Questo progetto è stato finanziato dal Dipartimento dell&#39;Illinois di sanità pubblica e la National Science Foundation (DBI-0852416).

1. Dispositivo di funzione <ol><li> Il dispositivo inserire ipossiche contiene 6 montanti che nidificano in uno standard a 6 pozzetti. Gas fluisce nel pilastro, attraverso una rete microfluidica alla base del pilastro, e rifluisce dal dispositivo. Alla base del pilastro che formano la parete di fondo della microcanali è di 100 micron di spessore gas-permeabile membrana PDMS che permette la diffusione di ossigeno tra il gas microcanali e dei media della cultura. Così, il dispositivo funziona creando un gradiente di concentrazione che spinge la concentrazione di ossigeno dei media verso un valore desiderato. </li><li> Il dispositivo offre una serie di vantaggi rispetto alla camera di ipossia e altri sistemi di ossigenazione delle cellule: 1) riduce al minimo il percorso di diffusione di ossigeno permettendo il controllo più veloce temporale, 2) migliora il controllo dello spazio sopra l&#39;ossigenazione, in quanto dipendente dalla progettazione pilastro microcanali, 3) possiede un impronta di laboratorio più piccolo e un throughput più elevato per aumentare l&#39;efficienza sperimentale, e 4) si adatta a strumenti comuni di coltura cellulare (per esempio piastra pozzetti) senza la necessità di conoscenze specialistiche e delle attrezzature. </li></ol> 2. Dispositivo di fabbricazione <ol><li> Primo pilastro è l&#39;array replica stampato con PDMS in uno stampo precedentemente lavorato Delran. </li><li> Avanti il ​​gas microcanali in fondo a ogni pilastro è fabbricato utilizzando le normali SU-8 fotolitografia e PDMS stampaggio replica. </li><li> Il gas-permeabile membrana è fabbricato facendo girare definito di PDMS su un wafer di silicio per ottenere lo spessore desiderato. In questo esempio si usa un 100 micron di spessore della membrana, che è stato fabbricato dal giro 500 giri per 10 secondi e 900 giri per 30 secondi. </li><li> Tutti i componenti sono legati tra loro dopo il trattamento al plasma di ossigeno con un dispositivo portatile al plasma (modello BD-20, Electro-Technic Prodotti). </li></ol> 3. Dispositivo di setup <ol><li> Inserire delicatamente dispositivo nel piatto, avendo cura di evitare bolle. L&#39;inclinazione del dispositivo durante l&#39;inserimento aiuta ad espellere le bolle fuori un lato. Per gli effettivi a base di cellule esperimenti, questo passaggio deve essere fatto all&#39;interno di una cappa sterile a flusso laminare. Le possibilità di contaminazione sono notevolmente ridotti una volta che il dispositivo è inserito, in modo che il montaggio può essere effettuato verso l&#39;incubatore in un ambiente non sterile. </li><li> Collegare il tubo dal serbatoio di gas di origine alla porte di ingresso e uscita del dispositivo. Per i cellulari basati su esperimenti, l&#39;incubatore cultura dovrebbe avere un buco di permesso di ingresso tubo e il tubo deve essere collegato dopo aver portato il dispositivo e metterlo nella incubatrice. Fare attenzione a non mettere pressione eccessiva sul dispositivo, che potrebbe deformare il PDMS sufficiente per schiacciare le cellule sottostanti. </li><li> Assicurarsi che il regolatore di flusso di precisione sia chiuso prima di aprire il regolatore canotta per evitare di eccedere il dispositivo. Avviare il flusso del gas. Aprire delicatamente il flusso regolatore di precisione a portata desiderata (50-100 ml / min). Guarda il valore strettamente nell&#39;ora successiva ed effettuare le modifiche necessarie, dal momento che la caduta di pressione cambierà mentre il sistema equilibra, alterando la portata. Per evitare la formazione di bolle nei media, ridurre la portata di tra 10-20 ml / min, dopo un iniziale equilibrio durata di 15 minuti con la portata più alta. </li><li> Dopo aver desiderato la durata sperimentale, arrestare