Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health / National Institute of Mental Health (NIH / NIMH) concedere # 1R21MH085267.

Parte 1: Preparazione di un master per stampo multi-comparto dei neuroni co-coltura fabbricazione del dispositivo <ol><li> Primo passo per fabbricare il maestro PMMA è quello di rendere vani 3,5 mm di profondità. Uno scomparto soma e sei assone / glia comparti sono definiti su un blocco di PMMA con una micro-macchina di fresatura (MDX-40, Roland o qualsiasi altra fresa CNC). PMMA master è poi sonicato in alcool isopropilico per 10 minuti per rimuovere i detriti. </li><li> Array di 2,5 micron strutture cresta alta sono modellati su un 50,8 x 50,8 millimetri vetrino mm con un processo di fotolitografia standard, seguita da attacco a umido del vetro. In primo luogo, un array di strutture di crinale sono modellati su un substrato di vetro puliti con photoresist positivo S1818 con fotolitografia. S1818 è spin-rivestito sul substrato (4000 rpm), morbida base a 110 ° C per 5 minuti, e poi esposto alla luce UV (84 mJ / cm 2) utilizzando una maschera allineatore seguita attraverso lo sviluppo del photoresist in MF319 per 40 secondi. Successivamente, il vetro photoresist fantasia substrato viene immerso in ossido tamponata etch (BOE) a temperatura ambiente per 6-7 minuti per ottenere un 2,5 micron strutture crinale alto. Infine, lo strato di photoresist viene rimosso con l&#39;acetone e alcool isopropilico, seguito da un risciacquo in deionizzata (DI). </li><li> Substrato di vetro con micro-cresta strutture è impresso a caldo contro il capitano PMMA di trasferire i suoi modelli. In primo luogo, maestro stampo PMMA e substrati di vetro sono allineati manualmente e posta su un hot-press. Allora, la temperatura si alza a 115 ° C. Una volta che la temperatura desiderata viene raggiunta, 0,5 tonnellate di peso è applicato per 5 minuti. Dopo 5 minuti, la temperatura viene raffreddato a 40 ° C e la pressione viene rilasciata. Il master PMMA viene poi tagliato in a mm 50,8 x 50,8 blocco formato mm. </li><li> PDMS pre-polimero (Sylgard 184) viene miscelato con il catalizzatore nel rapporto di 10: 1 in peso. </li><li> PMMA master è inserito all&#39;interno di una botte e la miscela PDMS si versa sopra il maestro PMMA per fabbricare un maestro PDMS. E &#39;poi messo in un essiccatore collegato ad una pompa a vuoto. PDMS versato sulla parte superiore del PMMA master è poi degassificati per 15 minuti per rimuovere le bolle generate durante il processo di miscelazione PDMS. </li><li> Quando tutte le bolle vengono rimossi, PDMS viene messo all&#39;interno di un forno livellato 85 ° C per un&#39;ora per la polimerizzazione. </li><li> Una volta PDMS è completamente guarito, PDMS master è staccato dal master PMMA e collocato all&#39;interno di un essiccatore con 2-3 gocce di triclorosilano e pulita per 15 minuti a vapore rivestire la superficie PDMS master. Rivestimento triclorosilano facilita il rilascio della finale PDMS neurone co-coltura dispositivi dal master PDMS. Dopo il rivestimento, il maestro PDMS è brevemente sciacquato con alcool isopropilico per rimuovere triclorosilano eccessiva e asciugati con N 2 gas. </li></ol> Parte 2: la replica di cultura Neuron dispositivo <ol><li> PDMS pre-polimero (Sylgard 184) viene miscelato con il catalizzatore nel rapporto di 10: 1 in peso. </li><li> Miscela PDMS si versa sopra il maestro PDMS e degasato all&#39;interno di un essiccatore collegato ad una pompa a vuoto per 15 minuti. E &#39;importante non versare troppo PDMS in modo che la struttura di 3,5 mm di altezza PDMS sul master non è completamente immersa. </li><li> Quando tutte le bolle vengono rimossi, PDMS viene messo all&#39;interno di un forno livellato 85 ° C per un&#39;ora per la polimerizzazione. </li><li> PDMS è tolto dal forno dopo un&#39;ora e lasciato a temperatura ambiente per raffreddare. Poi, PDMS dispositivi cultura neurone sono leggermente staccata dal master PDMS. Staccata dispositivi PDMS sono avvolte con parafilm per proteggerli dalle polveri e detriti. </li><li> Dispositivi PDMS, avvolto con parafilm, vengono tagliati in pezzi singoli utilizzando un trapano a colonna dotato di una lama. </li></ol> Parte 3: montaggio del dispositivo <ol><li> PDMS dispositivo cultura neurone è collocato all&#39;interno del più pulito al plasma ed esposta a plasma ad aria per 90 secondi per rendere la superficie del dispositivo PDMS idrofilo. Questo trattamento al plasma faciliterà microcanali da riempire con terreni di coltura dopo il montaggio di poli-d-lisina substrato rivestito. </li><li> I dispositivi trattati con plasma vengono poi immersi in etanolo al 70% per 30 minuti per la