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La quantificazione del glucosio di Bergmeyer è una tecnica enzimatica spettrofotometrica utilizzata principalmente per test clinici che misurano in modo accurato e sensibile la quantità di glucosio. In questo articolo, presentiamo un protocollo per l'utilizzo di questo metodo per i campioni microbiologici.
La concentrazione di glucosio è un indicatore chiave del metabolismo cellulare e potrebbe indicare il tasso di metabolismo totale, un'aberrazione nel metabolismo del glucosio e, in alcuni casi, il modo in cui le cellule accoppiano il metabolismo del glucosio al metabolismo energetico. Inoltre, i livelli di glucosio intracellulari ed extracellulari sono indicativi dello stato metabolico cellulare. Le tecniche enzimatiche, come la quantificazione del glucosio di Bergmeyer, sono più accurate e sensibili di altre tecniche, come l'acido dinitrosalicilico o i metodi di fluorescenza, che vengono solitamente utilizzati in microbiologia. Sebbene utilizzata principalmente in ambito clinico, la quantificazione del glucosio di Bergmeyer può essere applicata anche a qualsiasi cellula, ma non è stata riportata in dettaglio per batteri, funghi, lieviti o altri microrganismi.
In questo articolo, presentiamo una metodologia per quantificare il glucosio da campioni di batteri e lieviti utilizzando il metodo enzimatico di quantificazione del glucosio di Bergmeyer. La procedura ha coinvolto gli enzimi glucosio ossidasi, perossidasi e o-dianisidina dicloridrato incubati a 37 °C per 20 minuti, seguiti dall'aggiunta di acido solforico. L'assorbanza viene quindi misurata a 545 nm. È importante sottolineare che, sebbene questa tecnica presenti difficoltà nella misurazione di alte concentrazioni di glucosio (superiori a 60 g/L), è possibile misurare concentrazioni inferiori a 50 g/L utilizzando fattori di diluizione. Questo approccio enzimatico è prezioso per la ricerca e l'analisi in microbiologia e in altre aree scientifiche. La precisione e la sensibilità del metodo lo rendono utile per rilevare anche basse concentrazioni di glucosio in campioni microbiologici.
Il glucosio funge da fonte primaria di energia e carbonio per numerosi microrganismi, tra cui batteri, lieviti e funghi. Questi microrganismi assorbono il glucosio attraverso trasportatori situati sulla membrana extracellulare, dove subisce una serie di reazioni biochimiche all'interno della via metabolica della glicolisi per essere convertito in piruvato1. Esistono varie tecniche per la quantificazione degli zuccheri riducenti come il glucosio. Ad esempio, il reagentedi Benedict 2, l'uso dell'acido 3,5-dinitrosalicilico (DNS)3,4, il metodo dell'antropa5 o l'acido fenolo-solforico6 possono essere impiegati. Tuttavia, questi metodi rilevano lo zucchero riducente presente nel campione, come il fruttosio e il maltosio, che possono contribuire al segnale e complicare la quantificazione accurata di un particolare zucchero.
Inoltre, richiedono un rigoroso controllo della temperatura e la manipolazione di sostanze pericolose, che possono complicare il processo e influire sulla precisione. Questi metodi possono anche subire l'interferenza di altri composti presenti nel campione, rendendo difficile una quantificazione accurata del glucosio. Al contrario, la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) offre un'alternativa più precisa, consentendo la discriminazione tra glucosio e altri zuccheri riducenti, anche se con costi operativi più elevati. Questi metodi contrastanti evidenziano la continua necessità di sviluppare tecniche di quantificazione del glucosio accurate ed economiche7.
Il metodo glucosio ossidasi-perossidasi-acido solforico (GOX-H2SO4) impiega due enzimi, glucosio ossidasi (GOD) e perossidasi (POD). GOD è un enzima ossidoreduttasi molto selettivo per l'ossidazione del β-D-glucosio8. Questo complesso funge da catalizzatore durante la reazione che avviene quando il glucosio è in presenza di ossigeno, producendo acido gluconico e perossido di idrogeno (H2O2). L'H2O2 viene rilevato per mezzo di un accettore cromogenico di ossigeno, l'o-dianisidina, che, in seguito all'interazione con il POD, ne provoca l'ossidazione e il rilascio di H2O2, impedendo che l'acido gluconico venga riconvertito in glucosio (vedi Figura 1). Il colore ottenuto viene stabilizzato mediante l'aggiunta di acido solforico (H2SO4), che arresta anche la reazione enzimatica, evitando così possibili interferenze che potrebbero verificarsi se la reazione continuasse9.
