Questo lavoro è stato sostenuto dal US Department of Defense (BC075554 di BG e BC061403 a DK), US National Institutes of Health (U54GM064346 a JVR; CA100324 di JC, JES e JW; CA77522 di JES, U54CA126511 di JC e BG). Ringraziamo D. Entenberg aiuto per microscopia, M. Rottenkolber aiuto nella fabbricazione della scatola di imaging e J. Pollard (Albert Einstein College of Medicine) per l&#39;anticorpo F4/80.

1. Generazione di tumori fluorescenti con iniezione di cellule tumorali nel tappetino mammaria grasso: <ol><li> Crescere una linea cellulare che esprime Dendra2 proteine ​​(come marcatore citoplasmatica) al 40 - 80% confluenza. </li><li> Lavare i piatti almeno 3 volte con PBS w / o Ca 2 + o Mg 2 +. </li><li> Aggiungere 3 ml di tripsina per 10 piatti cm e incubare a 37 ° C fino a quando la maggior parte delle cellule staccare e poi ha colpito il piatto contro una superficie piana per scuoterlo. </li><li> Risciacquare tutte le cellule fuori il piatto, e utilizzare un raschietto (poliziotto in gomma) per raccogliere matrice come bene. Aggiungere il 5 ml di PBS. Prelevare un &#39;aliquota di contare durante la centrifugazione. </li><li> Centrifugare a 800 g per 5 min. </li><li> Aspirare e risospendere in PBS alla concentrazione di 5 - 10x 10 6 / ml. Negozio su ghiaccio fino iniettata (iniezione entro 30 min). </li><li> Inserire una gabbia contenente 4-5 settimana di vita femminile topi immunodeficienti (SCID ad esempio) all&#39;interno di una cappa sterile. </li><li> Spruzzare l&#39;area intorno al 4 ° (addominale) capezzolo con etanolo al 70%. </li><li> Iniettare 0,1 ml nel cuscinetto adiposo della mammella. Se un assistente può essere trovato, una persona può tenere il mouse in posizione mentre gli inserti di altri l&#39;ago all&#39;interno del cuscinetto di grasso mammario. Se si inietta da soli, mettere il mouse sotto anestesia con isoflurano luce. </li><li> Una volta che il tumore è cresciuto fino a 5-7 mm, la finestra Imaging mammaria (MIW) deve essere inserito. Nota: in alternativa, per alcune applicazioni, la MIW può essere inserito in cima alla sana pad mammaria grasso e le cellule possono essere iniettati in seguito. Questo approccio consente di imaging di cellule trasfettate transitoriamente in un ambiente fisiologico. </li></ol> 2. Fabbricazione manuale della finestra Imaging mammaria (MIW): <ol><li> MIWs (Figura 1A) sono fatti di plastica tessuto grado di garantire la biocompatibilità. Per la costruzione manuale, usiamo 5 o 10 piatti cm. </li><li> Mettere i guanti in lattice su. </li><li> Riscaldare un tessuto-cultura piatto e creat una superficie curva premendo un arrotondati, oggetto duro contro il piatto riscaldato (usiamo un 1-pollice bit dremmel per questo). </li><li> Tagliare il centro del piatto con una lama di rasoio riscaldato. </li><li> Utilizzare un piccolo, a forma di cono po dremmel per fare un buco nel centro della cupola a forma di base plastica (6-7mm di diametro). </li><li> Rendere i bordi della base in plastica completamente liscia da carteggiatura con il dremmel e ulteriormente archiviazione. </li><li> File in cima alla base in plastica facendo una superficie piana per il vetro coprioggetti. Il diametro della depositato superficie piana e deve essere 9-10mm. </li><li> Incollare la circolare 8 millimetri di vetro coprioggetto (numero 1) sulla superficie appiattita con il colla (cianoacrilato). </li><li> Attendere che la colla si asciughi (15 minuti). </li><li> Utilizzare un ago riscaldato 26G per fare otto fori sutura pungere da fuori (dove il vetro è) all&#39;interno della base. Fori devono essere distribuite uniformemente in tutto il coprioggetti, 0,5-1mm di distanza dal bordo del vetrino. </li><li> Allargare i fori con un 5-0 ago sutura. </li><li> Pungere fori nella base di plastica farà la superficie interna irregolare. Con carta vetrata, fanno di questa superficie completamente liscia. </li><li> Cambiare i guanti e pennello di piccole particelle di plastica dal MIW con un pennello di piccole dimensioni. </li><li> Lavare la MIW con acqua deionizzata. </li><li> Lavare la MIW utilizzando etanolo al 70%. Utilizzare un Q-tip per pulire il vetro quindi è completamente trasparente. Se ci sono macchie di nebbia presenti dal vapore colla, con attenzione l&#39;uso di acetone con un Q-tip. </li><li> Sterilizzare il MIW dall&#39;esposizione ai raggi UV per 3 ore a ogni lato. </li></ol> Semi-manuale di fabbricazione della finestra Imaging mammaria (MIW): Al fine di fabbricare la base in plastica, stiamo attualmente utilizzando stampi in gomma siliconica creati utilizzando hand-made MIWs. Lo stampo è composto da due parti di gomma di silicone che lo rendono una replica esatta della parte anteriore e posteriore della originale quando è riempita di resina poliestere e poi subito uniti. La resina poliestere liquido è mescolato 9:10 e si traduce in una struttura difficile quando è completamente guarito in 48h. La plastica è protetto UV e l&#39;archiviazione senza rottura verso il basso o di diventare giallo nel corso del tempo. Dopo che la base è curato, a pochi passi 2,8-2,16 sono fatti