Survivable Chirurgia Stereotassica in roditori

Il monitoraggio dei livelli del neurotrasmettitore extracellulare nelle regioni cerebrali distinte di muoversi liberamente animali offre approfondimenti sul legame tra il rilascio dei neurotrasmettitori e comportamento. In microdialisi in vivo accoppiato con rilevazione elettrochimica fornisce anatomica eccellente e la risoluzione chimici e informazioni su come neurotrasmissione basale è alterato da manipolazioni farmacologiche o fisiologiche.

La capacità di misurare i livelli basali extracellulari di neurotrasmettitori nel cervello di animali svegli permette per la determinazione degli effetti di diverse sfide sistemiche (farmacologici o fisiologico) al sistema nervoso centrale. Per esempio, si può misurare direttamente come proiezioni dopamina dell'animale mesencefalo rispondere a rilascio di dopamina farmaci come gli stimoli d-anfetamina o naturale come il cibo. In questo video vi mostriamo come impianto cannule guida targeting siti specifici nel cervello del ratto, come inserire e impiantare una sonda microdialisi e come utilizzare cromatografia liquida ad alta prestazione accoppiata con rilevazione elettrochimica (HPLC-EC) per misurare i livelli extracellulari di neurotrasmettitori ossidabili e metaboliti. Locali introduzione preciso dei farmaci attraverso la sonda di microdialisi permette di raffinato lavoro sulle specificità del sito in un composto s meccanismo di azione. Questa tecnica è eccellente e la risoluzione anatomica chimiche, ma solo i tempi di risoluzione modesta come campioni microdialisi sono di norma elaborata ogni 20-30 minuti per assicurare i livelli di neurotrasmettitore rilevabili. Strumenti complementari ex vivo (cioè fetta e coltura cellulare elettrofisiologia) può aiutare con il monitoraggio in tempo reale la neurotrasmissione.

Riassunto

Due mesi di età media di topi C57BL/6J età o equivalente o tre mesi età media ratti Sprague Dawley o equivalenti sono anestetizzati con ketamina (60 mg / kg ip per i ratti; 100 mg / kg ip per topi) e xilazina (10 mg / kg, ip per entrambe le specie). La sedazione è controllata mediante un pizzico dolce toe ritirare riflesso dimostrato in Walantus et al. (Giove, 6, 2007) e Szot et al. (Giove, 9, 2007). Termoregolazione può essere fornita attraverso una piastra elettrica thermostatregulated (ALA Instruments Inc.) e monitorati attraverso un termometro rettale. La testa è rasata di pelliccia e pulito con iodio prima incisione. Dopo l'incisione della pelle (2 cm di lunghezza per i ratti, 1 cm per topi) e la rimozione di tutti i tessuti molli dalla superficie del cranio, il posizionamento della cannula guida è determinato in relazione al bregma. A 6 mm foro si è esercitato attraverso il cranio con un trapano a batteria destinati per la chirurgia roditori (Strumenti Scienza Fine, Inc.). Si fa attenzione in modo che la punta non penetra attraverso le membrane meningee o vasi sanguigni. Cranio è impiantato bilaterale con 5 millimetri 21 alberi in acciaio inox calibro guida che porta al nucleo accumbens posteriore, striato dorsale o corteccia prefrontale. Le coordinate stereotassiche sono stabiliti secondo Franklin e Paxinos, 1997 (Il cervello del mouse in coordinate Stereotassica, Academic Press) o Paxinos e Watson, 2006 (Il cervello di ratto in coordinate Stereotassica, Academic Press). Gli impianti sono garantiti da cemento dentale. Un bolo di Ringer lattato della soluzione salina 0,9% è dato alla fine della chirurgia (5mls SC nei ratti e 1 ml SC nei topi dopo fluidi sono portata a temperatura corporea normale) per prevenire la disidratazione. Buprenorfina (0.1-0.5mg/kg SC) viene somministrato due volte al giorno e, poi, su una base come-necessaria, se l'animale sembra essere in sofferenza. Trattamento antibiotico locale (unguento bacitracina) e un trattamento antibiotico sistemico (penicillina 100.000 UI / kg IM ogni 12 ore per le prime 48 ore post-op) se vengono somministrati infezioni post-operatorie si verificano.

