Ottimizzazione delle tecniche urodinamiche del topo per una maggiore precisione

Questo protocollo fornisce una guida per impermeabilizzare la pelle con cianoacrilato per prevenire l'assorbimento dell'urina da parte del pelo e della pelle. Include le istruzioni per l'applicazione della colla sulla pelle, l'impianto di un catetere vescicale ed elettrodi per la cistometria e le registrazioni elettromiografiche dello sfintere uretrale esterno nei topi svegli.

La misurazione accurata dei parametri urinari nei topi svegli è fondamentale per comprendere la disfunzione del tratto urinario inferiore (LUT), in particolare in condizioni come la lesione post-traumatica del midollo spinale (SCI) della vescica neurogena. Tuttavia, l'esecuzione di registrazioni cistometriche nei topi presenta notevoli sfide. Quando i topi sono in una posizione prona e ristretta durante le sessioni di registrazione, l'urina tende ad essere assorbita dal pelo e dalla pelle, portando a una sottostima del volume svuotato (VV). L'obiettivo di questo studio era migliorare l'accuratezza della cistometria e delle registrazioni dell'elettromiografia dello sfintere uretrale esterno (EUS-EMG) nei topi svegli. Abbiamo sviluppato un metodo unico che utilizza l'adesivo cianoacrilato per creare una barriera cutanea impermeabile attorno al meato uretrale e all'addome, impedendo l'assorbimento dell'urina e garantendo misurazioni precise. I risultati mostrano che dopo l'applicazione del cianoacrilato, la somma di VV e RV è rimasta coerente con il volume salino infuso e non sono state osservate aree umide dopo l'esperimento, indicando un successo nella prevenzione dell'assorbimento delle urine. Inoltre, il metodo ha stabilizzato contemporaneamente gli elettrodi collegati allo sfintere uretrale esterno (EUS), ha assicurato segnali elettromiografici stabili (EMG) e ha ridotto al minimo gli artefatti causati dal movimento del topo risvegliato e dalla manipolazione dello sperimentatore. Vengono discussi i dettagli metodologici, i risultati e le implicazioni, evidenziando l'importanza di migliorare le tecniche urodinamiche nella ricerca preclinica.

L'immagazzinamento e il rilascio dell'urina dipendono dall'attività coordinata della vescica urinaria e dello sfintere uretrale esterno (EUS). In alcune patologie come la vescica neurogena, sia i muscoli detrusori vescicali che lo sfintere possono diventare disfunzionali, portando a problemi significativi alla vescica, soprattutto dopo una lesione traumatica del midollo spinale (SCI)¹.

I piccoli roditori sono comunemente usati come modello sperimentale per studiare la funzione preclinica del tratto urinario inferiore (LUT)². Le tecniche di registrazione della cistometria di riempimento (FC) e dell'elettromiografia EUS (EUS-EMG) possono fornire informazioni oggettive precise a seconda della scelta dei metodi, della misurazione accurata e dell'interpretazione dei risultati³. I test urodinamici sono comunemente usati per valutare il volume minzionale (VV), l'efficienza minzionale (VE) e la capacità vescicale⁴. VE misura l'efficacia con cui la vescica può svuotarsi. Si calcola dividendo il volume vuoto per la somma dei volumi vuoti e residui (VV+RV). D'altra parte, la capacità della vescica viene calcolata sommando il VV (la quantità di urina espulsa durante la minzione) al RV (la quantità di urina rimasta nella vescica dopo la minzione)⁵. Pertanto, la misurazione di VV e RV sono le chiavi per dedurre altri parametri.