allo stesso modo per MIWs manualmente-made. 3. Inserimento del MIW: <ol><li> L&#39;area intorno al capezzolo 4 ° dovrebbe avere un piccolo (diametro 5-7 mm) del tumore diversi giorni / settimane dopo l&#39;iniezione di cellule tumorali a seconda del tipo di cellula (Figura 1B). Quanto tempo è passato dopo l&#39;iniezione di cellule che esprimono proteine ​​Dendra2 photoswitchable o altre proteine ​​fluorescenti dipende dalla linea cellulare utilizzato. Il tumore non deve essere visibilmente necrotico, e dovrebbe avere una pelle intatta con i capelli sulla parte superiore del tumore. I topi con tumori necrotico dovrebbe essere eutanasia. </li><li> Preparare lo spazio sterile per la chirurgia stabilire un pezzo di panno sterile all&#39;interno di una cappa sterile. Mettete un pezzo di sterile gauze nel mezzo, e c&#39;era una MIWs pochi e strumenti sterili attorno ad esso: usiamo piccole forbici standard, primavera forbici, pinzette microdissecting, pinze microdissecting, porta aghi. Mantenere sterile Q-tips, una bottiglia di etanolo al 70% e guanti sterili in un angolo della cappa. </li><li> Il mouse è anestetizzata nella cappa sterile utilizzando l&#39;iniezione IP del 2,5% Avertin (20 l / g) in HBSS o, in alternativa 10 mcg / kg di ketamina + 10 mcg / g xylazina (contattare l&#39;Istituto cura degli animali per le approvazioni e dell&#39;ordine). Nota: la soluzione deve essere preparata Avertin bi-settimanale, filtro sterilizzato usando un filtro di 0,22 micron e memorizzati fino a 500 aliquote microlitri a 4 ° C (al buio). </li><li> Eliminare i peli con la rasatura nella zona sopra il tumore con un rasoio piccolo animale. </li><li> Rimuovere il resto dei capelli con crema di rimozione dei capelli Nair (disponibile in farmacia). Pulire la pelle con etanolo immerso Q-tips. </li><li> Trasferire l&#39;animale sulla garza sterile e applicare una pomata oftalmica agli occhi per evitare che l&#39;essiccazione e infezioni. </li><li> Sterilizzare la pelle con Betadine e pulite, con etanolo al 70%. </li><li> Trasferire l&#39;animale su un panno sterile chirurgica all&#39;interno della cappa sterile. </li><li> Tirare la pelle immediatamente mediale al capezzolo con pinze e tagliare ~ incisione 2 millimetri nella pelle. </li><li> Separare il sottostante pad mammaria grasso della pelle con le forbici e pinze dissezione. La pelle e tratto foro durante questa fase di separazione a una dimensione che ospiterà l&#39;inserimento del MIW. </li><li> Se accidentalmente un vaso viene colpito durante sugery, utilizzare una sterile Q-tips per rimuovere il sangue che viene prodotto / per fermare l&#39;emorragia di diventare troppo oneroso. </li><li> Inserire il MIW tale che ci sia la pelle sulla parte superiore della base MIW e sutura in posizione con filo non riassorbibile e invertire il taglio ago. </li><li> Uso del tessuto adesivo o cianoacrilato per riempire i buchi sutura e fissare il MIW alla pelle. </li><li> Aggiungi TMP-SMX mix di antibiotici: (Sulfametossazolo 0,6 mg / ml, trimetoprim 0,12 mg / ml) nella gabbia bottiglia d&#39;acqua per 3 giorni prima e dopo l&#39;intervento. </li><li> L&#39;animale rimane sotto anestesia per 1-4h dopo l&#39;iniezione IP Avertin. Dal momento che l&#39;intervento richiede normalmente ~ 45 minuti, è importante per aiutare l&#39;animale recuperare in seguito: </li><li> Posizionare una piastra elettrica a mano (37 ° C) (disponibile nelle farmacie) sul fondo della gabbia e coprire con garza. </li><li> Tenere l&#39;animale in cima al pad fino a quando non si accende il suo stomaco e inizia a camminare. </li><li> Se l&#39;animale è incosciente per più di 3 ore, iniettare 0,3 ml di HBSS intraperitoneale per la reidratazione. </li><li> L&#39;animale è consentito di recuperare nei giorni prossimi 3-4 prima della sessione di imaging ha luogo la prima. </li></ol> 4. Imaging Box Costruzione La casella di imaging assicura che il MIW è seduto piatto, proprio sopra l&#39;obiettivo microscopio. Esso facilita anche la temperatura e il controllo costante del flusso d&#39;aria attraverso l&#39;anestesia di isoflurano. La scatola è realizzata in plexiglass e incollati tra loro con saldatura di plastica. E &#39;dotato per il palcoscenico microscopio specifico e quindi la forma del suo fondo varia a seconda del microscopio utilizzato (Figura 2 mostra lo schema della scatola fitted di mettere in scena Leica microscopio SP5). Dimensioni della scatola in centimetri sono L = 11,4 cm, w = 7,6 cm, h = 4,4 cm (Figura 2A). La parte inferiore della finestra consiste in una piastra vuota, 12.7x8.4 cm, che si inserisce all&#39;interno della fase di microscopio Leica SP5, scorrevoli e due &quot;porte&quot;, 5,7 X 5,7 cm_each, che formano una apertura circolare (d = 2,22 centimetri ) quando è chiuso. Il MIW si inserisce in questa apertura. Il frontale contiene il foro d&#39;ingresso per l&#39;anestesia, mentre uno dei pezzi lato contiene un foro di uscita che porta al vuoto. Si noti che il condensatore e il supporto diapositive devono essere rimossi prima del posizionamento casella di imaging. 