sviluppato negli anfibi Xenopus laevis un unico non-mammiferi modello per studiare la capacità di alcune proteine ​​da shock termico (HSP) come gp96 per facilitare la cross-presentazione di antigeni sorvegliati e suscitano innata e adattiva le risposte delle cellule T. Rigetto del trapianto pelle Xenopus fornisce una piattaforma eccellente per studiare la capacità di gp96 per suscitare classica MHC di classe Ia (classe Ia) limitato le risposte delle cellule T. Inoltre, il sistema Xenopus modello fornisce anche una valida alternativa al mouse per esplorare la capacità di gp96 di generare risposte contro i tumori che hanno down-regolato loro molecole di classe Ia fine di eludere la sorveglianza immunitaria. Recentemente, abbiamo sviluppato un saggio di trasferimento adottivo di cellule di cloni Xenopus utilizzando leucociti peritoneali come cellule presentanti l&#39;antigene (APC), e dimostrato che la gp96 possibile preparare le risposte delle cellule T CD8 in vivo contro gli antigeni di istocompatibilità minori della pelle così come contro il tumore del timo Xenopus 15 / 0 che non esprime molecole di Ia classe. Descriviamo qui la metodologia coinvolti per eseguire questi test tra cui il trasferimento elicitazione, pulsante e adottivi dei leucociti peritoneali, così come l&#39;innesto di pelle e saggi di trapianto di tumore. Inoltre siamo anche descrivendo la raccolta e la separazione dei leucociti del sangue periferico utilizzato per la citometria a flusso e saggi di proliferazione che consentono un&#39;ulteriore caratterizzazione delle popolazioni effettrici coinvolte nel rifiuto della pelle e anti-tumore risposte.

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Comparative in vivo Study of gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis

La rana<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Offre una interessante alternativa non-mammiferi modello per esplorare la possibilità di proteine ​​da shock termico come gp96 per promuovere antigene-specifiche risposte delle cellule T CD8. Vi presentiamo i metodi per lo studio<em&gt; In vivo</emFacilitazione&gt; di cross-presentazione di antigeni tumorali della pelle e da gp96.

Comparativo In vivo Studio di gp96 Adjuvanticity nella rana Xenopus laevis</em

We have developed in the amphibian Xenopus laevis a unique non-mammalian model to study the ability of certain heat shock proteins (hsps) such as gp96 to ...

comparative-vivo-study-gp96-adjuvanticity-frog-xenopus

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Comparative in vivo Study of gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis

10.5K Views.  University of Rochester. La rana Xenopus laevis Offre una interessante alternativa non-mammiferi modello per esplorare la possibilità di proteine ​​da shock termico come gp96 per promuovere antigene-specifiche risposte delle cellule T CD8. Vi presentiamo i metodi per lo studio In vivo di cross-presentazione di antigeni tumorali della pelle e da gp96.

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In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most common forms of disease are visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL). Mouse models of leishmaniasis are widely used, but quantification of parasite burdens during murine disease requires mice to be euthanized at various times after infection. Parasite loads are then measured either by microscopy, limiting dilution assay, or qPCR amplification of parasite DNA. The in vivo imaging system (IVIS) has an integrated software package that allows the detection of a bioluminescent signal associated with cells in living organisms. Both to minimize animal usage and to follow infection longitudinally in individuals, in vivo models for imaging Leishmania spp. causing VL or CL were established. Parasites were engineered to express luciferase, and these were introduced into mice either intradermally or intravenously. Quantitative measurements of the luciferase driving bioluminescence of the transgenic Leishmania parasites within the mouse were made using IVIS. Individual mice can be imaged multiple times during longitudinal studies, allowing us to assess the inter-animal variation in the initial experimental parasite inocula, and to assess the multiplication of parasites in mouse tissues. Parasites are detected with high sensitivity in cutaneous locations. Although it is very likely that the signal (photons/second/parasite) is lower in deeper visceral organs than the skin, but quantitative comparisons of signals in superficial versus deep sites have not been done. It is possible that parasite numbers between body sites cannot be directly compared, although parasite loads in the same tissues can be compared between mice. Examples of one visceralizing species (L. infantum chagasi) and one species causing cutaneous leishmaniasis (L. mexicana) are shown. The IVIS procedure can be used for monitoring and analyzing small animal models of a wide variety of Leishmania species causing the different forms of human leishmaniasis.

