Este proyecto fue financiado por el Departamento de Salud Pública y de la National Science Foundation (DBI-0852416).

1. Dispositivo de función <ol><li> El dispositivo de inserción de hipoxia contiene 6 pilares que anidan en un estándar de 6 pocillos. Los flujos de gas en la columna, a través de una red de microfluidos en la base de la columna, y fluye de vuelta fuera del dispositivo. En la base de la columna que forman la pared del fondo del microcanal es de 100 micras de espesor de gas permeable membrana de PDMS que permite la difusión de oxígeno entre el gas de microcanal y los medios de cultivo. De este modo, el dispositivo funciona mediante el establecimiento de un gradiente de concentración que impulsa la concentración de oxígeno hacia los medios de comunicación un valor deseado. </li><li> El dispositivo ofrece una serie de ventajas frente a la cámara de hipoxia y otros sistemas de oxigenación celular: 1) reduce al mínimo la trayectoria de difusión de oxígeno que permite el control temporal rápido, 2) mejora el control espacial sobre la oxigenación, ya que depende del diseño del pilar de microcanales, 3) posee una una huella más pequeña de laboratorio y un mayor rendimiento para aumentar la eficiencia experimental, y 4) se adapta a las herramientas comunes de cultivo celular (por ejemplo, la placa de pocillos múltiples) sin necesidad de conocimientos especializados y el equipo. </li></ol> 2. Fabricación de los dispositivos <ol><li> Primer pilar de la matriz es réplica de moldeado con PDMS en un molde previamente Delran mecanizado. </li><li> A continuación, el gas de microcanales en la parte inferior de cada pilar se fabrica utilizando estándar de SU-8 fotolitografía y moldeado PDMS réplica. </li><li> El gas de membrana, es fabricado por giro definido de PDMS sobre una oblea de silicio para lograr el espesor deseado. En este ejemplo se utiliza una membrana de 100 micras de espesor que ha sido fabricado por girar 500 rpm durante 10 segundos y 900 rpm durante 30 segundos. </li><li> Todos los componentes están unidos entre sí después del tratamiento con oxígeno de plasma con un dispositivo de plasma portátil (modelo BD-20, Electro-Técnica de Productos). </li></ol> 3. Instalación de dispositivos <ol><li> Suavemente inserte el dispositivo en la placa, asegurándose de que no queden burbujas. Inclinando el dispositivo durante la inserción ayuda a expulsar las burbujas de un lado. Por real basados ​​en células experimentos, este paso se debe hacer dentro de una campana de flujo laminar estéril. Las posibilidades de que la contaminación se reducen considerablemente una vez que el dispositivo se inserta, por lo que el montaje se puede llevar a la incubadora en un ambiente no estéril. </li><li> Conecte el tubo del depósito de gasolina de origen a los puertos de entrada y salida del dispositivo. Para los experimentos basados ​​en células, la incubadora de la cultura debe tener un agujero para permitir la entrada tubo y el tubo debe ser conectado después de llevar el dispositivo y ponerlo en la incubadora. Tenga cuidado de no poner un exceso de presión en el dispositivo, lo que podría deformar el PDMS para aplastar a las células subyacentes. </li><li> Asegúrese de que el regulador de flujo de precisión se cierra antes de abrir la tapa del tanque regulador para evitar el desbordamiento del dispositivo. Iniciar el flujo de gas. Suavemente precisión abrir el regulador de flujo de caudal deseado (50-100 ml / min). Ver el valor de cerca durante la siguiente hora y hacer los ajustes necesarios, ya que la caída de presión va a cambiar mientras el sistema se equilibra, alterando la velocidad de flujo. Para evitar la formación de burbujas en los medios de comunicación, reducir el caudal de entre 10-20 ml / min después de una inicial de 15 minutos duración del equilibrado con el caudal más alto. </li><li> Después de duración deseada experimental, detener el flujo de gas, quitar la placa, y las células de proceso en consecuencia (por ejemplo, lisar, mancha, cuenta, etc.) </li></ol> 4. Dispositivo de validación <ol><li> Calibración <ol><li> Seleccione el número y la ubicación de las posiciones en el oxígeno fluorescentes (FOXY) sensor de deslizamiento (en función de los requisitos de validación) que será utilizado para la medición de oxígeno. La diapositiva contiene una capa de rutenio tinte fluorescente que se apaga por el oxígeno. </li><li> Exponer de diapositivas directamente a 0, 10 y 21% de oxígeno del tanque de gas y la captura de imágenes después de 5 minutos para el equilibrio adecuado. </li><li> Exportar la intensidad de la imagen significa que para cada puesto y la concentración de la oxigenación trama que depende de la intensidad fluorescente. </li><li> Generar la curva de calibración mediante el ajuste de las curvas lineales de la línea 00-10% y 10-21% de línea. </li></ol></li><li> Heterogeneidad <ol><li> Establecer múltiples puntos que abarca el ancho del canal en un intervalo definido (por ejemplo, cada 1 mm). Tenga en cuenta que puede haber superposición de imágenes en función de la distancia. </li><li> Medir la concentración de oxígeno en la superficie, así a través del dispositivo </li></ol></li><li> Equilibrio <ol><li> Elija tres puntos en la diapositiva en la que FOXY para medir la concentración de oxígeno. </li><li> Inmediatamente después de la captura de una imagen por primera vez en los niveles de oxígeno en el ambiente, abra el regulador de flujo de precisión para iniciar el flujo de gas en el dispositivo. Capturar imágenes a intervalos apropiados para evaluar la duración y el alcance de Concentr oxígenoción de equilibrio (por ejemplo, cada 10 segundos durante 30 minutos). </li></ol></li></ol> 5. Aplicaciones <ol><li> Curación de Heridas <ol><li> Un día antes del experimento, tomar la esterilización insertar PDMS en medio libre de suero para reducir el inhibir la formación de burbujas de gas en el pozo. </li><li> Las células de