sterilizzazione e si è trasferito all&#39;interno del sterilizzati bio-cappuccio. </li><li> Dispositivi sterilizzati sono considerate fuori dal 70% di etanolo e asciugati con Millipore filtrata N 2 gas. Dispositivi essiccati sono messi in cima alla poli-d-lisina polistirolo rivestito da 6 pozzetti cultura e una leggera pressione si applica per garantire la tenuta tra il substrato e il dispositivo. </li><li> Cultura dei media viene poi riempito nel vano soma, seguita da riempire sei assone / glia scomparti. E &#39;meglio dare 1-2 minuti di pausa prima di riempire assone / glia scomparti dopo l&#39;aggiunta di terreni di coltura per il comparto soma per garantire che non bolle sono intrappolati all&#39;interno della microcanali. </li><li> Dispositivi pieno di terreni di coltura viene incubata all&#39;interno di un incubatore a 37 ° C durante la notte per lavare i detriti possibile o residui tossici. </li></ol> Parte 4: Cella di carico degli oligodendrociti e neuroni-co-coltura <ol><li> Il primo giorno della coltura cellulare, le cellule neuronali primarie proencefalo fin dal primo giorno embrionale 16-18 ratti sono caricati nel vano soma ad una densità areale di 500 cellule / mm 2. In primo luogo, terreni di coltura, sia all&#39;interno del vano soma e assone / glia scomparti sono aspirati con pipetta prima del caricamento delle cellule. Poi, le cellule 38500, diluito in 40 ml di terreni di coltura, vengono caricati al vano soma in tutto il insenature microcanali. E &#39;importante non toccare il dispositivo durante il caricamento PDMS le cellule, in quanto può rompere il sigillo tra il dispositivo e il substrato. </li><li> Incubare i dispositivi cellulari caricato per 30 minuti all&#39;interno di un incubatore a 37 ° C per migliorare l&#39;adesione delle cellule al substrato. Dopo l&#39;incubazione, tutti i comparti sono riempite con terreni di coltura. </li><li> Le cellule sono coltivate a 37 ° C in un umidificata al 5% CO 2 incubatore e solo la metà dei terreni di coltura viene cambiato fuori ogni 3-4 giorni. </li><li> Dopo 14 giorni di coltura in vitro in neuroni, oligodendrociti sono aggiunti l&#39;assone / glia scomparti per co-coltura. Oligodendrociti, sezionato dagli emisferi cerebrali di ratti Sprague-Dawley al giorno postnatale 1-2, vengono aggiunti a ogni assone / glia vano ad una densità superficie di 1000 cellule / mm 2. Prima di celle di carico, circa il 60% dei terreni di coltura all&#39;interno dei comparti sono aspirati con pipetta. Attenzione deve essere fatta a non toccare il substrato di fondo, dal momento che può danneggiare la rete assonale formata sul substrato. Poi, 6700 cellule oligodendrociti, diluito in 5 l di terreni di coltura, vengono aggiunti l&#39;assone / glia scomparti. Le cellule vengono incubate per 1 ora e scomparti sono riempiti con terreni di coltura. </li><li> Le cellule sono coltivate a 37 ° C in un umidificata al 5% CO 2 incubatore e solo la metà dei terreni di coltura viene cambiato ogni 3-4 giorni fuori per altre due settimane. </li></ol> Parte 5: Risultati Rappresentante: Quando gli esperimenti siano state eseguite correttamente, le cellule neuronali caricati al vano soma localizzare vicino al insenature microcanali e strato assonale iniziare a formare dentro l&#39;assone / glia scomparti dopo 1 settimana della cultura. Segno di aggregazione delle cellule neuronali all&#39;interno del vano soma può essere un&#39;indicazione che le cellule non sono sani. Quando si carica oligodendrociti dopo due settimane di cultura neurone, assone / glia comparti dovrebbe essere coperto con uno strato denso di assoni e oligodendrociti devono essere caricati sulla parte superiore dello strato assonale. <img src="/files/ftp_upload/1399/1399fig1tmb.jpg" border="0" alt="figura 1" /> Figura 1. Illustrazioni schematica della high-throughput microfluidica multi-vano SNC neuroni co-coltura piattaforma. Vista in sezione trasversale che mostra l&#39;isolamento degli assoni neuronali da soma e dendriti e isolamento fluidico tra i compartimenti con minuti di differenza di livello fluidica. Si prega di <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/1399/1399fig1.jpg">cliccare qui</a> per vedere una versione più grande della figura 1. <img src="/files/ftp_upload/1399/1399fig2tmb.jpg" border="0" alt="figura 2" /> Figura 2. Fabbricazione e fasi di montaggio per il multi-comparto PDMS microfluidica co-coltura dispositivo. Ogni dispositivo si inserisce in un pozzetto di una convenzionale 6 pozzetti di coltura cellulare polistirolo. Si prega di <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/1399/1399fig2.jpg">cliccare qui</a> per vedere una versione più grande della figura 2.