5. Box Imaging Usa <ol><li> Posto l&#39;animale in anestesia con isoflurano e applicare una pomata oftalmica per gli occhi. </li><li> Collegare lo scarico isoflurano dalla macchina per anestesia al fronte casella di imaging, sulla parte esterna del foro di ingresso (Figura 2B). </li><li> Collegare un secondo tubo al foro di uscita della scatola di imaging. Questo tubo deve essere collegato al filtro del gas e poi il vuoto. </li><li> Aprire il coperchio della scatola e aprire le porte box e posto l&#39;animale, MIW lato rivolto verso il basso, e facendo scorrere le porte nella casella. </li><li> Tenere la scatola e regolare le porte in basso in modo che la base MIW è detenuto e immobilizzato tra di loro. La base MIW dovrebbe essere allo stesso livello come le porte casella di imaging, mentre il coprioggetto MIW dovrebbe essere solo pochi millimetri sotto di questo livello. Assicurarsi che il posizionamento del MIW tra la parte inferiore porte scorrevoli assicura che il coprioggetto (porzione di vetro della MIW) in posizione orizzontale, parallelo alle porte fondo della scatola. Questo farà sì messa a fuoco corretta. </li><li> Abbassare l&#39;obiettivo microscopio, per consentire lo spazio per il posizionamento del box aparte superiore del palco microscopio. </li><li> Porre il recipiente sul palco microscopio, e regolare la fase in modo che il coprioggetto MIW è sopra l&#39;obiettivo. </li><li> Mettere a fuoco l&#39;obiettivo e iniziare imaging. </li><li> Durante l&#39;utilizzo di isoflurano, l&#39;animale deve essere controllata mediante ispezione visiva della frequenza respiratoria. Questo può essere fatto visivamente, o attraverso il monitoraggio della frequenza del respiro artefatti che appaiono durante la raccolta di immagini (che possono interferire con l&#39;acquisizione dati). L&#39;ossimetria MouseOx impulso di sistema (Starr vita Sciences Corp) è stato utilizzato con successo. In questo modo i dati possono essere raccolti continuamente senza accendere le luci nella stanza per controllare l&#39;animale. Nota: Dopo ogni sessione di imaging, il recupero degli animali dovrebbe essere agevolata avvolgendo una piccola piastra elettrica a mano in garza o Kimwipes e metterlo sotto l&#39;animale in gabbia. Nota: Se un obiettivo ad immersione viene utilizzata per l&#39;immagine attraverso la MIW, il mezzo di immersione (glicerolo, acqua, olio) dovrebbe essere rimosso dalla finestra di imaging. Il MIW deve essere ispezionato per eventuali crepe o altri danni che potrebbero essersi verificati durante l&#39;imaging. Questo è fondamentale per la raccolta di dati durante le sessioni di immagini multiple. </li></ol> 6. Photoswitching e l&#39;imaging di Dendra2 marcato le cellule La procedura è descritta per il microscopio confocale Leica SP5, la potenza del laser sul piano focale, gli obiettivi e le opzioni software disponibili variano se si utilizzano altri microscopi confocale o immagini multiphoton impostare, e quindi il protocollo descritto di seguito deve essere utilizzato come una guida per ottimizzare l&#39;esperimento sul microscopio. <ol><li> Osservando il tumore attraverso l&#39;oculare (10x) con il filtro fluorescenza verde, individuare i vasi sanguigni principali che sono visibilmente fluide e ben distesa sullo stesso piano focale. </li><li> Posizione di una delle navi nel centro del campo e passare alla rilevazione PMT. </li><li> Impostare insieme sequenziale di imaging per due canali. Uno dei canali utilizza 488nm linea laser (10% di potenza), e raccoglie scattering da matrice extracellulare (480-495nm) e le emissioni dalla forma verde di Dendra2 (505-540nm). Il secondo canale utilizza la linea di laser a 543nm (90% di potenza) e raccoglie le emissioni dalla forma rossa di Dendra2 (555-600nm). Raccogliere immagini 3D pre-photoswitching. </li><li> Utilizzare l&#39;opzione ROI scansione photoswitch una popolazione di cellule scelto utilizzando la linea laser di 405nm (30% di potenza, scansioni 20-40). Raccogliere emissione della forma rossa della proteina di monitorare la commutazione. </li><li> Utilizzando la stessa routine sequenziale come in 6.3, raccolta post-switching immagini 3D. </li><li> Se photoswitching più di una regione nel tumore, si consiglia di scattare foto attraverso la oculari utilizzando una fotocamera digitale, in entrambi i canali verde e rosso (Figura 3A, B). Questo aiuterà l&#39;orientamento durante le sessioni di imaging successive. Nota: Inoltre, i vasi sanguigni può essere temporaneamente etichettato con coda vena iniezione di destrano fluorescente (Cascade blu o Alexa Fluor 647, entrambi 10kDa). Poche ore dopo l&#39;iniezione, destrani lascerà i vasi sanguigni e in modo permanente l&#39;etichetta macrofagi. </li></ol> Rappresentante dei risultati: Figura 3C mostra una regione rettangolare photoswitched (rosso) orientata ortogonalmente rispetto al vaso sanguigno (non fluorescenza). Non photoswitched cellule sono verdi, mentre la dispersione della matrice extracellulare è viola. L&#39;immagine è una proiezione intensità massimo di quattro immagini lungo l&#39;asse Z (20-50 micron di profondità).