Figura 1: Panoramica del metodo di quantificazione del glucosio utilizzando l'enzima glucosio ossidasi, che reagisce con il glucosio per produrre perossido di idrogeno (H2O2) e acido gluconico. Successivamente, l'enzima perossidasi reagisce con H2O2 in presenza di O-dianisidina dicloridrato. Nella fase finale, viene aggiunto acido solforico (H2SO4) per fermare la reazione enzimatica, ottenendo un colore rosa che viene misurato a 529 nm. Abbreviazioni: POD = perossidasi; GOD = glucosio ossidasi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Il metodo enzimatico GOX-H2SO4 è una tecnica ampiamente utilizzata per misurare la concentrazione di glucosio in campioni biologici, la maggior parte dei quali sono di interesse clinico. Tuttavia, pochi studi hanno indagato una tecnica che consenta di quantificare la quantità di glucosio in un terreno di coltura per valutarne il consumo. Pertanto, nel presente protocollo, viene presentata la metodologia per quantificare il glucosio mediante la reazione enzimatica di glucosio ossidasi, perossidasi, o-dianisidina dicloridrato e H2SO4 in campioni liquidi microbiologici, che nasce come una modifica del lavoro svolto da Bergmeyer9, utilizzando il 50% (v/v) di H2SO4 e quantità inferiori di reagenti.
1. Preparazione della soluzione
2. Preparazione degli enzimi
3. Standard glicemico
4. Preparazione della curva standard
Tabella 1: Curva di calibrazione del glucosio per il metodo GOX-H2SO4 . Abbreviazioni: GOD = glucosio ossidasi; POD = perossidasi; H2SO4 = acido solforico. Clicca qui per scaricare questa tabella.
5. Analisi di campioni microbiologici
6. Validazione analitica
7. Interferenza di altri zuccheri riducenti
L'analisi spettrofotometrica di GOX-H2SO4 ha rivelato un'unica assorbanza massima a 529 nm (λmax) (Figura 2A), con valori di assorbanza aggiuntivi osservati a 545 nm. Analizzando i valori di assorbanza a diverse concentrazioni di glucosio, abbiamo ottenuto una linearità (R²) di 0,9977 per λ529 nm e R² di 0,9967 per λ545 nm (Figura 2B). La linearità, all'interno di un dato intervallo, si riferisce alla capacità di fornire risultati direttamente proporzionali alla concentrazione di glucosio nei campioni. Questo è stato valutato utilizzando il coefficiente di determinazione, che riflette l'accuratezza del modello di regressione (Figura 2A) all'interno dell'intervallo di assorbanza da 0 a 1,0.
Figura 2: Curva di calibrazione e spettri di assorbanza per la quantificazione del glucosio. (A) L'adeguamento al modello lineare per la curva standard con il metodo proposto GOX-H2SO4 con diverse quantità di glucosio e due lunghezze d'onda (529 nm e 545 nm) mostra che la relazione tra le assorbanze rimane lineare, (n = 3, le barre sono indicate come SD). (B) Profili di assorbanza diretta del metodo GOX-H2SO4 utilizzando diverse quantità di glucosio, dove la lunghezza d'onda massima era di 529 nm. Le righe sono contrassegnate come segue: (---) era il bianco seguito da () 0,0005 g/L, (
) 0,001 g/L, (
) 0,002 g/L, (---) 0,004 g/L, (
) 0,006 g/L e (
) per 0,008 g/L. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Per convalidare i parametri di prestazione del metodo, sono stati testati diversi zuccheri: glucosio, fruttosio, galattosio, mannosio e xilosio. Il trealosio è stato usato come controllo negativo. Tutti i campioni sono stati trattati in modo simile. Solo il glucosio ha mostrato la reazione e il colore tra gli zuccheri testati. L'accuratezza è stata determinata dai valori percentuali di recupero. Il glucosio a 529 nm e 545 nm aveva una buona linearità e una buona precisione. Il limite di quantificazione più basso era 2,9 × 10-7 per la lunghezza d'onda di 529 nm e 4,0 × 10-7 per la lunghezza d'onda di 545 nm. L'intervallo di quantificazione per entrambe le lunghezze d'onda va da 0,001 g/L a 0,08 g/L.
