La preparazione di espianti lente epiteliale è stato adattato dai metodi origine nel laboratorio del Dr. John McAvoy 9. Questo lavoro è finanziato dal National Eye Institute, Research Program Intramural Z01-EY000238-22

Parte 1: La rimozione di lenti Materiali e reagenti: <ol><li> Micro-dissezione forbici, curvo, consigli smussato, (come as.RS-5983, Roboz Surgical Instrument Co., Inc, Gaithersburg, MD), micro-dissezione pinzette, punta ricurva (come Roboz # RS5137). </li><li> Mezzo di sospensione: Medium 199 contenente 0,1% di albumina sierica bovina, 100 unità / ml di penicillina, streptomicina 100μg/ml, 2,5 mg / ml di amfotericina B. I reagenti sono disponibili da Invitrogen, Carlsbad, CA. </li></ol> Procedimento: <ol><li> Euthanize ratti neonati (di età compresa tra 2-4 giorni) in conformità alle linee guida fornite dal National Institutes of Health, Bethesda, MD. </li><li> Rimuovere le palpebre con le forbici chirurgiche. Premere delicatamente con le pinzette ricurve ai lati opposti della cavità oculare per costringere l&#39;occhio a rigonfiamento verso l&#39;esterno. Fai una piccola incisione nella parte posteriore dell&#39;occhio con le forbici. Premendo con le pinzette contro il lato dell&#39;occhio opposto l&#39;incisione, l&#39;obiettivo e una piccola quantità di corpo vitreo allegati possono poi essere costretto attraverso la rottura, permettendo l&#39;obiettivo di essere prelevati con una pinzetta curva. Si deve prestare attenzione a non rompere la capsula del cristallino. </li><li> Utilizzare le pinzette ricurve per trasferire le lenti per un piatto 60 millimetri di plastica coltura di tessuti contenenti 5 ml caldo, medio sterile sospensione. </li></ol> Parte 2: Microdissezione di espianti Materiali e reagenti: <ol><li> Micro pinzette dissezione, 0,1 punte mm, (come Roboz RS-4976). Noi usiamo lega Dumostar a causa della flessibilità della punta, ma altre leghe di acciaio sono anche accettabili. Pinzetta con punte sottili di 0,1 mm non sono raccomandati, in quanto tendono a rompere o piegare durante questa procedura. </li><li> Sospensione medio (vedere la Parte 1) </li><li> Senza supplementi Ham F12 medio o medio 199 (Invitrogen, Carlsburg, CA) </li></ol> Procedimento: <ol><li> Le seguenti operazioni devono essere eseguite in un ambiente pulito, privo di correnti d&#39;ambiente utilizzando strumenti sterili dissezione e medie sterile. </li><li> Utilizzando un microscopio stereo-dissezione, pulire le lenti di qualsiasi tessuto aderendo con le pinzette 0,1 mm punta e di trasferirli in un secondo piatto 60 millimetri cultura medio sterile contenente 5 ml di sospensione (questo modo è possibile ridurre la contaminazione). Con le pinzette, trasferire il numero desiderato di lenti per un piatto cultura 35 millimetri contenente 5 ml sterile, senza supplementi di media. (Spesso usiamo Ham F12 (Invitrogen) per questo passo, perché la concentrazione di colorante inferiore rende dissezione più facile, tuttavia, Medium 199 è anche accettabile Nessun antibiotici o altre aggiunte sono necessari in questa fase..) Come ben 12 espianti possono essere effettuate al centro di un piatto di queste dimensioni. Tuttavia, un piatto di 35 mm dovrebbe essere utilizzato anche se meno espianti verranno, perché gli strumenti di dissezione non possono essere manipolati facilmente in un piatto più piccolo. Trasferire il piatto contenente le lenti rimanenti per un tessuto cultura incubatore a 37 ° C fino a quando non sono necessari. </li><li> Identificare il lato posteriore del cristallino. Ci sono molti modi per riconoscere questo: 1) Il posteriore è più rotondo rispetto alle anteriori, che è leggermente appiattita, 2) le lenti a forma di ratto neonato cataratta freddo come si raffreddano a temperatura ambiente durante la dissezione. Se la cataratta freddo non ha completamente riempito la lente, il lato posteriore è il lato più lontano dalla regione opaca. Se l&#39;opacità ha riempito la lente, il riscaldamento il piatto a 37 ° C per qualche minuto lo retromarcia. Il lato posteriore può essere identificato come le riforme cataratta sul raffreddamento. 3) Le vestigia della tunica lentis vasculosa possono essere visibili sul lato posteriore. 4) La sutura posteriore può essere visibile sul lato posteriore. Identificare il lato posteriore correttamente è fondamentale, poiché è qui che la capsula sarà aperto. Aprendo la lente sulla parte anteriore si strappa l&#39;epitelio. </li><li> Una volta che il lato posteriore è stato identificato, si volta verso l&#39;alto e afferrare la lente le pinzette sinistra (per un destrorso lavoratore). Poi un pizzico della capsula posteriore con la pinzetta diritto di produrre una piccola piega. </li><li> Mentre si tiene la capsula posteriore con le pinze a destra, afferrare la piega della capsula con le pinze sinistra e tirate le due paia di pinzette in direzioni opposte per fare un piccolo strappo nella capsula. </li><li> Mentre afferrare il bordo della capsula retrattile con le pinze, tirarlo verso il basso, prima da una parte, poi dall&#39;altra, premendo in plastica del piatto con la pinzetta. Ripetere questa operazione diverse volte, spostando tutto