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	<li>Sherman, D. L., Brophy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+axon+ensheathment+and+myelin+growth.">Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth.</a> Nature Reviews. 6, 683-690 (2005).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+Lithography.">Soft Lithography.</a> Angew. Chem. 37, 550-575 (1998).</li><li>Taylor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research.">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nature Methods. 2, 599-605 (2005).</li><li>Li, J., Baud, O., Vartanian, T., Volpe, J. J., Rosenberg, P. A., A, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxynitrite+generated+by+inducible+nitric+oxide+synthase+and+NADPH+oxidase+mediates+microglial+toxicity+to+oligodendrocytes.">Peroxynitrite generated by inducible nitric oxide synthase and NADPH oxidase mediates microglial toxicity to oligodendrocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 102, 9936-9941 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Abbiamo sviluppato un multi-vano co-coltura piattaforma per lo studio dei mammiferi SNC assone-glia di interazione. Assoni del SNC sono state isolate con successo da cellule neuronali enti / dendriti, e gli oligodendrociti sono stati co-coltura con successo all&#39;interno del dispositivo. La densità dei neuroni può essere variata da applicazioni, ma la concentrazione troppo bassa o troppo alta può indurre le cellule a morire. Inoltre, è importante cambiare solo la metà dei terreni di coltura in modo che le cellule o assonale strato sul substrato non siano danneggiati. Ci aspettiamo che questo sistema sarà un potente strumento per lo studio del SNC assone-glia di segnalazione delle reti in vitro e fornire un percorso verso una piattaforma high-throughput per lo screening dei fattori di crescita o farmaci candidati potenziali che promuovono la mielinizzazione e la riparazione della mielina.