La misurazione precisa del VV nei topi durante i test urodinamici presenta diverse sfide. L'urina dei roditori, quando è fisicamente trattenuta in posizione prona, tende ad essere aspirata verso il basso attraverso la parete addominale ventrale a causa dell'influenza della gravità⁶. Questo fenomeno può portare all'assorbimento dell'urina da parte del pelo addominale e della pelle, che, a sua volta, sottostima il volume di urina escreta. Considerando la piccola quantità di urina prodotta dal topo, l'impatto di questa assorbanza sull'accuratezza dei risultati è ancora più pronunciato⁷. Inoltre, nei modelli di lesione midollare, il VV è spesso inferiore rispetto ai topi normali a causa dell'impatto della dissinergia dello sfintere detrusore (DSD), che aumenta il rischio di pressioni del punto di perdita e l'assorbimento dell'urina da parte del pelo⁸. Questi fattori hanno un impatto significativo sui risultati. Pertanto, è fondamentale una misurazione accurata di VV e RV durante gli studi urodinamici terminali nei topi⁹. Attualmente, mancano dettagli nelle metodologie fornite nella letteratura pubblicata su come misurare accuratamente il volume delle urine nei modelli murini.

L'adesivo cianoacrilato è un tipo di colla comunemente utilizzata nelle procedure chirurgiche in modelli umani e animali grazie alle sue proprietà di adesione rapide ed efficaci 10,11,12. Questo adesivo è particolarmente utile per la chiusura di ferite e lacerazioni, poiché forma un legame forte e flessibile quando viene applicato sulla pelle¹³. Inoltre, può essere un'ottima barriera contro l'urina e l'umidità che possono entrare in contatto con il pelo e le ferite¹¹.

In questo articolo, abbiamo sviluppato una tecnica nuova ed economica che utilizza l'adesivo cianoacrilato per ottenere risultati precisi nella cistometria e nelle registrazioni EUS-EMG nei topi svegli. Questo metodo sarà utile per comprendere le cause alla base della disfunzione della vescica e ideare trattamenti più efficaci per i disturbi della LUT.

Il protocollo di studio sugli animali è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Indiana University School of Medicine. Codice di omologazione: 21098MD/R/MSS/HZ Data di omologazione: 29 settembre 2021.

1. Preparazione del catetere

1. Taglia un tubo di polietilene PE-30 da 30 cm (.017 pollici x .030 pollici). Usa un accendino per svasare un'estremità del tubo, assicurandoti che non tocchi la fiamma, e ritira l'accendino una volta che il tubo ha formato una punta a forma di campana adeguatamente rotonda.
2. Inserire con cautela circa 3/4 dell'ago da 25 G nell'altra estremità del tubo. Preparare una siringa da 1 ml e riempirla con NaCl sterile allo 0,9%. Collegare la siringa all'ago da 25 G.
3. Infondere delicatamente soluzione salina per verificare che la punta rotonda sia corretta e che non vi siano perdite dalle estremità dell'ago. Assicurarsi che non si avverta alcuna pressione e che la soluzione salina scorra senza intoppi attraverso il catetere.

2. Preparazione degli elettrodi

1. Preparare 2 fili d'acciaio di 20 cm di lunghezza. Prendi i fili di acciaio e applica la lucidante a sabbia su entrambe le estremità della zona di rivestimento per spellare 5 mm del filo.
2. Prendi un ago da 25G e inseriscilo su un lato del filo. Assicurati di inserire l'ago con attenzione per evitare di danneggiare il filo. Piega la parte spelata del filo come un gancio. Il gancio aiuterà a collegare il filo al muscolo EUS.
3. Utilizzare la saldatura per fissare il pin all'altra estremità del filo a strisce. La saldatura aiuterà a fissare il pin al filo e garantirà una connessione forte. Assicurati di riscaldare la saldatura stagno-piombo fino a quando non si scioglie e copre il filo e il perno.

3. Preparazione dell'animale

1. Allestire la femmina di topo C57BL/6 (8 settimane di età, 18-20 g di peso corporeo) nella struttura per animali secondo Institutional Animal Care con un ciclo luce-buio di 12 ore e accesso illimitato all'acqua e ai pellet alimentari standard.