il equatore della lente, fino a quando la capsula è saldamente attaccato alla piastra in molti punti. Tenendo la capsula in posizione con le pinzette sinistra, agitare delicatamente la massa di fibre con la pinzetta diritto di rompere l&#39;attaccamento tra le cellule delle fibre e le cellule epiteliali all&#39;equatore lente. Quindi spingere la massa di fibre di distanza, rotolare fuori della capsula / epitelio, che rimane attaccato al fondo dellapiatto. Continuare questo processo con tutti gli obiettivi nel piatto. Rimuovere e gettare le masse fibra (o salvarli congelati come fonte di proteine ​​lente per altri studi). </li></ol> Parte 3: Microdissezione e la cultura di espianti centrale Materiali e reagenti: <ol><li> Sterili monouso bisturi, lama # 15, (Surgical Co. Cincinnati Cincinnati, OH) </li><li> Fosfato sterile salina tamponata con calcio e magnesio (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li> Terreno di coltura: media Sospensione contenente 100ng/ml FGF-2 (Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO). </li></ol> Procedimento: <ol><li> Usando un bisturi sterile, tagliare via l&#39;epitelio periferici (PE), che contiene le cellule nelle prime fasi della differenziazione (Figura 1A), lasciando una piazza centrale di circa 2,0 millimetri di lato, composto da centrale, cellule epiteliali solo (CE) (Figura 1B). </li><li> Trasferire il piatto contenente il espianti centrale di un armadio biosicurezza. Lavare 3 volte con PBS sterile contenente calcio e magnesio e una volta con 1 ml di fresco, equilibrato (37 ° C, 5% CO 2) mezzo di sospensione. Questi lavaggi ridurre notevolmente la probabilità di contaminazione. </li><li> Aggiungere 2 ml di terreno di coltura per indurre la differenziazione 1, e posizionare il espianti in un umidificata, colture di tessuti incubatore a 37 ° C, 5% di CO 2. Periodi di cultura può essere il più breve di poche ore o di estendere fino a due o tre settimane, a seconda del parametro oggetto di studio. Medio dovrebbe essere cambiato ogni due o tre giorni. </li></ol> Parte 4: raccolta di espianti per l&#39;analisi di eventi associati con differenziazione 1. Espianti di raccolta per l&#39;analisi di proteine ​​o RNA Materiali: <ol><li> Pinzette Microdissecting </li><li> SDS Lysis Buffer o RNA dopo </li></ol> Procedimento: <ol><li> Al termine del periodo di incubazione, rimuovere il terreno di coltura. </li><li> Utilizzando il microscopio stereo-dissezione, allentare leggermente i bordi di ogni espianto. </li><li> Sollevare ogni espianto con le pinzette e trasferirlo in una provetta contenente circa tampone 100μl lisi SDS (per l&#39;analisi delle proteine) o RNA-successivo (per l&#39;analisi del RNA). Agitare la punta delle pinzette nella soluzione per garantire che l&#39;espianto non si attacca alle pinzette. </li></ol> 2. Espianti di raccolta per immunofluorescenza Materiali e reagenti: <ol><li> Tampone fosfato di calcio e magnesio (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li> Tampone fosfato (senza calcio e magnesio) (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li> 4% paraformaldeide (Bioproducts Boston, Worcester, MA) </li><li> Pinzette Microdissecting </li><li> Idrofobo pennarello </li><li> Vetrini per microscopio </li><li> 0,25% Triton X-100 in tampone fosfato salino. </li></ol> Procedimento: <ol><li> Sciacquare espianti brevemente in PBS contenente calcio e magnesio. </li><li> Fissare i tessuti con l&#39;aggiunta di 4% paraformaldeide per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Togliere il fissativo e sostituire con tampone fosfato. Espianti fisso diventare un po &#39;rigida, permettendo loro di essere sollevato e trasferito alle diapositive di vetro per immunocolorazione. </li><li> Mettere una piccola goccia di PBS (senza calcio e magnesio) sulla diapositiva per posizionare il tessuto e prevenire il curling. Utilizzando le pinzette microdissecting, sollevare l&#39;espianto e inserirlo nel menu della diapositiva. Senza toccare l&#39;espianto, rimuovere con attenzione il liquido con uno stoppino di carta per appiattire l&#39;espianto sul vetro e lasciare asciugare il tessuto in aria a temperatura ambiente per 3 a 5 minuti. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1519/fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1 A. L&#39;epitelio periferico esprime differenziazione specifiche proteine. L&#39;espianto è stato mostrato immunostained per N-caderina subito dopo microdissezione. Espressione è visto in una banda di cellule nell&#39;epitelio periferici, indicando che le cellule in questa regione hanno cominciato a differenziarsi. B. L&#39;epitelio periferica può essere tagliata fuori per rimuovere le cellule che esprimono N-caderina e altre differenziazione specifiche proteine. L&#39;anello rosso rappresenta l&#39;ubicazione delle cellule che esprimono N-caderina, mentre la piccola piazza delineato in grigio rappresenta il quadrante dell&#39;epitelio mostrato nel pannello di 1A. L&#39;epitelio periferica può essere rimossa da quattro tagli di bisturi, lasciando una piazza centrale che contiene solo le celle che non hanno ancora cominciato a differenziarsi.