D'altra parte, i valori calcolati rimangono coerenti con i risultati precedenti, confermando che l'analisi dei dati è accurata (utilizzando una lunghezza d'onda di 529 nm). I valori di accuratezza sono piccoli, dimostrando che i valori di assorbanza osservati corrispondono strettamente ai valori attesi dal modello di regressione lineare, e la precisione, indicata dalla deviazione standard, è buona, soprattutto a concentrazioni più elevate (Tabella 2).
Tabella 2. Analisi statistica e parametri di validazione del metodo GOX-H2SO4 . (n = 3, nd = non determinato). I parametri di validazione per il glucosio a 545 nm e 529 nm sono mostrati, tra gli altri zuccheri riducenti, incluso il trealosio come controllo negativo. Abbreviazioni: SD = deviazione standard; CV = coefficiente di variazione; LOQ = limite di quantificazione. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Si ottiene un colore rosa (Figura 3), che è proporzionale alla quantità di glucosio in ciascuna cellula della cuvetta. Il campo di rilevamento è risultato essere di 0,01 g/L. Se la concentrazione di glucosio è troppo alta (fino a 30 g/L), il tubo potrebbe diventare viola o viola, il che è errato; pertanto, si consiglia la diluizione prima di procedere.
Figura 3: Risultati del saggio colorimetrico dei campioni di glucosio (S1-S 7) rispetto ai bianchi (B1-B 2) Questa colorazione è correlata alla quantità di glucosio presente nel campione, dove B1 e B2 sono i bianchi. L'intensità del colore rosa aumenta con la concentrazione di glucosio. Le concentrazioni sono le seguenti: (S1) 0,0005 g/L, (S2) 0,001 g/L, (S3) 0,002 g/L, (S4) 0,004 g/L, (S5) 0,006 g/L, (S6) 0,008 g/L e (S7) 0,01 g/L (n = 3). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
È stata condotta la valutazione del consumo di glucosio da parte di Debaryomyces hansenii , confrontando i risultati ottenuti utilizzando i metodi GOX-H2SO4 e DNS (Figura 4). Come anticipato, il metodo DNS ha mostrato una reattività diversa, un comportamento non osservato con il metodo GOX-H2SO4 .
Figura 4: Profilo di consumo di D. hanseii per la quantificazione del glucosio. Consumo con () e senza (
) l'olio utilizzando il metodo GOX-H2SO4 . Utilizzando il metodo DNS con (
) e senza (
) l'olio, il tempo di campionamento è stato di 2 ore in triplicato (n = 3, SD è rappresentato da barre di errore). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Oltre alla Figura 4, presentiamo l'analisi statistica (ANOVA) che confronta i due diversi metodi (Tabella 3).
Tabella 3: I risultati dell'ANOVA con le componenti della varianza, comprese le varianze tra i gruppi e all'interno dei gruppi, insieme ai corrispondenti valori p. Questi risultati mostrano se ci sono differenze statisticamente significative tra i metodi in diversi punti temporali. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Un valore p < 0,05 indica una differenza significativa tra i metodi, rivelando differenze significative tra i metodi GOX-H2SO4 e DNS a 6, 8 e 12 ore (Tabella 4 e Tabella 5).