4. Anestesia durante l'intervento chirurgico

1. Mettere gli animali in una camera di isoflurano al 2% e ossigeno puro (1 L/min). Confermare l'anestesia completa dell'animale utilizzando l'esame negativo del pizzicamento delle dita dei piedi prima di trasferirlo nella maschera. Una volta confermato, cambia la condizione del gas con una maschera.
2. Assicurarsi che la maschera per anestesia sia fissata nella posizione appropriata sul campo chirurgico sterile. Posizionare l'animale supino sul telo sterile con il naso in una piccola maschera per inalazione (0,8-1 L/min con isoflurano al 2%) per continuare a somministrare l'anestesia.

5. Preparazione chirurgica

1. Fissa gli arti dell'animale con del nastro adesivo. Usa un rasoio elettrico per radere il pelo del basso addome e intorno al meato uretrale (regione genitale).
2. Applicare un unguento per gli occhi per prevenire qualsiasi potenziale secchezza degli occhi. Preparare l'area rasata utilizzando la soluzione di iodio povidone e rimuovere la soluzione con etanolo al 70%. Metti un telo sterile sulla regione chirurgica.

6. Procedura chirurgica

1. Impianto di catetere vescicale
   1. Al microscopio operatorio, utilizzando le forbici dritte e smussate di Metzenbaum, creare un'incisione di 1-2 cm nella linea mediana della pelle addominopelvica. Procedere all'incisione della fascia e dei muscoli della linea mediana per esporre la vescica attraverso la ferita incisionale.
   2. Una volta che la vescica è visibile attraverso la ferita incisionale, procedere a ritrarre eventuali organi o tessuti circostanti secondo necessità per ottenere una visione chiara del campo chirurgico. Fare attenzione a evitare qualsiasi manipolazione o tensione non necessaria sulla vescica, in quanto ciò può portare a complicazioni come perdite urinarie o lesioni alle strutture circostanti.
   3. Afferrare la cupola della vescica e posizionare un cordino della borsa utilizzando una sutura monofilamento 5-0 non assorbibile con un ago a punta conica.
   4. Usando le micro forbici, crea una piccola cistostomia all'interno del cordone della borsa e fai un buco fino a quando l'urina non fuoriesce.
   5. Afferrare l'estremità della punta rotonda del catetere e inserirla attraverso il foro. Una volta che la punta del tubo è passata attraverso il foro, sutura il cordino della borsa attorno al tubo. Quindi, tirare delicatamente il tubo verso l'esterno fino a quando la punta non si sente sotto la sutura.
   6. Infondere lentamente 1 mL di soluzione fisiologica dall'altra estremità della provetta per distendere la vescica. Verificare la presenza di eventuali perdite intorno al catetere. Se sono presenti perdite, posizionare una sutura aggiuntiva.
   7. Una volta che la soluzione salina esce dall'uretra, ritira la soluzione salina per decomprimere la vescica.
2. Impianto di elettrodi EUS (Figura 1)
   1. Utilizzare le forbici chirurgiche per estendere l'incisione addominale fino al pavimento pelvico.
   2. In linea con la vescica, spostare i muscoli e le membrane verso i canali pudendo e localizzare l'uretra e il muscolo sfintere esterno. Fare attenzione a non ferire i vasi iliaci e caudali medi e i nervi pudendo.
   3. Perforare la pelle bilateralmente, a 1 cm di distanza dal meato uretrale, utilizzando l'ago contenente l'elettrodo.
   4. Afferra con cautela la punta dell'uncino con una pinza e allontana delicatamente l'ago dalla pelle.
   5. Usando la punta dell'elettrodo, agganciare con cura il muscolo EUS bilateralmente. Evita di dare pugni troppo profondi, in quanto ciò potrebbe danneggiare il muscolo, il che potrebbe portare a possibili perdite di urina.
   6. Utilizzare il monofilamento non assorbibile 3-0 per suturare i muscoli pelvici e addominali e la pelle.
3. Impermeabilizzazione della pelle
   1. Applicare uno strato sottile di colla cianoacrilica sulla pelle dove escono gli elettrodi per fissare gli elettrodi in posizione.
   2. Applicare la colla cianoacrilica a 1 cm di distanza che circonda il meato uretrale e a 3 cm che si estende ulteriormente fino all'addome e alla regione suturata. Per evitare il contatto con la colla, tenere accuratamente sollevato il meato con una pinza.
   3. Utilizzare una micropipetta da 0,5-10 μl per prelevare il liquido acceleratore e asciugare la colla.
      ATTENZIONE: Il liquido acceleratore è un liquido combustibile.
   4. Aggiungere il liquido acceleratore per garantire una corretta reazione adesiva. Ciò contribuirà ad asciugare la colla più rapidamente e ad assicurarsi che si fissi in modo sicuro.
4. Preparazione urodinamica
   1. Preparare una barca per pesare in polistirene rovesciato di 4,5 cm di lunghezza, larghezza e profondità. Taglialo a forma di triangolo con una base di 4 cm per inserire il meato dell'uretra del topo in questo spazio. Mettere lo stampo di base monouso, 37 mm x 24 mm x 5 mm, sotto lo spazio per la raccolta dell'urina.
   2. Riposizionare il mouse in posizione prona e spostarlo con cautela su una piastra su misura dotata di maschera antigas.
   3. Assicurarsi che il meato uretrale sia posizionato correttamente all'interno del solco. Trattenere delicatamente la testa e l'arto del mouse con del nastro adesivo e posizionare la piastra su un termoforo fino a quando il mouse non riprende piena coscienza (Figura 2).
   4. Eseguire la cistometria solo quando il topo è completamente sveglio, ovvero almeno 40 minuti dopo il recupero dall'anestesia.