cultivo a 100% de confluencia en una placa de 6 pocillos. </li><li> Crear arañazos directamente en las monocapas con una punta de pipeta p200 para simular heridas. </li><li> Aspirar los medios de comunicación celular, lavar con 5 ml de medio, y aspirar de nuevo. Es importante no perturbar la monocapa de células. </li><li> Rellenar los pozos con 4 ml medio libre de suero para reducir la proliferación celular. </li><li> Lugar insertar en los pozos y conectar cada pocillo a una concentración de oxígeno correspondiente. </li><li> Lugar de 6 pocillos con inserción en el escenario se calienta a 37 ° C. </li><li> Capturar imágenes de lapso de tiempo de las células en el intervalo deseado y la duración total. T_Scratch MATLAB, un algoritmo de medición de la herida, se puede utilizar para analizar la superficie sin cicatrizar. </li></ol></li></ol> 6. Resultados representante <ol><li> Dispositivo de validación El dispositivo de inserción de hipoxia presenta grandes mejoras en la cámara de hipoxia en términos de tiempo y el grado de equilibrio de oxígeno, lo que requiere menos de 2 minutos para estabilizar a un 0,5% de oxígeno. La membrana y el tamaño del dispositivo brecha final era el factor crítico para determinar la eficiencia de equilibrio, con tamaños más grandes diferencias que requieren más tiempo para alcanzar el estado de equilibrio los valores de concentración de oxígeno. El dispositivo también permite un gran control sobre la oxigenación espacial en un solo pozo, lo que permite la formación de varias condiciones, e incluso generar un perfil cíclico de oxígeno a través de la superficie del pozo. </li><li> La curación de heridas Monocapas de células fueron expuestas al oxígeno del 10% o 21% y la superficie de la herida se analizó a través del tiempo. Rasguños expuestos a 21% de oxígeno cerrado el más lento y un 10% más rápido. La figura 1 muestra las imágenes de un rasguño en el transcurso de 17 horas. Los gráficos de la Figura 5 se muestra el porcentaje de área de la herida abierta, tanto para las concentraciones de oxígeno durante la duración del experimento. </li></ol> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/1695/1695fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig1tmb.jpg" alt="Figura 1" border="0" /></a> Figura 1. Esquemas y diagramas que ilustran las características del dispositivo. El dispositivo de inserción de oxígeno es fabricado por la fotolitografía convencional (red de microfluidos), piezas de fundición de réplica (de microfluidos red y andamios de inserción), y define giro de PDMS (permeables al gas de membrana). A) El dispositivo de oxígeno incluido dentro de una placa de 6 pocillos. B) Ejemplos de los 24 y 96 y las matrices columna. C) Una sección transversal esquemática de una columna. El oxígeno fluye hacia el dispositivo a través de la entrada y viaja a través de una red de microfluidos en la parte inferior de la columna. El oxígeno puede difundir libremente a través de la membrana permeable al gas PDMS en la parte inferior de la columna y se disuelven en el medio de cultivo. D) Una imagen de microscopio que muestra las diversas características de un pilar de un solo canal desde arriba, con los mensajes de vidrio en condiciones de servidumbre para los estudios de equilibrio. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/1695/1695fig2.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig2tmb.jpg" alt="Figura 2" border="0" /></a> Figura 2. Validación del dispositivo con sensores de oxígeno. La tensión de oxígeno dentro de cada bien se caracterizó con un plano del sensor de oxígeno de rutenio. Todas las mezclas de oxígeno contenido de nitrógeno equilibrada y un 5% de CO 2 para amortiguar los medios de comunicación. A) Parcela que ilustra el efecto de la altura del poste, y por lo tanto la distancia de difusión de oxígeno entre la membrana y las células, en el tiempo de equilibrio y eficacia. Alturas fueron establecidos por los mensajes de cristal tallado con destino a la parte inferior del dispositivo. Los tres tamaños de rendimiento después de tiempos de equilibrio mejorado mucho en la cámara de hipoxia. Tenga en cuenta que el tiempo es en una escala logarítmica. B) Parcela que representa el rápido equilibrio de oxígeno el tiempo de respuesta del dispositivo de 0,2 mm de distancia. C) Multi-posición linescans También se tomaron todo el bien en el microcanal para asegurar la homogeneidad de la concentración de oxígeno introducido por el dispositivo. Gráfico muestra la concentración de oxígeno medida después de la infusión de 0%, 10% y 21% de oxígeno durante 10 minutos. D) El dispositivo mantiene efectivamente un 10% de oxígeno en 5 días. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/1695/1695fig3.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig3tmb.jpg" alt="Figura 3" border="0" /></a> Figura 3. La experimentación con diseños más complejos de oxígeno microcanales. A) la configuración de doble condición de microcanal produce una estabilidad del 0% y el 21% perfil de oxígeno durante 14 días. B) Un patrón interdigitados y la liquidación de 500 micras de ancho microcanales se extiende a través ªe los resultados pilar en un perfil cíclico de oxígeno. Tenga en cuenta que los datos sólo se muestra un ensayo representativo como la alineación de microcanal fue difícil. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/1695/1695fig5.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig5tmb.jpg" alt="Figura 4" border="0" /></a> Figura 4. Timelapse imágenes del cierre de la herida 0, 7, y 17 horas después de la cero inicial. Las células fueron entregados 21% de oxígeno a lo largo de la duración del experimento. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/1695/1695fig6.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig6tmb.jpg" alt="Figura 5" border="0" /></a> Figura 5. Efecto de la concentración de oxígeno en la tasa de cicatrización de la herida en un ensayo de cero.