la fuoriuscita del gas, togliere il piatto, e le cellule di conseguenza processo (ad esempio lisare, macchia, conteggio, ecc.) </li></ol> 4. Dispositivo di convalida <ol><li> Calibratura <ol><li> Selezionare il numero e la localizzazione delle posizioni sul ossigeno fluorescente (FOXY) scivolo sensore (a seconda delle esigenze di validazione) che verrà utilizzato per la misurazione dell&#39;ossigeno. La diapositiva contiene un colorante fluorescente rivestimento rutenio che si spegne da ossigeno. </li><li> Esporre scivolare direttamente a 0, 10, e 21% di ossigeno dal serbatoio di gas e di catturare immagini dopo 5 minuti di equilibrio corretto. </li><li> Esportare l&#39;intensità media dell&#39;immagine per ogni posizione e l&#39;ossigenazione concentrazione trama come dipendente intensità fluorescente. </li><li> Generare la curva di calibrazione inserendo curve lineari alla linea 0-10% e 10-21% di linea. </li></ol></li><li> Eterogeneità <ol><li> Stabilire più punti si estende la larghezza del canale a un intervallo definito (ad esempio ogni 1 mm). Si noti che ci possono essere sovrapposizione di immagini a seconda della distanza. </li><li> Misurare la concentrazione di ossigeno in superficie e attraverso il dispositivo </li></ol></li><li> Equilibrazione <ol><li> Scegliere tre punti sul vetrino FOXY in cui misurare la concentrazione di ossigeno. </li><li> Immediatamente dopo la cattura una prima immagine a livelli di ossigeno ambiente, aprire il regolatore di flusso di precisione per iniziare il flusso di gas nel dispositivo. Catturare immagini ad un intervallo appropriato per valutare la durata e la portata di Concentrazione di ossigenozione di equilibrio (ad esempio ogni 10 secondi per 30 minuti). </li></ol></li></ol> 5. Applicazioni <ol><li> Wound Healing <ol><li> Un giorno prima dell&#39;esperimento, immergere l&#39;inserto sterilizzati PDMS in mezzo privo di siero per ridurre il inibire la formazione di bolle di gas nel pozzo. </li><li> Cellule cultura al 100% confluenza in un 6-pozzetti. </li><li> Crea graffi dritto negli monostrati con una punta P200 pipetta per simulare ferite. </li><li> Aspirare i mezzi di comunicazione cellulare, lavare con 5 ml di mezzi, e aspirare di nuovo. E &#39;importante non disturbare il monostrato di cellule. </li><li> Riempire i pozzetti con 4 mL mezzo privo di siero per ridurre la proliferazione cellulare. </li><li> Inserire luogo nei pozzetti e collegare ogni bene a una concentrazione di ossigeno corrispondente. </li><li> Posto a 6 pozzetti con inserto sul palco riscaldato a 37 ° C. </li><li> Catturare immagini lasso di tempo le cellule all&#39;intervallo desiderato e la durata totale. T_Scratch di MATLAB, un algoritmo di misurazione ferita, può essere utilizzato per analizzare l&#39;area non cicatrizzate di superficie. </li></ol></li></ol> 6. Rappresentante Risultati <ol><li> Dispositivo di convalida Il dispositivo inserire ipossia mostra grandi miglioramenti sopra la camera ipossica in termini di tempo ossigeno equilibrio e misura, che richiede meno di 2 minuti a stabilizzarsi al 0,5% di ossigeno. La membrana-e dispositivo di dimensioni divario fondo è stato il fattore critico nel determinare l&#39;efficienza equilibrio, con dimensioni gap più grandi che richiedono più tempo per arrivare allo stato stazionario valori di concentrazione di ossigeno. Il dispositivo permette anche una grande quantità di controllo sulla ossigenazione spaziali in un singolo pozzo, permettendo la formazione di più condizioni, e persino generare un profilo ciclico ossigeno sulla superficie del pozzo. </li><li> Guarigione delle ferite Monostrati cellulari sono stati esposti a 10% o 21% di ossigeno e la superficie della ferita è stato analizzato nel corso del tempo. Graffi esposte al 21% di ossigeno chiuso il più lento e il 10% più veloce. La figura 1 mostra le immagini di un graffio nel