7. Preparazione della cistometria e della registrazione EUS-EMG

1. Installare e calibrare la pompa di infusione secondo le istruzioni del produttore.
2. Prendere una siringa da 20 mL con un diametro di 19,05 mm e riempirla con NaCl sterile allo 0,9% a temperatura ambiente. Fissare la siringa alla pompa di infusione. Impostare la velocità di infusione su 0,01 ml/min.
3. Collegare la siringa tramite il tubo PE-30 a un lato del connettore a tre vie. Collegare il catetere vescicale all'altro lato a un trasduttore di pressione. Prima di collegare il catetere vescicale, assicurarsi di rimuovere tutte le bolle d'aria.
4. Fissare il trasduttore di pressione allo stesso livello della vescica del topo. Il trasduttore di pressione è collegato tramite un amplificatore al sistema di acquisizione dati.
5. Collegare un gancio della linea di messa a terra alla pelle e l'altro ai siti del connettore dell'elettrodo. Registrare la pressione nel software.
6. Dopo aver avviato il software, controllare la pressione intravescicale (IVP) e i segnali EUS-EMG. Salva il nome del campione e imposta l'ora.
7. Avviare l'infusione con pompa. Registra i segnali.

Per analizzare i dati sono stati utilizzati la cistometria e i tracciati dell'attività EUS-EMG. Il metodo della cistometria continua prevede l'infusione di soluzione salina nella vescica e la misurazione simultanea delle variazioni di pressione e volume nella vescica. Per misurare la VV, sono stati infusi 0,4 ml di soluzione fisiologica a una velocità di 0,01 ml/min e l'urina è stata raccolta per oltre 40 minuti in un tappo. Il residuo post-minzionale (PVR) può essere ottenuto aspirando la soluzione fisiologica attraverso il catetere. Nei topi normali senza colla, la somma di VV e RV era spesso inferiore a 0,4 mL. Dopo l'esperimento, il pelo nell'addome e che circonda il meato era bagnato a causa dell'assorbimento di urina (Figura 3A). Dopo aver applicato un sottile strato di colla per coprire piccoli peli, la somma di VV e RV è risultata essere di 0,4 mL e non c'era area bagnata (Figura 3B, C).