a multi-compartment cns neuron-glia co-culture microfluidic platform

Vi presentiamo un nuovo multi-comparto dei neuroni co-coltura piattaforma microsistema per SNC in vitro assone-glia di ricerca interazione, capace di condurre fino a sei esperimenti indipendenti in parallelo per una maggiore throughput. Abbiamo sviluppato un nuovo metodo di fabbricazione per creare dispositivi microfluidici con strutture su scala sia micro che macro all&#39;interno del dispositivo stesso attraverso un unico soft-litografia processo, consentendo di fabbricazione di massa con buona ripetibilità. Il multi-vano microfluidica co-coltura piattaforma è composta da un vano soma di neuroni e sei assone / glia scomparti per oligodendrociti (OLS). Il vano soma e assone / glia vani sono collegati da un array di assone-guida microcanali che funzionano come barriere fisiche per limitare soma neuronale nel vano soma, consentendo assoni a crescere in assone / compartimenti glia. OL caricato in assone / glia scomparti in grado di interagire solo con assoni ma non con soma neuronale o dendriti, permettendo localizzato assone-glia studi di interazione. I microcanali ha inoltre permesso l&#39;isolamento fluidico tra i compartimenti, lasciando sei esperimenti indipendenti da condurre su un unico dispositivo per un throughput più elevato. Soft-litografia con poli (dimetilsiloxano) (PDMS) è una tecnica comunemente utilizzata in microdispositivi biomedica. Serbatoi su questi dispositivi sono comunemente definiti dal punzonatura manuale. Anche se semplice, allineamento poveri e della natura in termini di tempo del processo rende questo processo non adatto quando un gran numero di serbatoi devono essere ripetutamente creato. Il metodo di nuova concezione non ha richiesto punzonatura manuale dei serbatoi, per superare tali limitazioni. In primo luogo, sette serbatoi (profondità: 3,5 mm) sono state effettuate su un poli (metilmetacrilato) (PMMA) con blocco della macchina di micro-fresatura. Poi, gli array di microstrutture cresta, fabbricato su un substrato di vetro, sono state a caldo in rilievo contro il blocco PMMA per definire microcanali che collegano il soma e assone / glia scomparti. Questo processo ha portato macro-scala serbatoi (3,5 mm) e scala micro-canali (2,5 micron) in concomitanza con un singolo master PMMA. Una replica PDMS che è servito come un maestro dello stampo sono stati ottenuti utilizzando soft-litografia e il dispositivo finale PDMS è stato replicato da questo maestro. Neuroni primari da E16-18 ratti sono stati caricati al vano soma e coltivate per due settimane. Dopo una settimana di coltura cellulare, gli assoni attraversato microcanali e formato assonale unico strato di rete all&#39;interno degli assoni / glia scomparti. Gli assoni sono cresciuti in modo uniforme in tutto sei assone / glia scomparti e OLS da P1-2 i ratti sono stati aggiunti degli assoni / glia scompartimenti a 14 giorni in vitro per la co-coltura.

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A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

Abbiamo sviluppato un nuovo multi-comparto dei neuroni co-coltura piattaforma microsistema in vitro SNC assone-glia di ricerca interazione. La piattaforma è in grado di condurre fino a sei esperimenti indipendenti, in parallelo ed è stato fabbricato utilizzando una nuova concezione macro / micro metodo ibrido fabbricazione.

Un multi-vano SNC Neuron-glia Co-cultura Microfluidic piattaforma

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to ...

a-multi-compartment-cns-neuron-glia-co-culture-microfluidic-platform

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

11.9K Views.  Texas A&M University (TAMU). Abbiamo sviluppato un nuovo multi-comparto dei neuroni co-coltura piattaforma microsistema in vitro SNC assone-glia di ricerca interazione. La piattaforma è in grado di condurre fino a sei esperimenti indipendenti, in parallelo ed è stato fabbricato utilizzando una nuova concezione macro / micro metodo ibrido fabbricazione.

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Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Dissezione del sistema nervoso centrale larvali in Drosophila melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Ricerca

Biologia

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an enabling experimental tool, because it can precisely manipulate fluid flows, enable high-throughput experiments, and generate stable soluble concentration gradients.  Compared to conventional gradient generators, poly(dimethylsiloxane) (PDMS)-based  microfluidic devices can generate stable concentration gradients of growth factors with well-defined profiles.  Here, we developed simple gradient-generating microfluidic devices with three separate inlets.  Three microchannels combined into one microchannel to generate concentration gradients.  The stability and shape of growth factor gradients were confirmed by fluorescein isothyiocyanate (FITC)-dextran with a molecular weight similar to epidermal growth factor (EGF).  Using this microfluidic device, we demonstrated that fibroblasts exposed to concentration gradients of EGF migrated toward higher concentrations.  The directional orientation of cell migration and motility of migrating cells were quantitatively assessed by cell tracking analysis.  Thus, this gradient-generating microfluidic device might be useful for studying and analyzing the behavior of migrating cells.

We describe a protocol for the microfabrication of the gradient-generating microfluidic device that can generate spatial and temporal gradients in well-defined microenvironment. In this approach, the gradient-generating microfluidic device can be used to study directed cell migration, embryogenesis, wound healing, and cancer metastasis.

Un gradiente di generazione del dispositivo Microfluidic di Biologia Cellulare

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an ...