<ol>
	<li>Farina, K. L., Wyckoff, J. B., Rivera, J., Lee, H., Segall, J. E., Condeelis, J. S., Jones, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+motility+of+tumor+cells+visualized+in+living+intact+primary+tumors+using+green+fluorescent+protein.">Cell motility of tumor cells visualized in living intact primary tumors using green fluorescent protein.</a> Cancer Res. 58, 2528-2532 (1998).</li><li>Naumov, G. N., Wilson, S. M., MacDonald, I., Schmidt, E. E., Morris, V. L., Groom, A. C., Hoffman, R. M., Chambers, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+expression+of+green+fluorescent+protein,+coupled+with+high-resolution+in+vivo+videomicroscopy,+to+monitor+steps+in+tumor+metastasis.">Cellular expression of green fluorescent protein, coupled with high-resolution in vivo videomicroscopy, to monitor steps in tumor metastasis.</a> J Cell Sci. 112, 1835-1842 (1999).</li><li>Brown, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+measurement+of+gene+expression,+angiogenesis+and+physiological+function+in+tumors+using+multiphoton+laser+scanning+microscopy.">In vivo measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy.</a> Nature Med. 7, 864-868 (2001).</li><li>Wang, W., Wyckoff, J. B., Frohlich, V. C., Oleynikov, Y., Huttelmaier, S., Zavadil, J., Cermak, L., Bottinger, E. P., Singer, R. H., White, J. G., Segall, J. E., Condeelis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+behavior+in+metastatic+primary+mammary+tumors+correlated+with+gene+expression+patterns+revealed+by+molecular+profiling.">Single cell behavior in metastatic primary mammary tumors correlated with gene expression patterns revealed by molecular profiling.</a> Cancer Res. 62, 6278-6288 (2002).</li><li>Sidani, M., Wyckoff, J., Xue, C., Segall, J. 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D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+T+cell+trafficking+examined+in+vivo+with+intravital+two-photon+microscopy.">Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 2604-2609 (2003).</li><li>Kedrin, D., Gligorijevic, B., Wyckoff, J., Verkhusha, V. V., Condeelis, J., Segall, J. E., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+metastatic+behavior+through+a+mammary+imaging+window.">Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window.</a> Nat. Methods. 5, 1019-1021 (2008).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. 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		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>PBS w/o Ca, Mg</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>14190-144</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>25300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HBSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>14025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM media (MDA-MB-231 cells)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>11965</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane(Aerrane)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter</td>
<td># NDC 10019-773-40</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SCID mouse</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NCI</td>
<td>N/A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Culture dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>353003</td>
<td>Custom Order</td>
</tr>
<tr>
<td>Circular coverslip 8 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Scientific, Inc.</td>
<td>8CIR-1-FIS</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