Tabella 4: La media delle differenze di un ciclo sperimentale con due repliche di glucosio senza olio, utilizzando i metodi GOX-H2SO4 e DNS. Le differenze statisticamente significative tra ciascuno dei test indipendenti nel tempo sono evidenziate in grassetto (Tukey, α = 0,05). Abbreviazioni: GOX-H2SO4 = acido glucosio ossidasi-perossidasi-solforico; DNS = acido 3,5-dinitrosalicilico; CI = intervallo di confidenza. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 5: Media di un ciclo sperimentale con due repliche di glucosio con olio, utilizzando i metodi GOX-H2SO4 e DNS. Le differenze statisticamente significative tra ciascuno dei test indipendenti nel tempo sono evidenziate in grassetto (Tukey, α = 0,05). Abbreviazioni: GOX-H2SO4 = acido glucosio ossidasi-perossidasi-solforico; DNS = acido 3,5-dinitrosalicilico; CI = intervallo di confidenza. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Inoltre, il metodo può essere applicato per analizzare alte concentrazioni di glucosio (fino a 100 g/L, utilizzando fattori di diluizione appropriati, come mostrato nella Figura 5), dove è stato valutato il consumo di glucosio da parte di Pseudomonas reptilivora .
Figura 5: Profilo di consumo di glucosio di P. reptilivora in presenza di alte concentrazioni. () utilizzava 100 g/L di glucosio, (
) utilizzava 55 g/L e infine (
) utilizzava 10 g/L di glucosio (n = 3, SD è rappresentato da barre di errore). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
L'utilizzo di un test in bianco e di uno standard con una concentrazione di glucosio nota garantisce risultati accurati, indipendentemente da potenziali problemi tecnici con lo spettrofotometro utilizzato nell'analisi.
La quantificazione del glucosio nei terreni di coltura è essenziale per comprendere la crescita microbica e l'attività metabolica, poiché il glucosio funge da fonte di energia primaria per molti microrganismi. In questo studio, abbiamo impiegato il metodo GOX-H2SO4 per misurare con precisione i livelli di glucosio nei terreni di coltura, con l'obiettivo di ottimizzare i processi microbici nei batteri o nelle fermentazioni dei lieviti. I nostri risultati sono coerenti con quelli di Yuen e McNeill11; Tuttavia, a differenza di loro, i nostri risultati indicano che le letture sono accurate a livelli di glucosio più elevati. Un passaggio critico nella sperimentazione è la temporizzazione dopo l'aggiunta della soluzione POD alle valvole. L'aggiunta deve essere precisa; se il tempo di reazione supera i 25 minuti a 37 °C senza l'aggiunta di H2SO4, le letture possono risultare imprecise, come notato da Bergmeyer9. Pertanto, si consiglia di aggiungere il 50% di H2SO4 subito dopo che è trascorso il tempo richiesto (20 minuti) per garantire l'accuratezza dei risultati ottenuti con il metodo GOX-H2SO4 .
La quantificazione del glucosio con il metodo GOX-H2SO4 ha dimostrato un'elevata accuratezza e sensibilità nei terreni di coltura, riflettendo il consumo metabolico attivo da parte dei microrganismi presentati in questo studio (P. reptilivora e D. hanseii). Questi risultati sono indicativi del consumo di glucosio nel tempo da parte di questi microrganismi.
Durante l'analisi DNS di P. reptilivora (dati non mostrati), abbiamo osservato che c'era un'interferenza da parte degli acidi organici, causando l'effetto opposto a quello che ci si aspetterebbe dal consumo di glucosio portando a risultati falsi. Tuttavia, è importante chiarire che Bergmeyer6 non ha eseguito alcun test con campioni microbiologici e non specifica le quantità precise di reagenti per volumi inferiori a 3,0 mL. Pertanto, questo metodo rappresenta un'ottimizzazione e un miglioramento riducendo il volume totale di reazione a 1,5 mL. Questo volume potrebbe essere ulteriormente ridotto quando si utilizza un lettore di piastre.
D'altra parte, il metodo GOX-H2SO4 è sensibile alla quantità di glucosio presente nel campione ma non reagisce con altri zuccheri come trealosio, fruttosio, galattosio, xilosio e mannosio presentati nella Tabella 2. Ciò significa che il metodo GOX può fornire una misura accurata della concentrazione di glucosio, ma non è adatto per determinare la presenza o la concentrazione di zuccheri diversi dal glucosio 8,11,12,13.