I tracciati cistometrici risultanti hanno fornito un'analisi dettagliata di vari parametri, tra cui la pressione massima di contrazione della vescica svuotante (27,2 cmH₂O), la durata della contrazione (16,26 s) e l'intervallo tra le contrazioni (4,48 min). Allo stesso tempo, abbiamo avuto una buona registrazione della pressione intravescicale e dei segnali EUS-EMG nei topi, come mostrato nella Figura 4.

Molte misurazioni urodinamiche sui topi vengono eseguite in anestesia¹⁴. Sebbene questo possa sembrare un metodo conveniente per ridurre il rumore dei segnali elettrici e la perdita di urina derivante dal movimento dell'animale, è essenziale considerare che i farmaci anestetici possono influenzare il flusso urinario, il che può portare a risultati imprecisi o inaffidabili¹⁵. Pertanto, la registrazione urodinamica negli animali svegli è più popolare per ottenere risultati più vicini alla condizione fisiologica. La registrazione urodinamica negli animali svegli di solito inizia dopo un periodo di recupero di 40-50 minuti dall'isoflurano¹⁶. Questo processo prevede un attento monitoraggio dei topi per assicurarsi che siano rilassati e a proprio agio senza bisogno di anestesia. È stato osservato attraverso diversi esperimenti che il movimento di un topo cosciente può influenzare i segnali urodinamici ^5,14, portando a misurazioni imprecise di parametri specifici come la pressione del punto di perdita, VV e VE¹⁷. Di conseguenza, abbiamo implementato un metodo trattenendo parzialmente i topi coscienti per garantire risultati urodinamici più affidabili. Tuttavia, anche con una moderazione limitata, i topi coscienti fanno ancora fatica quando si svegliano immediatamente dall'anestesia, il che può anche causare il distacco o il contatto instabile tra il gancio dell'elettrodo e l'EUS e creare un rumore significativo nei segnali EUS-EMG. Come mostrato nella Figura 3B, per ridurre al minimo questi artefatti, abbiamo adottato l'approccio di fissare gli elettrodi con la colla nel punto di uscita dalla pelle. Questo metodo si è dimostrato efficace nel ridurre al minimo il movimento degli elettrodi e i successivi artefatti che possono produrre.