dendra2 photoswitching through the mammary imaging window

Nell&#39;ultimo decennio, la microscopia intravitale dei tumori al seno in topi e ratti a singola cella di risoluzione<sup&gt; 1-4</sup&gt; Ha portato a importanti conoscenze sui meccanismi di comportamento metastatico come la migrazione, invasione e intravasation delle cellule tumorali<sup&gt; 5, 6</sup&gt;, L&#39;angiogenesi<sup&gt; 3</sup&gt; E la risposta immunitaria delle cellule<sup&gt; 7-9</sup&gt;. Abbiamo recentemente segnalato una tecnica di immagine ortotopico carcinomi mammari su più sessioni di imaging intravitale in topi vivi<sup&gt; 10</sup&gt;. Per questo, abbiamo sviluppato una finestra mammaria Imaging (MIW) e parametri di imaging ottimizzato per Dendra2<sup&gt; 11</sup&gt; Photoswitching e imaging<em&gt; In vivo</em&gt;. Qui, descriviamo il protocollo per la produzione di MIW, inserimento del MIW sulla cima di un tumore e imaging del Dendra2 marcato le cellule tumorali mediante una casella personalizzata di imaging costruito. Questo protocollo può essere usato per l&#39;immagine del comportamento metastatico delle cellule tumorali in microambienti distinti in tumori e permette l&#39;imaging a lungo termine dei vasi sanguigni, le cellule tumorali e cellule ospiti.