Secondo i risultati qui presentati, il metodo GOX-H2SO4 è altamente sensibile alla concentrazione di glucosio nel campione e non mostra comportamenti diversi tra i due microrganismi, D. hansenii e P. reptilivora, come osservato con il metodo DNS (Tabella 4 e Tabella 5). Il vantaggio principale del metodo GOX-H2SO4 è che può essere sviluppato utilizzando reagenti con variazioni minime, e non è necessario utilizzare celle di quarzo o vetro, perché la lunghezza d'onda da analizzare rientra nell'intervallo della luce visibile. Pertanto, le celle di plastica usa e getta possono essere utilizzate e riutilizzate, così come i puntali di plastica.
Uno svantaggio di questo metodo è la necessità di preparare nuove curve di calibrazione se le soluzioni enzimatiche o il tampone fosfato con o-dianisidina sono esauriti. Tuttavia, date le concentrazioni qui presentate, è possibile eseguire più di 100 test. Un altro svantaggio è che il grezzo genera H2O2 che, combinato con H2SO4, trasforma il grezzo in un forte agente ossidante se lasciato per più di 24 ore. Pertanto, è necessario prendere precauzioni. Si raccomanda di scartare tutti i campioni dopo la misurazione. Infine, l'uso di enzimi presenta un altro svantaggio, in quanto sono tipicamente attivi fino a 2 mesi. Se c'è il sospetto di un fallimento del metodo, è molto probabilmente dovuto alla degradazione dell'enzima, che richiede la preparazione di una nuova soluzione enzimatica. Allo stesso modo, se le soluzioni (enzimi o tampone) vengono lasciate a temperatura ambiente per più di 12 ore, possono degradarsi. Infine, la miscela di o-dianisidina dicloridrato e H2SO4 deve essere smaltita come rifiuto pericoloso.
Il metodo GOX-H2SO4 può essere impiegato nell'industria alimentare per misurare con precisione il contenuto di glucosio in vari prodotti, come succhi, marmellate e latticini, garantendo qualità e conformità agli standard. Può anche essere utilizzato per monitorare le fermentazioni, in particolare nei processi in cui il glucosio è la principale fonte di carbonio, ottimizzando così l'efficienza e la resa produttiva. Nella ricerca, questo metodo è prezioso per studiare il metabolismo cellulare, consentendo l'analisi di come le cellule elaborano il glucosio extracellulare. Inoltre, funge da base per lo sviluppo di biosensori, che sono dispositivi utilizzati per il monitoraggio del glucosio in tempo reale.
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse
Siamo grati per le donazioni parziali del Tecnológico Nacional de México nel Bando 2023 e 2024 per la Ricerca Scientifica, lo Sviluppo Tecnologico (16432.23-P y 19545.24-P). Ringraziamo il Consiglio Nazionale per le Scienze Umane, le Scienze e le Tecnologie (CONAHCyT) per la borsa di studio ricevuta (n. 832315) durante gli studi di dottorato (IHRH), e si ringrazia la partecipazione e la collaborazione di Wendolyne Monroy-Martínez. La Figura 1 è stata creata con BioRender.com.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL microtube | Eppendorf | - | - |
2.0 mL microtube | Eppendorf | - | - |
CaCO3 | Meyer | 471-34-1 | Calcium Carbonate |
D-Glucose | Meyer | 50-99-7 | D-Glucose |
Drybath | FisherScientific | 11-718-4 | Serial 911NO251. Block WxDxH mm/in: 124 x 76 x 39 / 4.9 x 3.0 x 1.5 |
Glucose oxidase | Sigma Aldrich | G6125-50KU | Enzyme powder |
H2O | - | - | Deionized water |
H2SO4 | Meyer | 7664-93-9 | Sulfuric acid |
HCl | Meyer | 7647-01-0 | Hydrochloridric acid |
K2HPO4 | Meyer | 7758-11-4 | Dipotassium phosphate |
KH2PO4 | Meyer | 7778-77-0 | Monopotassium phosphate |
KOH | Meyer | 1310-58-3 | Potassium hydroxide |
Lambda 35 | PerkinElmer | - | Spectrophotometer |
Microtube centrifuge | - | - | - |
o-Dianisidine dihydrochloride | Sigma Aldrich | D3252 | Chromogenic |
Peroxidase | Sigma Aldrich | P8125-50KU | Enzyme powder |
pH-meter | Hanna | 1131 | Hanna 1170 |
Sodium acetate | Meyer | 127-09-3 | Meyer |
Weighing spatulas | - | - | - |
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