corso di 17 ore. I grafici in Figura 5 mostrano la percentuale di superficie ferita aperta per entrambe le concentrazioni di ossigeno per tutta la durata dell&#39;esperimento. </li></ol> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/1695/1695fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig1tmb.jpg" alt="Figura 1" border="0" /></a> Figura 1. Schematica e diagrammi che illustrano le funzioni del dispositivo. Il dispositivo inserire ossigeno è fabbricata fotolitografia convenzionale (rete microfluidica), stampaggio replica (microfluidica rete e inserire scaffold), e definito filatura di PDMS (gas-permeabile membrana). A) Il dispositivo ossigeno annidato in un 6-pozzetti. B) Esempi di 24 e 96 ben array pilastro. C) Una sezione trasversale schematica di un pilastro. Flussi di ossigeno nel dispositivo attraverso l&#39;ingresso e viaggia attraverso una rete microfluidica sul fondo del pilastro. L&#39;ossigeno può diffondere liberamente attraverso la membrana permeabile al gas PDMS in fondo alla colonna e si dissolvono in terreni di coltura. D) Un immagine al microscopio che mostra le varie caratteristiche di un singolo canale pilastro dall&#39;alto, con i messaggi di vetro incollato per gli studi equilibrio. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/1695/1695fig2.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig2tmb.jpg" alt="Figura 2" border="0" /></a> Figura 2. Convalida del dispositivo con sensori di ossigeno. Tensione di ossigeno all&#39;interno di ogni bene è stato caratterizzato utilizzando un sensore di ossigeno planare rutenio. Tutte le miscele di ossigeno contenuto equilibrato di azoto e del 5% di CO 2 per il buffering dei media. A) Plot che illustra l&#39;effetto di altezza posta, e la distanza di diffusione dell&#39;ossigeno in tal modo tra la membrana e le cellule, il tempo di equilibrio ed efficacia. Altezze sono stati stabiliti dal vetro intagliato i messaggi legati alla parte inferiore del dispositivo. Tutte le dimensioni triennale post resa equilibrio tempi molto migliorata nel corso della camera di ipossia. Si noti che il tempo è su una scala logaritmica. B) Plot raffigurante il rapido tempo di equilibrio di ossigeno di risposta del dispositivo 0,2 millimetri gap. C) multi-posizione linescans sono state prese in tutto il bene sotto la microcanali per assicurare l&#39;omogeneità della concentrazione di ossigeno introdotta dal dispositivo. Il grafico mostra la concentrazione di ossigeno misurata dopo infusione di 0%, 10% e 21% di ossigeno per 10 minuti. D) del dispositivo mantiene efficacemente il 10% di ossigeno in 5 giorni. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/1695/1695fig3.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig3tmb.jpg" alt="Figura 3" border="0" /></a> Figura 3. Sperimentazione con i disegni più complessi ossigeno microcanali. A) di configurazione Dual-microcanali produce una condizione stabile dello 0% e il profilo di ossigeno del 21% oltre 14 giorni. B) Un modello interdigitati e tortuose di microcanali micron di larghezza max 500 ° si estende attraversorisultati pilastro e in un profilo ciclico ossigeno. Si noti che i dati rappresenta solo uno studio di rappresentanza come l&#39;allineamento a microcanali è stata difficile. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/1695/1695fig5.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig5tmb.jpg" alt="Figura 4" border="0" /></a> Figura 4. Immagini Timelapse di chiusura della ferita 0, 7, e 17 ore dopo zero iniziale. Le cellule sono state consegnate 21% di ossigeno per tutta la durata dell&#39;esperimento. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/1695/1695fig6.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig6tmb.jpg" alt="Figura 5" border="0" /></a> Figura 5. Effetto della concentrazione di ossigeno sul tasso di guarigione delle ferite in un test di zero.