Dopo la chirurgia, gli animali sono alloggiati individualmente con il cibo e ad libitum acqua disponibile. Almeno una settimana è consentito per il recupero prima di microdialisi e l'eutanasia. A seguito di recupero da un intervento chirurgico, gli animali vengono trasferiti in una gabbia microdialisi e sonde microdialisi sono inseriti e cementati nei pozzi guida che sono stati installati durante l'intervento. L'inserimento della sonda non provoca dolore o fastidio, perché la sonda è bypassando tessuto cutaneo, muscolare e meningea attraverso l'albero guida. Pertanto, l'inserimento della sonda viene fatto senza anestesia e qualsiasi anestesia effetti indotti sulla neurochimica o comportamenti sono evitati. Lasciamo che le sonde stabilizzazione per 12 ore e poi iniziare il campionamento ogni 30 minuti per un altro 8-12 ore a seconda dell'esperimento. Monitoriamo il comportamento motorio degli animali attraverso fotocellule o la registrazione manuale del movimento dallo sperimentatore. Microdialysate campioni vengono iniettati in una cromatografia liquida ad alte prestazioni con rilevazione elettrochimica (HPLC-EC) strumento per la rilevazione e l'analisi neurochimiche. Siamo alla ricerca di effetti sulla neurochimica basale e il comportamento motorio. Alla fine dell'esperimento l'animale è eutanasia da un overdose di ketamina sistemica (200 mg / kg ip) e xilazina (20 mg / kg, ip). Allora il cuore è perfuso con soluzione salina 0,9% seguito da 4% paraformaldeide. I cervelli sono stati rimossi, congelati e tagliare lungo il tratto della sonda microdialisi per verificare il posizionamento preciso della sonda.

Procedura

1. Impostare lo strumento stereotassico e tutti i materiali necessari. Assicurarsi che l'area e gli strumenti sono puliti e sterilizzati.
   
   
2. Radersi pelliccia con rasoio elettrico. Vai dalle orecchie a soli in mezzo agli occhi, spostare rasoio in diverse direzioni per pulire efficacemente un'area di pelliccia. Applicare povidine / iodio a zona rasata, ma proteggere gli occhi da esso.
   
   
3. Montare l'animale su l'apparato stereotassico inserendo le barrette orecchio nel condotto uditivo e di serraggio in posizione. Prima cosa si monti una barra orecchio nel canale auricolare, e poi tenerlo in posizione e scivolare nel bar altro orecchio. Sai che sono nella posizione corretta quando la testa non può più essere spostato lateralmente. Fissare la bocca con il supporto anteriore del stereotassica e assicurarsi che la testa sia a livello con un righello. Mettere il righello in posizione verticale rispetto alla piattaforma strumento stereotassico e verificare la presenza di un angolo di 90 ° tra il sovrano e la metà del cuoio capelluto dell'animale). Confermare questo attraverso lo strumento stereotassico se offre funzionalità di questo tipo.
   
   
4. Fare un'incisione anteriore / posteriore del cuoio capelluto con un bisturi sterile, che si estende dal lambda a soli in mezzo agli occhi dell'animale. Usa hemostats sterilizzati per pizzicare sulla pelle e tenere aperta l'incisione. Utilizzando diversi tamponi di cotone sterile, asciugare la superficie esposta del cranio.
   
   
5. Mettere la cannula guida sul suo supporto, trovare bregma sul cranio, e la posizione della cannula guida a destra su questa posizione. Annotare le coordinate anteriore / posteriore e laterale. Da bregma, trovare le coordinate necessarie per il corretto posizionamento del vostro sonda con l'aiuto dell'atlante stereotassico. Posizionare la cannula guida alle coordinate corrette aggiungendo o sottraendo dal bregma. Portate la vostra cannula guida verso il basso fino a toccare il cranio, e poi registrare questa coordinata ventrale. Fare un segno di matita con una matita sterile in questa posizione sul cranio, questo è dove sarete foratura.
   
   
6. Rimuovere la cannula guida e sterilizzare la tua punta da trapano. Con attenzione praticare un foro al segno a matita fino ad ottenere attraverso la larghezza del cranio. Verificare con la cannula guida per vedere se sarebbe chiaro il foro senza toccare i bordi. Tenere foratura e controllo fino a quando la cannula può cancellare in un percorso rettilineo. Una volta che il buco è fatto, utilizzare un ago sterile a pugni con delicatezza le meningi in modo da permettere l'inserimento della cannula senza ostacoli.
   