<ol>
	<li>McAvoy, J. W., Chamberlain, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+(FGF)+induces+different+responses+in+lens+epithelial+cells+depending+on+its+concentration.">Fibroblast growth factor (FGF) induces different responses in lens epithelial cells depending on its concentration.</a> Development. 107 (2), 221-228 (1989).</li><li>Campbell, M. T., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+of+fibre+differentiation+in+cultured+rat+lens+epithelium+under+the+influence+of+neural+retina-conditioned+medium.">Onset of fibre differentiation in cultured rat lens epithelium under the influence of neural retina-conditioned medium.</a> Exp Eye Res. 39 (1), 83-94 (1984).</li><li>Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+lens+epithelial+explants+induced+to+differentiate+into+fibres+by+fibroblast+growth+factor+(FGF).">Structural analysis of lens epithelial explants induced to differentiate into fibres by fibroblast growth factor (FGF).</a> Exp Eye Res. 49 (3), 479-494 (1989).</li><li>Golestaneh, N., Fan, J., Fariss, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lens+major+intrinsic+protein+(MIP)/aquaporin+0+expression+in+rat+lens+epithelia+explants+requires+fibroblast+growth+factor-induced+ERK+and+JNK+signaling.">Lens major intrinsic protein (MIP)/aquaporin 0 expression in rat lens epithelia explants requires fibroblast growth factor-induced ERK and JNK signaling.</a> J Biol Chem. 279 (30), 31813-31822 (2004).</li><li>Saravanamuthu, S. S., Gao, C. Y., Zelenka, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+is+required+for+lateral+induction+of+Jagged1+during+FGF-induced+lens+fiber+differentiation.">Notch signaling is required for lateral induction of Jagged1 during FGF-induced lens fiber differentiation.</a> Dev Biol. 332 (1), 166-176 (2009).</li><li>Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF-induced+lens+cell+proliferation+and+differentiation+is+dependent+on+MAPK+(ERK1/2)+signalling.">FGF-induced lens cell proliferation and differentiation is dependent on MAPK (ERK1/2) signalling.</a> Development. 128 (24), 5075-5084 (2001).</li><li>Dirks, R. P., Kraft, H. J., Van Genesen, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cooperation+between+two+silencers+creates+an+enhancer+element+that+controls+both+the+lens-preferred+and+the+differentiation+stage-specific+expression+of+the+rat+beta+B2-crystallin+gene.">The cooperation between two silencers creates an enhancer element that controls both the lens-preferred and the differentiation stage-specific expression of the rat beta B2-crystallin gene.</a> Eur J Biochem. 239 (1), 23-32 (1996).</li><li>Yang, Y., Stopka, T., Golestaneh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+alphaA-crystallin+via+Pax6,+c-Maf,+CREB+and+a+broad+domain+of+lens-specific+chromatin.">Regulation of alphaA-crystallin via Pax6, c-Maf, CREB and a broad domain of lens-specific chromatin.</a> The EMBO journal. 25 (10), 2107-2118 (2006).</li><li>McAvoy, J. W., T, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+retinas+promote+cell+division+and+fibre+differentiation+in+lens+epithelial+explants.">Neural retinas promote cell division and fibre differentiation in lens epithelial explants.</a> Curr Eye Res. 3 (6), 827-834 (1984).</li></ol>