Cell Capture Using a Microfluidic Device

Cattura cellula Utilizzando un dispositivo a microfluidi

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Un neuronale e astrociti Co-Cultura Assay per l&#39;analisi dei contenuti elevati di neurotossicità

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

The Microfluidic Probe: Operation and Use for Localized Surface Processing

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. Microfluidics is commonly associated with closed microchannels which limit their use to samples that can be introduced, and cultured in the case of cells, within a confined volume. On the other hand, micropipetting system have been used to locally perfuse cells and surfaces, notably using push-pull setups where one pipette acts as source and the other one as sink, but the confinement of the flow is difficult in three dimensions. Furthermore, pipettes are fragile and difficult to position and hence are used in static configuration only. 
The microfluidic probe (MFP) circumvents the constraints imposed by the construction of closed microfluidic channels and instead of enclosing the sample into the microfluidic system, the microfluidic flow can be directly delivered onto the sample, and scanned across the sample, using the MFP. . The injection and aspiration openings are located within a few tens of micrometers of one another so that a microjet injected into the gap is confined by the hydrodynamic forces of the surrounding liquid and entirely aspirated back into the other opening. The microjet can be flushed across the substrate surface and provides a precise tool for localized deposition/delivery of reagents which can be used over large areas by scanning the probe across the surface. 
In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer.

In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer solution.

La sonda Microfluidic: funzionamento e utilizzo per l&#39;elaborazione delle superfici localizzate

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. ...

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions. Extracellular proteins, collagen I or von Willebrand factor are deposited within the microfluidic channel using active perfusion with a pneumatic pump. The matrix proteins are then washed with buffer and blocked to prepare the microfluidic channel for platelet interactions. Whole blood labeled with fluorescent dye is perfused through the channel at various flow rates in order to achieve platelet activation and aggregation. Inhibitors of platelet aggregation can be added prior to the flow cell experiment to generate IC50 dose response data.

The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions.

L&#39;adesione e aggregazione piastrinica in condizioni di flusso utilizzando celle di flusso Microfluidic

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has been proposed that the microenvironment that the pathogen encounters in the commensal layer is important in determining the extent of colonization. Current culture methods for investigating pathogen colonization are not well suited for investigating this hypothesis as they do not enable co-culture of bacteria and epithelial cells in a manner that mimics the GI tract microenvironment. Here we describe a microfluidic co-culture model that enables independent culture of eukaryotic cells and bacteria, and testing the effect of the commensal microenvironment on pathogen colonization. The co-culture model is demonstrated by developing a commensal Escherichia coli biofilm among HeLa cells, followed by introduction of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) into the commensal island, in a sequence that mimics the sequence of events in GI tract infection.

This protocol describes a microfluidic co-culture model for simultaneous and localized culture of epithelial cells and bacteria. This model can be used for investigating the role of different soluble molecular signals on pathogenesis as well as screen the effectiveness of putative probiotic bacterial strains.

Microfluidica Co-coltura di cellule epiteliali e batteri per le indagini solubile del segnale mediato da Interazioni

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the concentration of specific chemoeffectors by comparing the current concentration to the concentration detected a few seconds earlier. This comparison determines the net direction of movement. Although multiple, competing gradients often coexist in nature, conventional approaches for investigating bacterial chemotaxis are suboptimal for quantifying migration in response to concentration gradients of attractants and repellents. Here, we describe the development of a microfluidic chemotaxis model for presenting precise and stable concentration gradients of chemoeffectors to bacteria and quantitatively investigating their response to the applied gradient. The device is versatile in that concentration gradients of any desired absolute concentration and gradient strength can be easily generated by diffusive mixing. The device is demonstrated using the response of Escherichia coli RP437 to gradients of amino acids and nickel ions.

This protocol describes the development of a microfluidic device for investigating bacterial chemotaxis in stable concentration gradients of chemoeffectors.