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Dendra2 Photoswitching through the Mammary Imaging Window

Photoswitching intravitale e tracking di Dendra2 marcato le cellule tumorali attraverso la finestra Imaging mammaria è una tecnica che ci permette di immagine il comportamento metastatico delle cellule tumorali in microambienti tumorali scelto su una scala temporale di giorni.

Dendra2 Photoswitching attraverso la finestra Imaging mammaria

In the last decade, intravital microscopy of breast tumors in mice and rats at single-cell resolution1-4  has resulted in important insights into ...

dendra2-photoswitching-through-the-mammary-imaging-window

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

11.6K Views.  Albert Einstein College of Medicine - Yeshiva University. Photoswitching intravitale e tracking di Dendra2 marcato le cellule tumorali attraverso la finestra Imaging mammaria è una tecnica che ci permette di immagine il comportamento metastatico delle cellule tumorali in microambienti tumorali scelto su una scala temporale di giorni.

Video: Dendra2 Photoswitching through the Mammary Imaging Window

A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window

The ability to image the cerebral vasculature (from large vessels to capillaries) and record blood flow dynamics in the intact brain of living rodents is a powerful technique. Using in vivo 2-photon microscopy through a cranial window it is possible to image fluorescent dyes injected intravenously. This permits one to image the cortical vasculature and also to obtain measurements of blood flow. This technique was originally developed by David Kleinfeld and Winfried Denk. The method can be used to study blood flow dynamics during or after cerebral ischemia, in neurodegenerative disorders, in brain tumors, or in normal brain physiology. For example, it has been used to study how stroke causes shifts in blood flow direction and changes in red blood cell velocity or flux in and around the infarct. Here we demonstrate how to use 2-photon microscopy to image blood flow dynamics in the neocortex of living mice using fluorescent dyes injected into the tail vein.

Cortical blood flow dynamics can be studied in vivo by imaging fluorescent dextran dyes injected into the tail vein of rodents with 2-photon microscopy. This video shows how to image blood flow dynamics in neocortex of mice through a glass-covered cranial window preparation.

Un metodo per 2-Photon Imaging del flusso sanguigno nella neocorteccia attraverso una finestra del cranio

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Biologia

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

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I componenti principali del microscopio ottico

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In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system is valuable for the pre-clinical in vivo evaluation of putative antitumor compounds.
The 4T1 cell line has been engineered to constitutively express the firefly luciferase gene (luc2). When mice carrying 4T1-luc2 tumors are injected with Luciferin the tumors emit a visual light signal that can be monitored using a sensitive optical imaging system like the IVIS Spectrum. The photon flux from the tumor is proportional to the number of light emitting cells and the signal can be measured to monitor tumor growth and development. IVIS is calibrated to enable absolute quantitation of the bioluminescent signal and longitudinal studies can be performed over many months and over several orders of signal magnitude without compromising the quantitative result.
Tumor growth can be monitored for several days by bioluminescence before the tumor size becomes palpable or measurable by traditional physical means. This rapid monitoring can provide insight into early events in tumor development or lead to shorter experimental procedures.
Tumor cell death and necrosis due to hypoxia or drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This cell death might not be accompanied by a reduction in tumor size as measured by physical means. The ability to see early events in tumor necrosis has significant impact on the selection and development of therapeutic agents.
Quantitative imaging of tumor growth using IVIS provides precise quantitation and accelerates the experimental process to generate results.

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

Mammary tumor cells expressing luciferase are implanted subcutaneously in mice and visualized using optical imaging to monitor tumor growth and development non-invasively in a longitudinal study.