Il dispositivo è fabbricato dalla norma SU-8 fotolitografia, stampaggio replica, e definito filatura e fatto interamente di polidimetilsilossano. Il gas è introdotto nel dispositivo di stabilire un gradiente di concentrazione tra il pilastro microcanali e terreni di coltura, guida il sistema verso una concentrazione di ossigeno equilibrio desiderato. Il dispositivo ha dimostrato di modulare efficacemente l&#39;ossigenazione temporale e spaziale all&#39;interno di un pozzo, così come modulare il comportamento cellulare in modo appropriato. Il modello spaziale di ossigenazione è definito dal microcanali alla base del pilastro, così una varietà di disegni potrebbero essere attuate nella realizzazione dei fotomaschera. Inoltre, l&#39;infusione del gas desiderato nella fase gassosa del pozzo dovrebbe migliorare il tempo di equilibrio e misura di ipossia. Una rete microfluidica miscelazione potrebbe essere adattato al dispositivo per fornire un mezzo per la produzione di miscele di gas romanzo da solo un paio di serbatoi di gas magazzino. Infine, un meccanismo per lo scambio dei media eliminerebbe la necessità per la rimozione del dispositivo dal piatto pozzetti, di cui le cellule possono rispondere. Il dispositivo ha le applicazioni in qualsiasi esperimento in vitro o ex vivo che richiedono il controllo della concentrazione di ossigeno. Come l&#39;ossigeno è una variabile importante fisiologica interessano una vasta maggioranza di vie di segnalazione, le aree di ricerca che potrebbero trarre beneficio è limitato dalla creatività del ricercatore. Alcuni campi che potrebbero trarre beneficio dalla maggiore controllo temporale della concentrazione di ossigeno sono metastasi del cancro, apnea del sonno, e danno da riperfusione ischemia cardiaca, tra molti altri. Per esempio, l&#39;ipossia intermittente è stata correlata con i tumori più invasivi, upregulating metastastis un certo numero di geni associati alla relativa ipossia continuo e normossia. Controllo spaziale è anche importante, come gradienti di ossigeno sono essenziali per lo sviluppo, zonazione fegato, tossicità da farmaci, e la nicchia delle cellule staminali. Il dispositivo presentato in questo articolo beneficeranno un certo numero di aree di ricerca, fornendo un sistema con un ingombro più piccolo laboratorio, le esigenze operative relativamente semplice, e il controllo di gran lunga maggiore sovraesposizione ossigeno alle cellule.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>PDMS-Sylgard 184</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Planar FOXY sensor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ocean Optics</td>
<td>FOXY-SGS-M</td>
<td>Coated microscope slide</td>
</tr>
<tr>
<td>Gas regulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Omega</td>
<td>FL-1472-G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gas</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Airgas</td>
<td>Custom mixes</td>
<td>All have 5% CO2</td>
</tr>
<tr>
<td>SU-8 2150</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Microchem</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MDCK Growth Medium w/ L-Glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SAFC Biosciences</td>
<td>M3803</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>30-2020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin-EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T4049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-Glutamine solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G7513</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

