Estrazione tramite sonicazione di biomarcatori lipidici dal sedimento

Fonte: Laboratorio di Jeff Salacup - Università del Massachusetts Amherst

Il materiale che comprende la quota "organica" vivente di qualsiasi ecosistema (foglie, funghi, corteccia, tessuto; Figura 1) differisce fondamentalmente dal materiale della quota "inorganica" non vivente (rocce e minerali loro costituenti, ossigeno, acqua, metalli). Il materiale organico contiene carbonio legato a una serie di altre molecole di carbonio e idrogeno (Figura 2), che lo distingue dal materiale inorganico. L'ampio intervallo di valenza del carbonio (da -4 a +4) gli consente di formare fino a quattro legami covalenti separati con atomi vicini, di solito C, H, O, N, S e P. Può anche condividere fino a tre legami covalenti con un singolo altro atomo, come il triplo legame nel gruppo spesso velenoso del cianuro o nitrile. Negli ultimi 4,6 miliardi di anni, questa flessibilità ha portato a una straordinaria gamma di strutture chimiche, che variano per dimensioni, complessità, polarità, forma e funzione. Il campo scientifico della geochimica organica si occupa dell'identificazione e della caratterizzazione dell'intera gamma di composti organici rilevabili, chiamati biomarcatori, prodotti dalla vita su questo pianeta, così come altri, attraverso il tempo geologico.

Figura 1. Il materiale organico, come alberi, foglie e muschio, è chimicamente e visivamente distinto dal materiale inorganico, come la pavimentazione.

L'estrazione tramite sonicazione è il metodo più semplice e meno costoso per ottenere un estratto lipidico totale (TLE) da un dato campione, e il recupero associato a questo metodo è alla pari con altre tecniche più sofisticate. Utilizza un bagno ad ultrasuoni per agitare un campione in una fiala in presenza di solvente organico. I biomarcatori contenuti nel campione si dissolvono nella fase organica in base alle regole di solubilità, che con i composti organici, sono controllati principalmente dalla polarità sia del biomarcatore che del solvente. Ciò è riassunto dalla cosiddetta regola "like dissolves like", per cui i biomarcatori relativamente apolari (quelli contenenti esclusivamente C e H; isoprene) si dissolvono in solventi apolari (come esano, polarità = 0,1) e più biomarcatori polari (quelli contenenti O, N, S, P; glicerolo-dialchilglicerolo-tetraeteri (GDGT)) si dissolvono in più solventi polari (come metanolo o diclorometano, polarità = 5,1 e 3,1). Si tratta infatti del primo passo in cui si può ottenere la separazione di diversi gruppi di biomarcatori attraverso l'introduzione di una serie di solventi, da apolari a polari, ognuno dei quali estrae sempre più composti polari dal campione. I solventi degli estratti sequenziali di un sedimento bersaglio possono quindi essere analizzati separatamente o combinati per formare un estratto lipidico totale (TLE) che può essere purificato in seguito.

1. Raccogli i materiali necessari

1. Campioni (foglie, sporco, funghi, corteccia, tessuto), solitamente congelati, liofilizzati, frantumati e omogeneizzati prima dell'estrazione, estratti in gruppi per massimizzare l'efficienza. Estrarre tre campioni.
2. A seconda delle dimensioni del campione, possono essere utilizzati flaconcini con volumi compresi tra 4 e 60 ml. Per questo esperimento vengono utilizzate fiale di vetro borosilicato (40 ml) e tappi sicuri con solvente. Flaconcini, pipette di vetro borosilicato e barattoli di pesatura devono essere bruciati a 550 °C per 6 ore prima di garantire la rimozione di eventuali contaminanti organici.
3. Il diclorometano e il metanolo sono comuni nella maggior parte dei laboratori di geochimica organica. Sono usati singolarmente per risciacquare strumenti di laboratorio e vetreria prima dell'uso. Una miscela di diclorometano (DCM) a metanolo (MeOH; 9:1) viene utilizzata in molti laboratori per estrarre in modo efficiente biomarcatori con una vasta gamma di polarità. I solventi devono essere privi di contaminanti organici.
4. Utilizzare un bagno d'acqua sonicante a temperatura ambiente. Una gamma di dimensioni di sonicatori e sonicazione con o senza calore sono disponibili presso i principali rivenditori di apparecchiature scientifiche.
5. I rack delle fiale, che dovrebbero essere impermeabili, saranno collocati nel bagno di sonicazione.
6. Cappuccio chimico approvato con solvente.

2. Preparazione del campione

1. Posizionare una teglia bruciata sulla bilancia da laboratorio e quindi tarare.
2. Risciacquare la spatola da laboratorio con solvente, quindi utilizzarla per trasferire una massa appropriata di campione nella scatola di pesatura e registrare la massa.
   1. La massa del campione varia a seconda del suo contenuto di materia organica. Il materiale magro relativamente organico (fango marino) può richiedere diversi grammi, mentre il materiale ricco di materia organica (tessuto fogliare) può richiedere molto meno.
3. Trasferire tutto il materiale nella scatola di pesatura in un flaconcino bruciato, prepesato ed etichettato. Chiudere il flaconcino, quindi scartare la teglia pesata.
4. Eseguire i passaggi da 2.1 a 2.3 per ogni campione da estrarre.