El dispositivo es fabricado por la norma SU-8 fotolitografía, piezas de fundición de réplica, y se define el hilado y hecho completamente de polidimetilsiloxano. El gas es introducido en el dispositivo para establecer un gradiente de concentración entre el pilar de microcanal y los medios de cultivo, manejo del sistema a una concentración de equilibrio de oxígeno deseado. El dispositivo se ha demostrado que efectivamente modulan la oxigenación temporal y espacial dentro de un pozo, así como modular el comportamiento celular apropiada. El patrón espacial de la oxigenación es definido por el microcanal en la base de la columna, por lo que una gran variedad de diseños podrían aplicarse en la elaboración de la fotomáscara. Además, la infusión del gas deseado en la fase de gas del pozo se espera que mejore el tiempo de equilibrio y el grado de hipoxia. Una red de mezcla de microfluidos podría ser adaptado para el dispositivo para proporcionar un medio para producir mezclas de gas de la novela sólo unos pocos tanques reservas de gas. Finalmente, un mecanismo de intercambio de medios que elimina la necesidad de retirar el dispositivo de la placa de pocillos múltiples, de las cuales las células pueden responder. El dispositivo tiene aplicaciones en cualquier experimento in vitro o ex vivo que requiere el control de la concentración de oxígeno. Como el oxígeno es una importante variable fisiológica que afecta a un gran mayoría de las vías de señalización, las áreas de investigación que se beneficiarían está limitada por la creatividad del investigador. Algunos de los campos que se beneficiarían de un mayor control del temporal de la concentración de oxígeno incluyen la metástasis del cáncer, apnea del sueño, y la lesión cardiaca isquemia-reperfusión, entre muchos otros. Por ejemplo, la hipoxia intermitente se ha relacionado con cánceres más invasivos, upregulating una serie de metastastis asociada a los genes en relación con la hipoxia y normoxia continua. Control del espacio es también importante, ya que los gradientes de oxígeno son fundamentales para el desarrollo, la zonificación del hígado, la toxicidad del fármaco, y el nicho de células madre. El dispositivo se presenta en este artículo se benefician a un número de áreas de investigación, proporcionando un sistema con un tamaño más pequeño de laboratorio, las necesidades operativas relativamente simple, y un mayor control sobre la exposición al oxígeno a las células.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>PDMS-Sylgard 184</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Planar FOXY sensor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ocean Optics</td>
<td>FOXY-SGS-M</td>
<td>Coated microscope slide</td>
</tr>
<tr>
<td>Gas regulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Omega</td>
<td>FL-1472-G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gas</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Airgas</td>
<td>Custom mixes</td>
<td>All have 5% CO2</td>
</tr>
<tr>
<td>SU-8 2150</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Microchem</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MDCK Growth Medium w/ L-Glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SAFC Biosciences</td>
<td>M3803</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>30-2020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin-EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T4049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-Glutamine solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G7513</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