fabrication and operation of an oxygen insert for adherent cellular cultures 

L&#39;ossigeno è un modulatore chiave di molte vie cellulari, ma i dispositivi di corrente permettendo<em&gt; In vitro</emDi ossigeno&gt; modulazione non riescono a soddisfare le esigenze della ricerca biomedica. La camera ipossica offre un sistema semplice per controllare l&#39;ossigenazione in recipienti di coltura standard, ma manca di un preciso controllo temporale e spaziale oltre la concentrazione di ossigeno sulla superficie cellulare, prevenendo la sua applicazione nello studio di una varietà di fenomeni fisiologici. Altri sistemi hanno migliorato la camera ipossica, ma richiedono conoscenze specialistiche e attrezzature per il loro funzionamento, che li rende intimidatorio per il ricercatore medio. Un inserto di microfabbricazione per piastre a pozzetti multipli è stato sviluppato per controllare più efficacemente la concentrazione di ossigeno temporale e spaziale dei fenomeni fisiologici modello migliore trovati<em&gt; In vivo</em&gt;. La piattaforma consiste in un inserto polidimetilsilossano che nidifica in una piastra standard pozzetti e funge da rete passiva a gas microfluidica con un gas-permeabile membrana scopo di modulare l&#39;apporto di ossigeno alle cellule aderenti. Il dispositivo è semplice da usare ed è collegata a bombole di gas che forniscono la pressione per introdurre la concentrazione di ossigeno desiderata nella piattaforma. Fabbricazione comporta una combinazione di standard di SU-8 fotolitografia, stampaggio replica, e definito PDMS girare su un wafer di silicio. I componenti del dispositivo sono incollati dopo il trattamento della superficie con una mano al plasma. La convalida è realizzato con un sensore planare ossigeno fluorescenti. Il tempo di equilibrio è nell&#39;ordine di minuti e una vasta gamma di profili di ossigeno può essere raggiunto sulla base della progettazione di dispositivi, come ad esempio il profilo cyclic raggiunti in questo studio, e anche i gradienti di ossigeno per imitare quelli che si trovano<em&gt; In vivo</em&gt;. Il dispositivo può essere sterilizzato per colture cellulari utilizzando metodi comuni senza perdita di funzionalità. Il dispositivo applicabilità a studiare la<em&gt; In vitro</emFerita&gt; risposta di guarigione sarà dimostrato.

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Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures

Realizzazione e validazione di un add-on piattaforma che offre un controllo maggiore sulla ossigenazione spaziale e temporale in un 6-pozzetti. Il dispositivo è adattabile a una serie di sistemi di coltura e può essere utilizzato per studiare gli effetti di ossigeno sulla guarigione delle ferite.

Realizzazione e di funzionamento di un Inserto di ossigeno per colture cellulari aderenti

Oxygen is a key modulator of many cellular pathways, but current devices permitting in vitro oxygen modulation fail to meet the needs of biomedical ...

fabrication-operation-an-oxygen-insert-for-adherent-cellular

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures 

9.6K Views.  University of Illinois. Realizzazione e validazione di un add-on piattaforma che offre un controllo maggiore sulla ossigenazione spaziale e temporale in un 6-pozzetti. Il dispositivo è adattabile a una serie di sistemi di coltura e può essere utilizzato per studiare gli effetti di ossigeno sulla guarigione delle ferite.

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Large Insert Environmental Genomic Library Production

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent environmental genomic (i.e. metagenomic) approaches have emerged, enabling researchers to bridge this cultivation gap by capturing the genetic content of indigenous microbial communities directly from the environment. To this end, genomic DNA libraries are constructed using standard albeit artful laboratory cloning techniques. Here we describe the construction of a large insert environmental genomic fosmid library with DNA derived from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord. This protocol is directly linked to a series of connected protocols including coastal marine water sampling [1], large volume filtration of microbial biomass [2] and a DNA extraction and purification protocol [3]. At the outset, high quality genomic DNA is end-repaired with the creation of 5 -phosphorylated blunt ends. End-repaired DNA is subjected to pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) for size selection and gel extraction is performed to recover DNA fragments between 30 and 60 thousand base pairs (Kb) in length. Size selected DNA is purified away from the PFGE gel matrix and ligated to the phosphatase-treated blunt-end fosmid CopyControl vector pCC1 (EPICENTRE <a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385">http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Linear concatemers of pCC1 and insert DNA are subsequently headfull packaged into phage particles by lambda terminase, with subsequent infection of phage-resistant E. coli cells. Successfully transduced clones are recovered on LB agar plates under antibiotic selection and archived in 384-well plate format using an automated colony picking robot (Qpix2, GENETIX). The current protocol draws from various sources including the CopyControl Fosmid Library Production Kit from EPICENTRE and the published works of multiple research groups [4-7]. Each step is presented with best practice in mind. Whenever possible we highlight subtleties in execution to improve overall quality and efficiency of library production. The whole process of fosmid library production and automated colony picking takes at least 7-10 days as there are many incubation steps included. However, there are several stopping points possible which are mentioned within the protocol.

Construction of a fosmid library with environmental genomic DNA isolated from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord is described. The resulting clone library is picked into 384-well plates and archived for downstream sequencing and functional screening by the application of an automated colony picking system.