3. Estrazione

1. Utilizzando una pipetta e una lampadina pre-bruciate, trasferire ~20 mL della miscela DCM:MeOH (9:1) in ciascun flaconcino (il flaconcino deve essere circa mezzo pieno). Ricapitolare i flaconcini prima di passare al campione successivo, in modo che i solventi volatili non evaporino.
   1. Le volatilità di DCM e MeOH sono diverse. L'evaporazione del solvente di estrazione a causa di fiale di campioni non tappate ha la capacità di cambiare la sua polarità e quindi l'estrazione.
2. Posizionare i flaconcini campione in un rack per flaconcini impermeabile.
3. Verificare che il livello dell'acqua nel bagno di sonicazione sia sufficientemente profondo da immergere le fiale del campione fino alla parte superiore del solvente di estrazione. Troppa acqua può far galleggiare le fiale; troppo poca acqua può impedire ai campioni di essere adeguatamente agitati.
4. Posizionare il rack del flaconcino con i campioni in esso direttamente nel bagno di sonicazione.
5. Sonicare per 30 minuti a temperatura ambiente.
6. Rimuovere il rack campione dal sonicatore. Se si estraggono sedimenti, lasciare impostare per 30 minuti per consentire l'assestamento. Se si estrae un altro set di campioni, inserire il sonicatore in questo momento.
7. Rimuovere la miscela DCM:MeOH dal flaconcino di estrazione, utilizzando una pipetta e un bulbo pre-bruciati, e inserirla in un altro flaconcino da 40 mL pre-pesato, pre-bruciato ed etichettato.
8. Ripetere 3.1 - 3.7 3x per tutti i campioni.
9. Lasciare asciugare i campioni estratti nei loro flaconcini, tappi e nel cappuccio, coperti liberamente con un pezzo di lamina. Etichettare come "residuo estratto" e conservare.
10. Etichettare gli estratti combinati per ciascun campione come 'TLE'.

Al termine dell'estrazione, è evidente un estratto lipidico totale (TLE) per ogni campione. Ogni flaconcino contiene la materia organica estraibile da un sedimento, un suolo o un tessuto vegetale. Questi TLE possono ora essere analizzati e i loro costituenti chimici identificati e quantificati.

Diverse classi di biomarcatori forniscono informazioni su aspetti specifici del sistema Terra. Ad esempio, nella sua infanzia, la geochimica organica si occupava principalmente della formazione, della migrazione e dell'alterazione del petrolio, e molti degli strumenti chimici che i geochimici organici usano oggi si basano su quelle indagini iniziali. Fu attraverso l'indagine di una classe di composti chiamati isoprenoidi, con un modello ripetuto di cinque atomi di carbonio (Figura 2), che gli scienziati scoprirono che il petrolio comprendeva i resti chimicamente alterati di antichi produttori primari, come il plancton nell'oceano (conversione in petrolio, Figura 3) o le torbiere sulla terra (carbone, Figura 4). I chimici delle grandi compagnie petrolifere usavano i rapporti di una varietà di composti, ognuno con il proprio tasso di alterazione noto, per stimare quanti anni aveva il petrolio, da dove proveniva e se valeva la pena sfruttarlo. Oggi, nuovi biomarcatori vengono scoperti, identificati e caratterizzati in campioni moderni e antichi analizzati nei laboratori di geochimica organica di tutto il mondo. Molte delle applicazioni odierne cercano di estrarre informazioni ambientali da biomarcatori ottenuti in campioni moderni (foglie, suolo, microbi, campioni di acqua, ecc.) al fine di estendere l'utilità del biomarcatore ai sedimenti antichi nel tentativo di ricostruire i climi, gli ambienti e gli ecosistemi del passato. Ad esempio, la distribuzione di un gruppo di biomarcatori chiamati glicerolo-dialchilglicerolo-tetraeteri (GDFT in breve), prodotti da una serie di archaea e batteri, sono stati trovati nei sedimenti moderni per cambiare in modo prevedibile in risposta alla temperatura dell'aria o dell'acqua. Pertanto la distribuzione di questi biomarcatori nei sedimenti antichi può essere utilizzata, o attraverso una serie di sedimenti di età nota, per ricostruire la temperatura dell'aria e dell'acqua indietro di diversi milioni di anni.

Figura 2. L'isoprene comprende cinque atomi di carbonio e due doppi legami. Se sommati nella reazione di biosintesi, possono formare molecole complesse diagnostiche per la presenza di vita. Ad esempio, 2, 6,10,15,19-pentametileicosane, che si trova comunemente nelle stuoie cianobatteriche.

Figura 3. Illuminazione del plancton alle Maldive. Copyright Pawelg Foto.

Figura 4. Torbiera a 4.500 m di altitudine nelle Ande ecuadoriane. Copyright Dr. Morley Read