L&#39;obiettivo del sistema di ratto espianto è stato usato con successo da una serie di laboratori per studiare differenziazione terminale delle cellule epiteliali alle fibre lente lente 21,3,4,5. Se esposto a FGF-2 a 100ng/ml il espianti inizierà a mostrare i cambiamenti nella segnalazione in pochi minuti 6, con i cambiamenti nella morfologia e l&#39;espressione genica che appaiono in sequenza nell&#39;arco di diversi giorni 3,4,5. Le culture rimanere vitali per 2-3 settimane se si ha cura di evitare contaminazioni. Il espianti centrale descritte in questo protocollo sono particolarmente utili per lo studio della sequenza di eventi associati con la differenziazione, in quanto contengono pochi se le cellule che esprimono marcatori di differenziazione prima di FGF-2 si aggiunge 1,5. Le cellule si differenziano in modo sincrono, come una coorte, il che rende possibile seguire l&#39;andamento temporale di segnalazione e di eventi trascrizionali associati differenziazione. Espianti coltura per periodi di tempo diversi quindi fornisce precise informazioni temporali sugli eventi sequenza. Inibitori specifici possono essere aggiunti al mezzo di coltura per identificare vie di segnalazione rilevanti. Espianti possono essere utilizzati per analizzare l&#39;espressione proteica mediante elettroforesi su gel SDS e immunoblotting o per analizzare l&#39;espressione di mRNA specifico mediante RT-PCR. Proteine ​​gamma rendimenti 20-50 mg / espianto e la resa è di circa RNA 200-600 ng / espianto, a seconda della lunghezza del periodo di cultura. Siamo in generale che per ogni piatto 5-6 espianti fornirà sufficienti proteine ​​o RNA per analisi diverse. RNA da espianti possono essere utilizzati anche per la preparazione del DNA per valutare l&#39;espressione genica mediante l&#39;analisi microarray, in grado di identificare nuovi geni che potrebbero essere cruciali per la differenziazione. Espianti possono anche essere transfettate. Anche se l&#39;efficienza di trasfezione è generalmente bassa, è sufficiente per il saggio geni reporter 4, 7, 8. Microscopia a immunofluorescenza del espianti fornisce un utile complemento ai metodi biochimici per determinare la posizione subcellulare di proteine ​​di interesse. Così, la preparazione e la cultura di espianti lente ratto fornisce un sistema potente per lo studio lente differenziazione terminale nei mammiferi, che possono integrare in tecniche in vivo, come la generazione di topi transgenici e knock-out.