In vivo Bioluminescent Imaging dei tumori mammari che usano lo spettro IVIS

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

Topo cellule epiteliali mammarie forma Mammospheres durante la differenziazione lattogenica

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

Mammary Epithelial Transplant Procedure

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, followed by the mammary epithelial transplant procedure. The mammary transplant procedure is widely used by mammary biologists because it takes advantage of the fact that significant development of the mammary epithelium doesn't occur until after puberty. At 3 weeks of age, growth of the mammary epithelial tree is confined to the vicinity of the nipple and the fat pad is largely devoid of mammary epithelium, but by 7 weeks of age the epithelial ductal tree extends throughout the entire fat pad. Therefore, if this small portion of the fat pad containing epithelium, the region between the nipple and the lymph node, is removed at 3 weeks of age, the endogenous epithelium will never populate the mammary fat pad and the fat pad is described as "cleared". At this time, mammary epithelium from another source can be transplanted in the cleared fat pad where it has the potential to extend mammary ductal trees through out the fat pad. This procedure has been utilized in many experimental models including the examination of tumor phenotype in transgenic mammary epithelial tissue without the confounding effects of genotype on the entire animal3, in the identification of mammary stem cells by transplanting cells in limited dilution4,5, determining if hyperplastic nodules proceed to mammary tumors6, and to assess the effect of prior hormone exposure on the behavior of the mammary epithelium7,8.
Three week old host mice are anesthetized, cleaned and restrained on a surgical stage. A mid-sagittal incision is made through the skin, but not the peritoneum, extending from the pubis to the sternum. Oblique cuts are made through the skin from the mid-sagittal incision across the pelvis toward each leg. The skin is pulled away from the peritoneum to expose the 4th inguinal mammary gland. The fat pad is cleared by removing the fat pad tissue anterior to the lymph node. Epithelium fragments or epithelial cells are transplanted into the remaining cleared fat pad and the mouse is closed.

This article demonstrates the procedure developed by DeOme KB et al. (1959) and the sparing procedure developed by Brill B et al. (2008) for clearing the 4th inguinal mammary fat pad of a pubescent mouse in preparation for transplantation of mammary fragments, mammary epithelial cells, or mammary tumor cells.

Procedura di trapianto epiteliali mammarie

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, ...

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich vascularization and high density of mitochondria. BAT plays a major role in energy expenditure and non-shivering thermogenesis in newborn mammals as well as the adults 1. BAT-mediated thermogenesis is highly regulated by the sympathetic nervous system, predominantly via &beta; adrenergic receptor 2, 3. Recent studies have shown that BAT activities in human adults are negatively correlated with body mass index (BMI) and other diabetic parameters 4-6. BAT has thus been proposed as a potential target for anti-obesity/anti-diabetes therapy focusing on modulation of energy balance 6-8. While several cold challenge-based positron emission tomography (PET) methods are established for detecting human BAT 9-13, there is essentially no standardized protocol for imaging and quantification of BAT in small animal models such as mice. Here we describe a robust PET/CT imaging method for functional assessment of BAT in mice. Briefly, adult C57BL/6J mice were cold treated under fasting conditions for a duration of 4 hours before they received one dose of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG). The mice were remained in the cold for one additional hour post FDG injection, and then scanned with a small animal-dedicated micro-PET/CT system. The acquired PET images were co-registered with the CT images for anatomical references and analyzed for FDG uptake in the interscapular BAT area to present BAT activity. This standardized cold-treatment and imaging protocol has been validated through testing BAT activities during pharmacological interventions, for example, the suppressed BAT activation by the treatment of &beta;-adrenoceptor antagonist propranolol 14, 15, or the enhanced BAT activation by &beta;3 agonist BRL37344 16. The method described here can be applied to screen for drugs/compounds that modulate BAT activity, or to identify genes/pathways that are involved in BAT development and regulation in various preclinical and basic studies.

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

A method of functional imaging of mouse brown adipose tissue (BAT) is described in which cold-stimulated uptake of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG) in BAT is non-invasively assessed with a standardized micro-PET/CT protocol. This method is robust and sensitive to detect differences in BAT activities in mouse models.

Imaging funzionale del grasso bruno nei topi con FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose  tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich  vascularization and high ...

Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of genes within the mammary epithelium has been difficult to achieve due to the lack of appropriate targeting molecules that are independent of developmental stages such as pregnancy and lactation. Herein, we describe a technique for localized delivery of reagents to the mammary gland at any stage in adulthood via intraductal injection into the nipples of mice. The injections can be performed on live mice, under anesthesia, and allow for a non-invasive and localized drug delivery to the mammary gland. Furthermore, the injections can be repeated over several months without damaging the nipple. Vital dyes such as Evans Blue are very helpful to learn the technique. Upon intraductal injection of the blue dye, the entire ductal tree becomes visible to the eye. Furthermore, fluorescently labeled reagents also allow for visualization and distribution within the mammary gland. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents, and small molecules.