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

An in vivo imaging system is used to generate quantitative measurements of murine infection with the Trypanosomatid protozoan Leishmania. This is a non-invasive and non-lethal method for detecting parasites expressing luciferase within many tissues throughout the course of chronic Leishmania spp. infection.

Imaging in vivo del transgenico parassiti Leishmania in un host live

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non invasiva di imaging di homing dei leucociti e la migrazione In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Coltura Microglia dal Sistema Nervoso Centrale neonatale e adulti

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In vitro e in vivo modello per studiare l&#39;adesione batterica alla parete del serbatoio in condizioni di flusso

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

Culture placentare e deciduale organo umano allo Studio infezioni all&#39;interfaccia materno-fetale

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

Trasduzione retrovirale di cellule T helper come un approccio genetico per studiare meccanismi che controllano la loro differenziazione e funzione

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the analysis of immune mediators in fluid eluates for the study of the airway topical immune signature, without the need for stimulation procedures (often used by other techniques). The mucosal lining fluid is sampled on a strip of filter paper placed at the anterior part of the inferior turbinate and left for 2 min of absorption. Analytes are eluted from the filter papers, and the extracted protein-based eluates are analyzed by an electrochemiluminescence-based immunoassay, allowing for the high-sensitivity quantification of low- and high-level analytes in the same sample. We measured the in vivo levels of 20 preselected immune mediators related to specific immune signaling pathways in the upper airway mucosa, but the technique is not limited to that specific panel or sampling site. The technique was first implemented in 7-year-old children from the Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood2000 (COPSAC2000) cohort with allergic rhinitis. It was thereafter used in the longitudinal COPSAC2010 birth cohort, sampled at 1 month, 2 years, and 6 years of age and at instances of acute respiratory symptoms. We successfully obtained and analyzed samples from 620 (89%) of 700 1-month-old children; a few samples were below the assay detection limit (reported as the median (Inter-Quartile Range (IQR)). The number of samples below the detection limit (i.e.&#160;from 0 to the set point for the lower limit of detection) for each mediator was 29 (7.25 - 119.5). This technique enables the quantification of the in vivo airway mucosal immune profile from birth, can be applied longitudinally, and can be applied to studies on the effect of genetics and early-life environmental exposures, pathophysiology, endotyping, and monitoring of respiratory diseases, and development and evaluation of novel therapeutics.

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes a noninvasive technique for the sampling of undisturbed mucosal lining fluid from the upper airways. It can be used to perform the quantification of in vivo levels of protein mediators, such as cytokines and chemokines, in subjects of all ages.

Campionamento non invasivo del rivestimento mucoso fluido per la quantificazione dei livelli di Immune-mediatore In Vivo delle vie respiratorie superiore

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and temporal specificity2. Chemotaxis is a critical function of lymphocytes and other immune cells that can be quantitatively assessed in vitro. This manuscript describes methods that permit the evaluation of chemotaxis, both in vitro and in vivo, for diverse cell types including cell lines and native cells. The in vitro, plate-based format permits the comparison of several conditions simultaneously in real-time, and can be completed within 1-4 h. In vitro assay conditions can be manipulated to introduce agonists and antagonists, as well as differentiate chemotaxis from chemokinesis, which is random movement. For in vivo trafficking assessments, immune cells can be labeled with multiple fluorescent dyes and used for adoptive transfer. The differential labeling of cells allows for mixed cell populations to be introduced into the same animal, thereby decreasing variance and reducing the number of animals required for an adequately powered experiment. Migration into lymphoid tissue occurs in as little as 1 h, and multiple tissue compartments can be sampled. Flow cytometry following tissue harvest allows for a rapid and quantitative analysis of the migratory patterns of multiple cell types.

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Protocols for quantitative assessment of lymphocyte chemotaxis and migration are important tools for immunology research. Here, an in vitro protocol is described that permits real-time, multiplexed evaluation of cell migration, as well as a complementary in vivo technique enabling tracking of native cells to spleen.

Quantificazione del linfocita murino traffico In Vivo e chemiotassi del monocito umano In Vitro

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Isolamento di Salmonella typhimurium-contenente fagosomi dai macrofagi

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

Monostrati Colonoid umana per studiare le interazioni tra gli agenti patogeni, Commensals ed epitelio intestinale Host

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

Comparativo In vivo Studio di gp96 Adjuvanticity nella rana Xenopus laevis

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