preparation and culture of rat lens epithelial explants for studying terminal differentiation

La superficie anteriore della lente oculare è coperto da un monostrato di cellule epiteliali, che proliferano in una zona anulare alla base del corpo ciliare. A seguito di divisione, queste cellule migrano posteriormente, dove la diffusione dalla retina FGF induce a differenziarsi in una serie di cellule allungate posteriore in fibra ottica, che compongono la maggior parte della lente. Differenziazione delle cellule epiteliali in fibre lente lente può essere indotta in vitro da espianti coltura della regione centrale dell&#39;epitelio anteriore in presenza di FGF-2. Espianti sono preparati da lenti di ratti neonati, rimuovendo la lente dall&#39;occhio e di cogliere capsula del cristallino sul lato posteriore con una pinzetta dissezione. La capsula posteriore è poi delicatamente squarciato e premuto sul fondo di un piatto di plastica coltura di tessuti. Le regioni periferiche del espianto vengono rimosse con un bisturi e la zona centrale è poi coltivate in presenza di 100ng/ml FGF-2 per tutto il tempo 2-3 settimane, a seconda dei parametri da studiare. Dato che le cellule epiteliali in espianti in coltura differenziare in sincronia approssimativa per un periodo di giorni o settimane, la durata della segnalazione e l&#39;espressione genica può essere determinata utilizzando tecniche molecolari, biochimiche e farmacologiche. Microscopia a immunofluorescenza è un potente coadiuvante a questi metodi, come dimostra la localizzazione subcellulare di proteine ​​di interesse e può rivelare le conseguenze fisiologiche di manipolazioni sperimentali delle vie di segnalazione.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Culture of Rat Lens Epithelial Explants for Studying Terminal Differentiation at JoVE.com

Preparation and Culture of Rat Lens Epithelial Explants for Studying Terminal Differentiation

Espianti della regione centrale della lente epiteli ratto differenziare in modo sincrono quando coltivate in presenza di FGF-2. Microscopia a immunofluorescenza della presenza di tali culture possono fornisce informazioni romanzo sulla espressione genica e di segnalazione eventi associati a differenziazione terminale.

La preparazione e la cultura di espianti Lens Rat epiteliali per lo Studio differenziazione terminale

The anterior surface of the ocular lens is covered by a monolayer of epithelial cells, which proliferate in an annular zone underlying the ciliary body.  ...

preparation-culture-rat-lens-epithelial-explants-for-studying

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

12.6K Views.  National Eye Institute (NEI), National Institutes of Health (NIH). Espianti della regione centrale della lente epiteli ratto differenziare in modo sincrono quando coltivate in presenza di FGF-2. Microscopia a immunofluorescenza della presenza di tali culture possono fornisce informazioni romanzo sulla espressione genica e di segnalazione eventi associati a differenziazione terminale.