Inserire grande Ambientale Genomic Produzione Biblioteca

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

Ricerca

Biologia

The Microfluidic Probe: Operation and Use for Localized Surface Processing

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. Microfluidics is commonly associated with closed microchannels which limit their use to samples that can be introduced, and cultured in the case of cells, within a confined volume. On the other hand, micropipetting system have been used to locally perfuse cells and surfaces, notably using push-pull setups where one pipette acts as source and the other one as sink, but the confinement of the flow is difficult in three dimensions. Furthermore, pipettes are fragile and difficult to position and hence are used in static configuration only. 
The microfluidic probe (MFP) circumvents the constraints imposed by the construction of closed microfluidic channels and instead of enclosing the sample into the microfluidic system, the microfluidic flow can be directly delivered onto the sample, and scanned across the sample, using the MFP. . The injection and aspiration openings are located within a few tens of micrometers of one another so that a microjet injected into the gap is confined by the hydrodynamic forces of the surrounding liquid and entirely aspirated back into the other opening. The microjet can be flushed across the substrate surface and provides a precise tool for localized deposition/delivery of reagents which can be used over large areas by scanning the probe across the surface. 
In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer.

In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer solution.

La sonda Microfluidic: funzionamento e utilizzo per l&#39;elaborazione delle superfici localizzate

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. ...

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

In situ Frazionamento subcellulare di cellule di mammifero aderenti e non aderenti

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. Apart from documenting the method, the initial landmark study generated the first radiation-dose response curve for X-ray irradiated mammalian (HeLa) cells in culture1. Basically, the clonogenic assay enables an assessment of the differences in reproductive viability (capacity of cells to produce progeny; i.e. a single cell to form a colony of 50 or more cells) between control untreated cells and cells that have undergone various treatments such as exposure to ionising radiation, various chemical compounds (e.g. cytotoxic agents) or in other cases genetic manipulation. The assay has become the most widely accepted technique in radiation biology and has been widely used for evaluating the radiation sensitivity of different cell lines. Further, the clonogenic assay is commonly used for monitoring the efficacy of radiation modifying compounds and for determining the effects of cytotoxic agents and other anti-cancer therapeutics on colony forming ability, in different cell lines. A typical clonogenic survival experiment using adherent cells lines involves three distinct components, 1) treatment of the cell monolayer in tissue culture flasks, 2) preparation of single cell suspensions and plating an appropriate number of cells in petri dishes and 3) fixing and staining colonies following a relevant incubation period, which could range from 1-3 weeks, depending on the cell line. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cell lines with the use of an immortalized human keratinocyte cell line (FEP-1811)2. Also, our aims are to describe common features of clonogenic assays including calculation of the plating efficiency and survival fractions after exposure of cells to radiation, and to exemplify modification of radiation-response with the use of a natural antioxidant formulation.

The applicability of the clonogenic assay for evaluating reproductive viability has been established for more than 50 years. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cells.

Clonogenica saggio: cellule aderenti

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

Uno strumento di analisi che quantifica Modifiche morfologia cellulare dalle immagini a fluorescenza tridimensionali

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the neural tube in a process known as neurulation. During neurulation, morphogenesis of the mesenchyme that underlies the neural plate is believed to drive neural fold elevation. The cranial mesenchyme is comprised of the paraxial mesoderm and neural crest cells. The cells of the cranial mesenchyme form a pourous meshwork composed of stellate shaped cells and intermingling extracellular matrix (ECM) strands that support the neural folds. During neurulation, the cranial mesenchyme undergoes stereotypical rearrangements resulting in its expansion and these movements are believed to provide a driving force for neural fold elevation. However, the pathways and cellular behaviors that drive cranial mesenchyme morphogenesis remain poorly studied. Interactions between the ECM and the cells of the cranial mesenchyme underly these cell behaviors. Here we describe a simple ex vivo explant assay devised to characterize the behaviors of these cells. This assay is amendable to pharmacological manipulations to dissect the signaling pathways involved and live imaging analyses to further characterize the behavior of these cells. We present a representative experiment demonstrating the utility of this assay in characterizing the migratory properties of the cranial mesenchyme on a variety of ECM components.