fabrication and operation of an oxygen insert for adherent cellular cultures 

El oxígeno es un modulador clave de muchas vías celulares, pero permitiendo que los dispositivos actuales<em&gt; In vitro</emModulación&gt; oxígeno no cumplen con las necesidades de la investigación biomédica. La cámara de hipoxia ofrece un sistema simple de control de la oxigenación en los recipientes de cultivo estándar, pero carece de un control preciso temporal y espacial en la concentración de oxígeno en la superficie celular, impidiendo su aplicación en el estudio de una variedad de fenómenos fisiológicos. Otros sistemas han mejorado la cámara de hipoxia, pero requieren un conocimiento especializado y equipos para su funcionamiento, por lo que intimidante para el investigador promedio. Una inserción microfabricated de placas multipocillo ha sido desarrollado para controlar más eficazmente la concentración de oxígeno temporal y espacial de los fenómenos fisiológicos encontrado mejor modelo<em&gt; In vivo</em&gt;. La plataforma consta de una inserción de polidimetilsiloxano que anida en un estándar de la placa de pocillos múltiples, y sirve como una red de gas pasivo de microfluidos con una membrana permeable al gas destinado a modular la entrega de oxígeno a las células adherentes. El dispositivo es fácil de usar y está conectado a cilindros de gas que proporcionan la presión para introducir la concentración de oxígeno deseada en la plataforma. Fabricación consiste en una combinación de SU-8 estándar de fotolitografía, piezas de fundición de réplica, y se define PDMS girando sobre una oblea de silicio. Los componentes del dispositivo se unen después de un tratamiento superficial con un sistema de plasma de mano. La validación se realiza con un sensor de oxígeno fluorescentes planas. Tiempo de equilibrio es del orden de minutos y una amplia variedad de perfiles de oxígeno puede ser alcanzado a partir del diseño del dispositivo, como el perfil cíclico alcanzado en este estudio, e incluso los gradientes de oxígeno para imitar las que se encuentran<em&gt; In vivo</em&gt;. El dispositivo puede ser esterilizado para el cultivo celular utilizando métodos comunes, sin pérdida de la función. El dispositivo de aplicación al estudio de la<em&gt; In vitro</emHerida&gt; respuesta de curación se ha demostrado.