Video: Preparation and Culture of Rat Lens Epithelial Explants for Studying Terminal Differentiation

Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, organotypic slice cultures allow one to perform a number of manipulations that are not presently feasible in-vivo. To date, organtotypic embryonic brain slice cultures have been used to follow individual cells using time-lapse microscopy, manipulate the expression of genes in the ganglionic emanances (a region that is hard to target by in-utero electroporation), as well as for pharmacological studies. In this video protocol we demonstrate how to make organotypic slice cultures from rat embryonic day 18 embryos. The protocol involves dissecting the embryos, embedding them on ice in low melt agarose, slicing the embedded brains on the vibratome, and finally plating the slices onto filters in culture dishes. This protocol is also applicable in its present form to making organotypic slice cultures from different embryonic ages for both rats and mice. 

Slice Cultura organotipica di E18 cervello dei topi

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, ...

Ricerca

Biologia

Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

Biolistic transfection is a physical means of transfecting cells by bombarding tissue with high velocity DNA coated particles. We provide a detailed protocol for biolistic transfection of rat hippocampal slices, from the initial preparation of DNA coated bullets to the final shooting of the organotypic slice cultures using a gene gun. Gene gun transfection is an efficient and easy means of transfecting neurons and is especially useful for fluorescently labeling a small subset of cells in tissue slice. In this video, we first outline the steps required to coat gold particles with DNA. We next demonstrate how to line the inside of plastic tubing with the gold/DNA bullets, and how to cut this tubing to obtain the plastic cartridges for loading into the gene gun. Finally, we perform biolistic transfection of rat hippocampal slice cultures, demonstrating handling of the Bio-Rad Helios gene gun, and offering trouble shooting advice to obtain healthy and optimally transfected tissue slices.  

We describe a method for preparing DNA coated gold bullets and demonstrate the use of such bullets to biolistically transfect neurons in cultured hippocampal slices.

Preparazione di proiettili pistola Gene e Biolistic Transfection dei neuroni in cultura Slice

Biolistic transfection is a physical means of transfecting cells by bombarding tissue with high velocity DNA coated particles. We provide a detailed ...

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the function and structure of human epithelial cells. Here we describe in detail the method of growing bronchial epithelial cells from bronchial airway tissue that is harvested by the surgeon at the times of lung surgery (e.g. lung cancer or lung volume reduction surgery). With ethics approval and informed consent, the surgeon takes what is needed for pathology and provides us with a bronchial portion that is remote from the diseased areas. The tissue is then used as a source of explants that can be used for growing primary bronchial epithelial cells in culture. Bronchial segments about 0.5-1cm long and &le;1cm in diameter are rinsed with cold EBSS and excess parenchymal tissue is removed. Segments are cut open and minced into 2-3mm3 pieces of tissue. The pieces are used as a source of primary cells. After coating 100mm culture plates for 1-2 hr with a combination of collagen (30 &mu;g/ml), fibronectin (10 &mu;g/ml), and BSA (10 &mu;g/ml), the plates are scratched in 4-5 areas and tissue pieces are placed in the scratched areas, then culture medium (DMEM/Ham F-12 with additives) suitable for epithelial cell growth is added and plates are placed in an incubator at 37&deg;C in 5% CO2 humidified air. The culture medium is changed every 3-4 days. The epithelial cells grow from the pieces forming about 1.5 cm diameter rings in 3-4 weeks. Explants can be re-used up to 6 times by moving them into new pre-coated plates. Cells are lifted using trypsin/EDTA, pooled, counted, and re-plated in T75 Cell Bind flasks to increase their numbers. T75 flasks seeded with 2-3 million cells grow to 80% confluence in 4 weeks. Expanded primary human epithelial cells can be cultured and allowed to differentiate on air-liquid interface. Methods described here provide an abundant source of human bronchial epithelial cells from freshly isolated tissues and allow for studying these cells as models of disease and for pharmacology and toxicology screening.