Un dispositivo a microfluidi per quantificare chemiotassi batterica in gradienti di concentrazione stabile

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

Modified ES / OP9 Co-Culture Protocol Provides Enhanced Characterization of Hematopoietic Progeny

The in vitro differentiation of ES cells towards a hematopoietic cell fate is useful when studying cell populations that are difficult to access in vivo and for characterizing the earliest genes involved in hematopoiesis, without having to deal with embryonic lethalities. The ES/OP9 co-culture system was originally designed to produce hematopoietic progeny, without the over production of macrophages, as the OP9 stromal cell line is derived from the calvaria of osteopetrosis mutant mice that lack functional M-CSF. The in vitro ES/OP9 co-culture system can be used in order to recapitulate early hematopoietic development. When cultured on OP9 stromal cells, ES cells differentiate into Flk-1+ hemangioblasts, hematopoietic progenitors, and finally mature, terminally differentiated lineages. The standard ES/OP9 co-culture protocol entails the placement of ES cells onto a confluent layer of OP9 cells; as well as, periodic replating steps in order to remove old, contaminating OP9 cells. Furthermore, current protocols involve evaluating only the hematopoietic cells found in suspension and are not optimized for evaluation of ES-derived progeny at each day of differentiation. However, with replating steps and the harvesting of only suspension cells one potentially misses a large portion of ES-derived progeny and developing hematopoietic cells. This issue becomes important to address when trying to characterize hematopoietic defects associated with knockout ES lines. Here we describe a modified ES/mStrawberry OP9 co-culture, which allows for the elimination of contaminating OP9 cells from downstream assays. This method allows for the complete evaluation of all ES-derived progeny at all days of co-culture, resulting in a hematopoietic differentiation pattern, which more directly corresponds to the hematopoietic differentiation pattern observed within the embryo.

mStrawberry OP9 cells allow for complete evaluation of all ES-derived progeny from co-culture.

Modificato ES / OP9 Co-Cultura Protocollo prevede Caratterizzazione avanzata di Progeny emopoietiche

The in vitro differentiation of ES cells towards a hematopoietic cell fate is useful when studying cell populations that are difficult to access in vivo ...

Endothelial Cell Co-culture Mediates Maturation of Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Insulin Producing Cells in a Directed Differentiation Approach

Embryonic stem cells (ESC) have two main characteristics: they can be indefinitely propagated in vitro in an undifferentiated state and they are pluripotent, thus having the potential to differentiate into multiple lineages. Such properties make ESCs extremely attractive for cell based therapy and regenerative treatment applications 1. However for its full potential to be realized the cells have to be differentiated into mature and functional phenotypes, which is a daunting task. A promising approach in inducing cellular differentiation is to closely mimic the path of organogenesis in the in vitro setting. Pancreatic development is known to occur in specific stages 2, starting with endoderm, which can develop into several organs, including liver and pancreas. Endoderm induction can be achieved by modulation of the nodal pathway through addition of Activin A 3 in combination with several growth factors 4-7. Definitive endoderm cells then undergo pancreatic commitment by inhibition of sonic hedgehog inhibition, which can be achieved in vitro by addition of cyclopamine 8. Pancreatic maturation is mediated by several parallel events including inhibition of notch signaling; aggregation of pancreatic progenitors into 3-dimentional clusters; induction of vascularization; to name a few. By far the most successful in vitro maturation of ESC derived pancreatic progenitor cells have been achieved through inhibition of notch signaling by DAPT supplementation 9. Although successful, this results in low yield of the mature phenotype with reduced functionality. A less studied area is the effect of endothelial cell signaling in pancreatic maturation, which is increasingly being appreciated as an important contributing factor in in-vivo pancreatic islet maturation 10,11.
The current study explores such effect of endothelial cell signaling in maturation of human ESC derived pancreatic progenitor cells into insulin producing islet-like cells. We report a multi-stage directed differentiation protocol where the human ESCs are first induced towards endoderm by Activin A along with inhibition of PI3K pathway. Pancreatic specification of endoderm cells is achieved by inhibition of sonic hedgehog signaling by Cyclopamine along with retinoid induction by addition of Retinoic Acid. The final stage of maturation is induced by endothelial cell signaling achieved by a co-culture configuration. While several endothelial cells have been tested in the co-culture, herein we present our data with rat heart microvascular endothelial Cells (RHMVEC), primarily for the ease of analysis.

The current study describes a directed differentiation approach in inducing pancreatic differentiation of human embryonic stem cells. Of great significance is the finding that endothelial cell co-culture mediates maturation of human embryonic stem cell derived pancreatic progenitors into insulin expressing cells.

Delle cellule endoteliali Co-cultura Maturazione media di Cellule Staminali embrionali umane a cellule pancreas che producono insulina in un approccio di differenziazione Regia

Un multi-vano SNC Neuron-glia Co-cultura Microfluidic piattaforma

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