The cranial mesenchyme undergoes dramatic morphogenic movements that likely provides a driving force for elevation of the neural folds1,2. Here we describe a simple ex vivo explant assay to characterize the cellular behaviors of the cranial mesenchyme during neurulation. This assay has numerous applications including being amenable to pharmacological manipulations and live imaging analyses.

Un test per la valutazione dei comportamenti Espianto cellulare del Mesenchima cranio

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or eliminated either catalytically or spontaneously. Due to the short life spans of most ROS and the diversity of their sources and subcellular localizations, a complete picture can be obtained only by careful measurements using a combination of protocols. Here, we present a set of three different protocols using OxyBurst Green (OBG)-coated beads, or dihydroethidium (DHE) and Amplex UltraRed (AUR), to monitor qualitatively and quantitatively various ROS in professional phagocytes such as Dictyostelium. We optimised the beads coating procedures and used OBG-coated beads and live microscopy to dynamically visualize intraphagosomal ROS generation at the single cell level. We identified lipopolysaccharide (LPS) from E. coli as a potent stimulator for ROS generation in Dictyostelium. In addition, we developed real time, medium-throughput assays using DHE and AUR to quantitatively measure intracellular superoxide and extracellular H2O2 production, respectively.

We adapted a set of protocols for the measurement of reactive oxygen species (ROS) that can be applied in various amoeba and mammalian cellular models for qualitative and quantitative studies.

Individuare, visualizzare e quantificare la generazione di specie reattive dell&#39;ossigeno in un modello di sistema di Amoeba

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

Sviluppo di un sistema di inserimento co-coltura di due tipi cellulari in assenza del cellula-cellula di contatto

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and develops most often in the setting of immunosuppression. Despite decades of research, optimal treatment of KS remains poorly defined and clinical outcomes are especially unfavorable in resource-limited settings. KS lesions are driven by pathological angiogenesis, chronic inflammation, and oncogenesis, and various in vitro cell culture models have been developed to study these processes. KS arises from KSHV-infected cells of endothelial origin, so EC-lineage cells provide the most appropriate in vitro surrogates of the spindle cell precursor. However, because EC have a limited in vitro lifespan, and as the oncogenic mechanisms employed by KSHV are less efficient than those of other tumorigenic viruses, it has been difficult to assess the processes of transformation in primary or telomerase-immortalized EC. Therefore, a novel EC-based culture model was developed that readily supports transformation following infection with KSHV. Ectopic expression of the E6 and E7 genes of human papillomavirus type 16 allows for extended culture of age- and passage-matched mock- and KSHV-infected EC and supports the development of a truly transformed (i.e., tumorigenic) phenotype in infected cell cultures. This tractable and highly reproducible model of KS has facilitated the discovery of several essential signaling pathways with high potential for translation into clinical settings.

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is a tumor induced by infection with the oncogenic virus human herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV). The endothelial cell culture model described here is uniquely suited for studying the mechanisms by which KSHV transforms host cells.

Un modello In Vitro per lo studio della trasformazione cellulare da Herpesvirus Sarcoma di Kaposi

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator and that it is possible to monitor and quantify single cells along several cell cycles. We describe the full protocol used to monitor and quantify a HeLa cell culture for 2.7 days. First, cell culture acquisition is performed with a lens-free video microscope, and then the data is analyzed following a four-step process: multi-wavelength holographic reconstruction, cell-tracking, cell segmentation and cell division detection algorithms. As a result, we show that it is possible to gather a dataset featuring more than 10,000 cell cycle tracks and more than 2 x 106 cell morphological measurements.

Lens-free video microscopy enables us to monitor cell cultures directly inside the incubator. Here we describe the full protocol used to acquire and analyze a 2.7 day long acquisition of cultured HeLa cells, leading to a dataset of 2.2 x 106 measurements of individual cell morphology and 10584 cell cycle tracks.

Lente-free Video microscopia per la dinamica e analisi quantitativa della coltura delle cellule aderenti

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...