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Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures

Fabricación y validación de una plataforma de extensión que ofrece un mayor control sobre la oxigenación espacial y temporal en una placa de 6 pocillos. El dispositivo se adapta a una serie de sistemas de cultivo y se puede utilizar para investigar los efectos del oxígeno en la cicatrización de heridas.

Fabricación y operación de una inserción de oxígeno para Adherente cultivos celulares

Oxygen is a key modulator of many cellular pathways, but current devices permitting in vitro oxygen modulation fail to meet the needs of biomedical ...

fabrication-operation-an-oxygen-insert-for-adherent-cellular

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures 

9.6K vistas.  University of Illinois. Fabricación y validación de una plataforma de extensión que ofrece un mayor control sobre la oxigenación espacial y temporal en una placa de 6 pocillos. El dispositivo se adapta a una serie de sistemas de cultivo y se puede utilizar para investigar los efectos del oxígeno en la cicatrización de heridas.

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Large Insert Environmental Genomic Library Production

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent environmental genomic (i.e. metagenomic) approaches have emerged, enabling researchers to bridge this cultivation gap by capturing the genetic content of indigenous microbial communities directly from the environment. To this end, genomic DNA libraries are constructed using standard albeit artful laboratory cloning techniques. Here we describe the construction of a large insert environmental genomic fosmid library with DNA derived from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord. This protocol is directly linked to a series of connected protocols including coastal marine water sampling [1], large volume filtration of microbial biomass [2] and a DNA extraction and purification protocol [3]. At the outset, high quality genomic DNA is end-repaired with the creation of 5 -phosphorylated blunt ends. End-repaired DNA is subjected to pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) for size selection and gel extraction is performed to recover DNA fragments between 30 and 60 thousand base pairs (Kb) in length. Size selected DNA is purified away from the PFGE gel matrix and ligated to the phosphatase-treated blunt-end fosmid CopyControl vector pCC1 (EPICENTRE <a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385">http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Linear concatemers of pCC1 and insert DNA are subsequently headfull packaged into phage particles by lambda terminase, with subsequent infection of phage-resistant E. coli cells. Successfully transduced clones are recovered on LB agar plates under antibiotic selection and archived in 384-well plate format using an automated colony picking robot (Qpix2, GENETIX). The current protocol draws from various sources including the CopyControl Fosmid Library Production Kit from EPICENTRE and the published works of multiple research groups [4-7]. Each step is presented with best practice in mind. Whenever possible we highlight subtleties in execution to improve overall quality and efficiency of library production. The whole process of fosmid library production and automated colony picking takes at least 7-10 days as there are many incubation steps included. However, there are several stopping points possible which are mentioned within the protocol.

Construction of a fosmid library with environmental genomic DNA isolated from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord is described. The resulting clone library is picked into 384-well plates and archived for downstream sequencing and functional screening by the application of an automated colony picking system.