   
7. Successivamente, utilizzando un trapano a mano, rendono sei fori per le viti del cranio: due anteriori al foro della cannula, due laterali al foro della cannula, e posteriori ai lati due. Sterilizzare sei viti e metterli sul cranio, fino a che non sono strettamente ancorate su.
   
   
8. Pulire la cannula guida con etanolo e saline, montare, e abbassare lentamente alla coordinata corretta ventrale. Assicurarsi che i lati non si toccano e che sta andando in perfetta verticale.
   
   
9. Posizionare la vite di ancoraggio medialmente e dietro le viti cranio posteriore e tenerlo in posizione con le pinzette. Mescolare un lotto sottile di liquido cemento dentale e coprire la cannula guida, viti, e il resto del cranio con una spatola sterile. Fare un altro lotto, questa volta più spessa, e coprire completamente la zona e la vite cannula e ancora abbastanza per fissarlo.
   
   
10. Come il cemento diventa più spessa e prima che si solidifica, separare la pelle dalla coppa cemento e stampo la coppa di cemento con la spatola per assicurarsi che il tappo di cemento è tutt'intorno e non irrita la pelle più tardi.
    
    
11. Lasciare che il cemento dentale si asciughi completamente prima di rimuovere l'animale dall'apparecchio. Rimuovere il hemostats. Applicare tutto il percorso attorno al tappo di cemento bacitracina.
    
    
12. Una volta che l'animale è spento lo strumento stereotassico, si iniettano con 0,25 ml di penicillina IM (intra-muscolare), seguito da 1 ml di soluzione fisiologica SC (via sottocutanea).
    
    
13. Posto l'animale nella sua gabbietta e monitorare fino a che non prende coscienza prima di tornare alla sua stanza per recuperare.
    
    
14. Monitorare gli animali fino a quando non riprendersi dall'anestesia il giorno dell'intervento e giorno post-op, fino alla fine dell'esperimento, eventuali segni di infezione e di valutazione del dolore / disagio. Questo include fine settimana e festivi. Bassa movimento spontaneo, vocalizzazione angoscia sulla gestione, la postura ingobbita, diarrea, gonfiore e scarico nella zona del headmount, e la mancanza di alimentazione / bere sono tutti segni di dolore e di angoscia. Buprenorfina (0.1-0.5mg/kg SC) viene somministrato due volte al giorno, e poi, su una base come-necessaria, se l'animale sembra essere in sofferenza. Trattamento antibiotico locale (unguento bacitracina) e un trattamento antibiotico sistemico (penicillina 100.000 UI / kg IM ogni 12 ore per le prime 48 ore post-op) se vengono somministrati infezioni post-operatorie si verificano. Se qualcuno di questi sintomi persistono dopo la somministrazione di buprenorfina, il liquido supplementare, e il trattamento antibiotico entro le 12 ore di intervento chirurgico, l'animale è eutanasia.

Microdialisi in vivo è lo strumento di scelta per la misurazione dei neurotrasmettitori multipli e metaboliti in siti diversi del cervello di un animale vivo. Tuttavia, controlla solo i livelli extracellulari di sostanze neurochimiche e non offre la risoluzione temporale di monitorare esocitosi dei neurotrasmettitori in tempo reale. Attraverso una versione della tecnica chiamata "net-flux", la concentrazione dei neurotrasmettitori effettiva in un determinato sito può essere calcolato, che a loro volta possono dare misurazioni accurate del tasso di neurotrasmettitore del reuptake attraverso trasportatori della membrana plasmatica.

Microdialisi è ideale nell'illustrare le differenze in basale livelli del neurotrasmettitore extracellulare tra i diversi gruppi di animali (cioè genotipi diversi) e nel decifrare gli effetti di droghe o altre manipolazioni sul rilascio di neurotrasmettitore.

L'introduzione di test alternativi per HPLC-CE come elettroforesi capillare (CZE) accoppiato con rilevazione a fluorescenza ha aumentato la risoluzione del tempo di microdialisi in vivo in pochi minuti per campione.

The authors have nothing to disclose.

Supportato da DK065872 (PEV), una famiglia Smith Award Foundation di eccellenza nella ricerca biomedica (PEV), F31 DA023760.