Figura 1: Spostamento degli elettrodi dell'elettromiografia. Impianto di elettrodi (asterisco giallo) bilateralmente al muscolo uretrale esterno (EUS; frecce nere). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Trattenuta del topo sveglio. Dopo l'impianto del catetere e degli elettrodi, il topo è stato trattenuto sulla piastra per garantire stabilità durante la registrazione urodinamica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Regioni addominali e meato dopo registrazione urodinamica. (A) È stata osservata un'ampia area umida (contornata da una linea tratteggiata rossa) nell'addome e nelle regioni genitali. (B) Le aree addominali e genitali asciutte e impermeabili sono state create con colla cianoacrilica (contornata da una linea tratteggiata rossa) dopo la registrazione. (C) Una goccia di urina (freccia gialla) si è formata sul meato durante la registrazione urodinamica ed è rimasta sotto forma di goccia per lungo tempo senza essere assorbita dalla pelle e dal pelo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Tracce rappresentative di cistometria ed elettromiografia dello sfintere uretrale esterno (EUS-EMG) in un topo femmina sveglia e trattenuta. (A) Traccia A: Registrazioni simultanee di cistometrogramma continuo (CMG) e EUS-EMG (tracce superiore e inferiore, rispettivamente). (B) La traccia B è la porzione espansa della traccia A, indicata da un riquadro rettangolare con scale temporali diverse. Durante la fase di svuotamento, lo svuotamento intermittente ha coinciso con riduzioni della pressione intravescicale nella registrazione CMG (traccia superiore; frecce), che si sono verificate durante i periodi di bassa tonica e riduzione dell'attività EUS-EMG (traccia inferiore; frecce). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Questa tecnica urodinamica descrive una procedura migliorata per misurare il volume delle urine e il segnale EUS-EMG in topi svegli e trattenuti. La presenza di pelo intorno al meato uretrale e all'area addominale può interferire con l'accuratezza della misurazione VV assorbendo l'urina. Sebbene la pelliccia che circonda il meato uretrale e l'addome fosse stata accuratamente rasata prima dell'intervento chirurgico, le piccole pellicce rimanenti all'interno di queste aree e la pelle assorbivano ancora l'urina, lasciando di solito un'area bagnata nell'addome dopo la registrazione. Questo problema è particolarmente evidente nelle femmine di roditore a causa della distanza estremamente breve tra il meato uretrale e la pelle circostante¹⁸. In questa tecnica, la colla cianoacrilica è stata applicata sulla pelle addominale e uretrale circostante per creare una superficie cutanea impermeabile e fornire una valutazione precisa del volume urinario durante la registrazione urodinamica, consentendo una migliore comprensione della funzione della vescica. La colla veniva applicata con precisione, assicurandosi che coprisse la pelle circostante il meato e nelle vicinanze. Lo scopo dell'applicazione della colla era quello di creare una barriera impermeabile che impedisse alle pellicce di assorbire l'urina. La colla è stata stesa in modo uniforme, con attenzione per evitare la formazione di grumi o l'ostruzione del meato uretrale. I risultati registrati della procedura hanno confermato che il nostro obiettivo era stato completamente raggiunto, poiché la somma di VV e RV è rimasta costante al volume di infusione e non sono state osservate ulteriori aree umide. Per garantire l'accuratezza delle misurazioni, abbiamo controllato la vescica dopo l'esperimento ed è risultata vuota. Questo ulteriore passaggio di controllo della vescica è fondamentale in quanto elimina ogni possibilità di ritenzione urinaria, causando una discrepanza tra la quantità che abbiamo prelevato attraverso una siringa e la quantità effettiva di RV.

Questo metodo ha dei limiti: 1) non è adatto per studi longitudinali e a più punti temporali. 2) Non può essere applicato a un mouse che si muove liberamente. 3) se si verifica il distacco degli elettrodi dall'EUS, è difficile aprire l'addome e reinstallarli. 4) Sebbene gli adesivi cianoacrilati siano uno strumento prezioso in molti ambienti chirurgici grazie alla loro facilità d'uso ed efficacia, è importante utilizzarli con cautela e seguire protocolli di sicurezza adeguati per ridurre al minimo i potenziali rischi. Il cianoacrilato è generalmente sicuro per la pelle, ma il contatto frequente con esso dovrebbe essere evitato e i ricercatori dovrebbero adottare adeguate misure di protezione personale. Gli adesivi cianoacrilati possono rilasciare vapori tossici se inalati. Per ridurre al minimo il rischio di inalazione di questi vapori, i ricercatori dovrebbero mantenere livelli più elevati di umidità e ottimizzare la ventilazione della stanza nell'ambiente di lavoro¹⁹. Possono essere utilizzati anche speciali filtri per l'aria condizionata per ridurre ulteriormente la tossicità dei vapori.

Nel complesso, questo esperimento ha fornito importanti informazioni sull'accuratezza della misurazione delle urine svuotate durante la registrazione urodinamica e ha contribuito a identificare potenziali fonti di errore che avrebbero potuto portare a discrepanze nella quantità totale di VV e RV dopo l'infusione.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo studio è stato supportato da NIH-NINDS (R21NS130241), IND DEPT HLTH (55051, 74247, 74244) e US ARMY (HT94252310700).