Inserte grandes Ambiental Genómica Producción Biblioteca

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

Investigación

Biología

The Microfluidic Probe: Operation and Use for Localized Surface Processing

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. Microfluidics is commonly associated with closed microchannels which limit their use to samples that can be introduced, and cultured in the case of cells, within a confined volume. On the other hand, micropipetting system have been used to locally perfuse cells and surfaces, notably using push-pull setups where one pipette acts as source and the other one as sink, but the confinement of the flow is difficult in three dimensions. Furthermore, pipettes are fragile and difficult to position and hence are used in static configuration only. 
The microfluidic probe (MFP) circumvents the constraints imposed by the construction of closed microfluidic channels and instead of enclosing the sample into the microfluidic system, the microfluidic flow can be directly delivered onto the sample, and scanned across the sample, using the MFP. . The injection and aspiration openings are located within a few tens of micrometers of one another so that a microjet injected into the gap is confined by the hydrodynamic forces of the surrounding liquid and entirely aspirated back into the other opening. The microjet can be flushed across the substrate surface and provides a precise tool for localized deposition/delivery of reagents which can be used over large areas by scanning the probe across the surface. 
In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer.

In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer solution.

La sonda de microfluidos: Operación y Uso de tratamiento de superficies localizadas

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. ...

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

En Fraccionamiento subcelular situ de células mamíferas adherentes y no adherentes-

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. Apart from documenting the method, the initial landmark study generated the first radiation-dose response curve for X-ray irradiated mammalian (HeLa) cells in culture1. Basically, the clonogenic assay enables an assessment of the differences in reproductive viability (capacity of cells to produce progeny; i.e. a single cell to form a colony of 50 or more cells) between control untreated cells and cells that have undergone various treatments such as exposure to ionising radiation, various chemical compounds (e.g. cytotoxic agents) or in other cases genetic manipulation. The assay has become the most widely accepted technique in radiation biology and has been widely used for evaluating the radiation sensitivity of different cell lines. Further, the clonogenic assay is commonly used for monitoring the efficacy of radiation modifying compounds and for determining the effects of cytotoxic agents and other anti-cancer therapeutics on colony forming ability, in different cell lines. A typical clonogenic survival experiment using adherent cells lines involves three distinct components, 1) treatment of the cell monolayer in tissue culture flasks, 2) preparation of single cell suspensions and plating an appropriate number of cells in petri dishes and 3) fixing and staining colonies following a relevant incubation period, which could range from 1-3 weeks, depending on the cell line. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cell lines with the use of an immortalized human keratinocyte cell line (FEP-1811)2. Also, our aims are to describe common features of clonogenic assays including calculation of the plating efficiency and survival fractions after exposure of cells to radiation, and to exemplify modification of radiation-response with the use of a natural antioxidant formulation.

The applicability of the clonogenic assay for evaluating reproductive viability has been established for more than 50 years. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cells.

Ensayo clonigénicas: las células adherentes

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

Una herramienta de análisis que cuantifica los cambios celulares Morfología de imágenes tridimensionales de fluorescencia

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the neural tube in a process known as neurulation. During neurulation, morphogenesis of the mesenchyme that underlies the neural plate is believed to drive neural fold elevation. The cranial mesenchyme is comprised of the paraxial mesoderm and neural crest cells. The cells of the cranial mesenchyme form a pourous meshwork composed of stellate shaped cells and intermingling extracellular matrix (ECM) strands that support the neural folds. During neurulation, the cranial mesenchyme undergoes stereotypical rearrangements resulting in its expansion and these movements are believed to provide a driving force for neural fold elevation. However, the pathways and cellular behaviors that drive cranial mesenchyme morphogenesis remain poorly studied. Interactions between the ECM and the cells of the cranial mesenchyme underly these cell behaviors. Here we describe a simple ex vivo explant assay devised to characterize the behaviors of these cells. This assay is amendable to pharmacological manipulations to dissect the signaling pathways involved and live imaging analyses to further characterize the behavior of these cells. We present a representative experiment demonstrating the utility of this assay in characterizing the migratory properties of the cranial mesenchyme on a variety of ECM components.