Here we describe a detailed method for growing primary human bronchial epithelial cells from explants of human bronchial airway tissue including differentiated growth on an air-liquid interface. This method provides an abundant source of primary cells for investigating the role of the airway epithelium in human lung health and disease.

Primario cellule epiteliali bronchiali umane Grown da espianti

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Preparation of Rat Tail Tendons for Biomechanical and Mechanobiological Studies

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working with those tissues is challenging because they are very fragile, and until now there was no rigorously detailed protocol for their isolation.
Faced with these challenges, we have developed methods and instruments to facilitate manipulation of RTTs and control tissue viability, sterility and integrity. This article describes the experimental procedures used to prepare RTTs for biomechanical and mechanobiological studies. Our work is divided into four main steps: extraction, cross-sectional area measurement, rinsing and loading into the bioreactor chamber.
At each step, all procedures, materials and manipulations are presented in detail so that they can be easily reproduced. Moreover, the specific instruments developed are presented: a manipulation plate used to segregate RTTs, an optic micrometer to position the tissue during the cross-sectional area measurement and an anchoring system to attach the RTTs onto a bioreactor.
Finally, we describe the results obtained after multiple tests to validate our methods. The viability, sterility and integrity evaluations demonstrate that our procedures are sufficiently rigorous for manipulations of fragile tissues such as rat tail tendons.

This article describes the experimental procedures used to prepare rat tail tendons for biomechanical and mechanobiological studies. Several features of the main steps in preparation are demonstrated, beginning with extraction, cross-sectional area measurement, rinsing and loading into the bioreactor chamber.

Preparazione dei tendini coda di topo per studi di biomeccanica e Mechanobiological

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

Un sistema per la coltura cellule epiteliali del pigmento Iris a studio Rigenerazione Lens Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

A Novel Method for the Culture and Polarized Stimulation of Human Intestinal Mucosa Explants

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper homeostasis directly depends on these interactions, as they shape an entire immunological response inducing tolerance against food antigens while at the same time mounting effective immune responses against pathogenic microbes accidentally ingested with food.
Intestinal homeostasis is preserved also through various complex interactions between the microbiota (including food-associated beneficial bacterial strains) and the host, that regulate the attachment/degradation of mucus, the production of antimicrobial peptides by the epithelial barrier, and the "education" of epithelial cells' that controls the tolerogenic or immunogenic phenotype of unique, gut-resident lymphoid cells' populations. These interactions have been so far very difficult to reproduce with in vitro assays using either cultured cell lines or peripheral blood mononuclear cells. In addition, mouse models differ substantially in components of the intestinal mucosa (mucus layer organization, commensal bacteria community) with respect to the human gut. Thus, studies of a variety of treatments to be brought in the clinics for important stress-related or pathological conditions such as irritable bowel syndrome, inflammatory bowel disease or colorectal cancer have been difficult to carry out.
To address these issues, we developed a novel system that enables us to stimulate explants of human intestinal mucosa that retain their in situ conditioning by the host microbiota and immune response, in a polarized fashion. Polarized apical stimulation is of great importance for the outcome of the elicited immune response. It has been repeatedly shown that the same stimuli can produce completely different responses when they bypass the apical face of the intestinal epithelium, stimulating epithelial cells basolaterally or coming into direct contact with lamina propria components, switching the phenotype from tolerogenic to immunogenic and causing unnecessary and excessive inflammation in the area.
We achieved polarized stimulation by gluing a cave cylinder which delimited the area of stimulation on the apical face of the mucosa as will be described in the protocol. We used this model to examine, among others, differential effects of three different Lactobacilli strains. We show that this model system is very powerful to assess the immunomodulatory properties of probiotics in healthy and disease conditions.

We introduce a novel method for the maintenance of human intestinal mucosa in culture and monitoring of the response to various types of stimuli over at least 24 hrs. With our method, the polarity of the tissue is maintained, allowing for a physiological stimulation via the apical route.

Un nuovo metodo per la Cultura e polarizzata stimolazione umani espianti mucosa intestinale

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper ...

Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.

Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.

Preparazione di Rat Siero Adatto per mammiferi tutta la cultura Embrione

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator and that it is possible to monitor and quantify single cells along several cell cycles. We describe the full protocol used to monitor and quantify a HeLa cell culture for 2.7 days. First, cell culture acquisition is performed with a lens-free video microscope, and then the data is analyzed following a four-step process: multi-wavelength holographic reconstruction, cell-tracking, cell segmentation and cell division detection algorithms. As a result, we show that it is possible to gather a dataset featuring more than 10,000 cell cycle tracks and more than 2 x 106 cell morphological measurements.

Lens-free video microscopy enables us to monitor cell cultures directly inside the incubator. Here we describe the full protocol used to acquire and analyze a 2.7 day long acquisition of cultured HeLa cells, leading to a dataset of 2.2 x 106 measurements of individual cell morphology and 10584 cell cycle tracks.

Lente-free Video microscopia per la dinamica e analisi quantitativa della coltura delle cellule aderenti

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or macrophage precursors. Excessive bone resorption is one the most significant cellular mechanisms leading to osteolytic diseases, including osteoporosis, periodontitis, and periprosthetic osteolysis. The main physiological function of osteoclasts is to absorb both the hydroxyapatite mineral component and the organic matrix of bone, generating the characteristic resorption appearance on the surface of bones. There are relatively few osteoclasts compared to other cells in the body, especially in adult bones. Recent studies have focused on how to obtain more mature osteoclasts in less time, which has always been a problem. Several improvements in the isolation and culture techniques have developed in laboratories in order to obtain more mature osteoclasts. Here, we introduce a method that isolates bone marrow in less time and with less effort compared to the traditional procedure, using a special and simple device. With the use of density gradient centrifugation, we obtain large amounts of fully differentiated osteoclasts from rat bone marrow, which are identified by classical methods.

Osteoclasts are tissue-specific macrophage polykaryons derived from the monocyte-macrophage lineage of hematopoietic stem cells. This protocol describes how to isolate bone marrow cells so that large quantities of osteoclasts are obtained while reducing the risk of accidents found in traditional methods.

Isolamento, purificazione e differenziazione dei precursori dell'osteoclast dal midollo osseo del ratto

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, epithelial progenitor cells can self-renew and generate differentiating progeny that exhibit cellular functions similar to those of their in vivo counterparts. Herein we describe a step-by-step protocol to isolate region-specific progenitors from human lung and generate 3D organoid cultures as an experimental and validation tool. We define proximal and distal regions of the lung with the goal of isolating region-specific progenitor cells. We utilized a combination of enzymatic and mechanical dissociation to isolate total cells from the lung and trachea. Specific progenitor cells were then fractionated from the proximal or distal origin cells using fluorescence associated cell sorting (FACS) based on cell type-specific surface markers, such as NGFR&#160;for sorting basal cells and HTII-280 for sorting alveolar type II cells. Isolated basal or alveolar type II progenitors were used to generate 3D organoid cultures. Both distal and proximal progenitors formed organoids with a colony forming efficiency of 9-13% in distal region and 7-10% in proximal region when plated 5000 cell/well on day 30. Distal organoids maintained HTII-280+ alveolar type II cells in culture whereas proximal organoids differentiated into ciliated and secretory cells by day 30. These 3D organoid cultures can be used as an experimental tool for studying the cell biology of lung epithelium and epithelial mesenchymal interactions, as well as for the development and validation of therapeutic strategies targeting epithelial dysfunction in a disease.

This article provides a detailed methodology for tissue dissociation and cellular fractionation approaches allowing enrichment of viable epithelial cells from proximal and distal regions of the human lung. Herein these approaches are applied for the functional analysis of lung epithelial progenitor cells through the use of 3D organoids culture models.

Isolamento e arricchimento di cellule progenitrici epiteliali polmonari umane per la coltura di organoidi

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...