A protocol for the non-invasive intraductal delivery of aqueous reagents to the mouse mammary gland is described. The method takes advantage of localized injection into the nipples of mammary glands targeting mammary ducts specifically. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents and small molecules.

Iniezione intraduttale per Localizzato Drug Delivery per il mouse ghiandola mammaria

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

Imaging attraverso il caso pupa di<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Confocal Microscopy Reveals Cell Surface Receptor Aggregation Through Image Correlation Spectroscopy

Confocal microscopy provides an accessible methodology to capture sub-cellular interactions critical for the characterization and further development of pre-clinical agents labeled with fluorescent probes. With recent advancements in antibody based cytotoxic drug delivery systems, understanding the alterations induced by these agents within the realm of receptor aggregation and internalization is of critical importance. This protocol leverages the well-established methodology of fluorescent immunocytochemistry and the open source FIJI distribution of ImageJ, with its inbuilt autocorrelation and image mathematical functions, to perform spatial image correlation spectroscopy (ICS). This protocol quantitates the fluorescent intensity of labeled receptors as a function of the beam area of the confocal microscope. This provides a quantitative measure of the state of target molecule aggregation on the cell surface. This methodology is focused on the characterization of static cells with potential to expand into temporal investigations of receptor aggregation. This protocol presents an accessible methodology to provide quantification of clustering events occurring at the cell surface, utilizing well established techniques and non-specialized imaging apparatus.

Antibodies that bind to target receptors on the cell surface can confer conformation and clustering alterations. These dynamic changes have implications for characterizing drug development in target cells. This protocol utilizes confocal microscopy and image correlation spectroscopy through ImageJ/FIJI to quantify the extent of receptor clustering on the cell surface.

Microscopia confocale rivela l'aggregazione di recettore di superficie delle cellule tramite spettroscopia di correlazione di immagine

Confocal microscopy provides an accessible methodology to capture sub-cellular interactions critical for the characterization and further development of ...

Bovine Mammary Gland Biopsy Techniques

Bovine mammary gland biopsies allow researchers to collect tissue samples to study cell biology including gene expression, histological analysis, signaling pathways, and protein translation. This article describes two techniques for biopsy of the bovine mammary gland (MG). Three healthy Holstein dairy cows were the subjects. Before biopsies, cows were milked and subsequently restrained in a cattle chute. An analgesic (flunixin meglumine, 1.1 to 2.2 mg/kg of body weight) was administered via jugular intravenous [IV] injection 15-20 min prior to biopsy. For standing sedation, xylazine hydrochloride (0.01-0.05 mg/kg of body weight) was injected via the coccygeal vessels 5-10 min before the procedure. Once adequately sedated, the biopsy site was aseptically prepared and locally anaesthetized with 6 mL of 2% lidocaine hydrochloride via subcutaneous injection. Using aseptic technique, a 2 to 3 cm vertical incision was made using a number 10 scalpel. Core and needle biopsy tools were used. The core biopsy tool was attached to a cordless drill and inserted into the MG tissue through the incision using a clock-wise drill action. The needle biopsy tool was manually inserted into the incision site. Immediately after the procedure, an assistant applied pressure on the incision site for 20 to 25 min using a sterile towel to achieve hemostasis. Stainless steel surgical staples were used to oppose the skin incision. The staples were removed 10 days post-procedure. The main advantages of core and needle biopsies is that both approaches are minimally invasive procedures that can be safely performed in healthy cows. Milk yield following the biopsy was unaffected. These procedures require a short recovery time and result in fewer risks of complications. Specific limitations may include bleeding after the biopsy and infection on the biopsy site. Applications of these techniques include tissue collection for clinical diagnosis and research purposes, such as primary cell culture.

This article presents a bovine mammary gland biopsy using core and needle biopsy tools. Harvested tissue can be used for cell culture or to assess mammary physiology and metabolism including gene expression, protein expression, protein modifications, immunohistochemistry, and metabolite concentrations.