The cranial mesenchyme undergoes dramatic morphogenic movements that likely provides a driving force for elevation of the neural folds1,2. Here we describe a simple ex vivo explant assay to characterize the cellular behaviors of the cranial mesenchyme during neurulation. This assay has numerous applications including being amenable to pharmacological manipulations and live imaging analyses.

Un ensayo de explante para evaluar el comportamiento celular del mesénquima craneal

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or eliminated either catalytically or spontaneously. Due to the short life spans of most ROS and the diversity of their sources and subcellular localizations, a complete picture can be obtained only by careful measurements using a combination of protocols. Here, we present a set of three different protocols using OxyBurst Green (OBG)-coated beads, or dihydroethidium (DHE) and Amplex UltraRed (AUR), to monitor qualitatively and quantitatively various ROS in professional phagocytes such as Dictyostelium. We optimised the beads coating procedures and used OBG-coated beads and live microscopy to dynamically visualize intraphagosomal ROS generation at the single cell level. We identified lipopolysaccharide (LPS) from E. coli as a potent stimulator for ROS generation in Dictyostelium. In addition, we developed real time, medium-throughput assays using DHE and AUR to quantitatively measure intracellular superoxide and extracellular H2O2 production, respectively.

We adapted a set of protocols for the measurement of reactive oxygen species (ROS) that can be applied in various amoeba and mammalian cellular models for qualitative and quantitative studies.

La detección, la visualización y cuantificación de la generación de especies reactivas de oxígeno en un sistema modelo de la ameba

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

Desarrollo de un Sistema de inserción Co-cultivo de dos tipos celulares en ausencia de la célula-célula Contacto

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and develops most often in the setting of immunosuppression. Despite decades of research, optimal treatment of KS remains poorly defined and clinical outcomes are especially unfavorable in resource-limited settings. KS lesions are driven by pathological angiogenesis, chronic inflammation, and oncogenesis, and various in vitro cell culture models have been developed to study these processes. KS arises from KSHV-infected cells of endothelial origin, so EC-lineage cells provide the most appropriate in vitro surrogates of the spindle cell precursor. However, because EC have a limited in vitro lifespan, and as the oncogenic mechanisms employed by KSHV are less efficient than those of other tumorigenic viruses, it has been difficult to assess the processes of transformation in primary or telomerase-immortalized EC. Therefore, a novel EC-based culture model was developed that readily supports transformation following infection with KSHV. Ectopic expression of the E6 and E7 genes of human papillomavirus type 16 allows for extended culture of age- and passage-matched mock- and KSHV-infected EC and supports the development of a truly transformed (i.e., tumorigenic) phenotype in infected cell cultures. This tractable and highly reproducible model of KS has facilitated the discovery of several essential signaling pathways with high potential for translation into clinical settings.

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is a tumor induced by infection with the oncogenic virus human herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV). The endothelial cell culture model described here is uniquely suited for studying the mechanisms by which KSHV transforms host cells.

Un modelo In Vitro para el estudio de transformación celular por Herpesvirus del Sarcoma de Kaposi

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator and that it is possible to monitor and quantify single cells along several cell cycles. We describe the full protocol used to monitor and quantify a HeLa cell culture for 2.7 days. First, cell culture acquisition is performed with a lens-free video microscope, and then the data is analyzed following a four-step process: multi-wavelength holographic reconstruction, cell-tracking, cell segmentation and cell division detection algorithms. As a result, we show that it is possible to gather a dataset featuring more than 10,000 cell cycle tracks and more than 2 x 106 cell morphological measurements.

Lens-free video microscopy enables us to monitor cell cultures directly inside the incubator. Here we describe the full protocol used to acquire and analyze a 2.7 day long acquisition of cultured HeLa cells, leading to a dataset of 2.2 x 106 measurements of individual cell morphology and 10584 cell cycle tracks.

Lente libre Video microscopia para la dinámica y el análisis cuantitativo del cultivo de células adherentes

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...