Chirurgia di impianto per la stimolazione e la registrazione del nervo vago addominale nei ratti svegli

Il presente protocollo descrive la tecnica chirurgica per l'impianto di un array di elettrodi sul nervo vago addominale nei ratti, insieme ai metodi per i test di elettrofisiologia cronica e la stimolazione utilizzando il dispositivo impiantato.

La stimolazione del nervo vago addominale (VNS) può essere applicata al ramo subdiaframmatico del nervo vago dei ratti. Grazie alla sua posizione anatomica, non ha effetti respiratori e cardiaci fuori bersaglio comunemente associati alla VNS cervicale. L'assenza di effetti respiratori e cardiaci fuori bersaglio significa che l'intensità della stimolazione non deve essere abbassata per ridurre gli effetti collaterali comunemente sperimentati durante la VNS cervicale. Pochi studi recenti dimostrano gli effetti antinfiammatori della VNS addominale in modelli di ratto di malattia infiammatoria intestinale, artrite reumatoide e riduzione della glicemia in un modello di ratto di diabete di tipo 2. Rat è un ottimo modello per esplorare il potenziale di questa tecnologia a causa dell'anatomia ben consolidata del nervo vago, delle grandi dimensioni del nervo che consente una facile manipolazione e della disponibilità di molti modelli di malattia. Qui descriviamo i metodi per la pulizia e la sterilizzazione dell'array di elettrodi VNS addominali e il protocollo chirurgico nei ratti. Descriviamo anche la tecnologia necessaria per la conferma della stimolazione soprasoglia registrando i potenziali d'azione composti evocati. La VNS addominale ha il potenziale per offrire un trattamento selettivo ed efficace per una varietà di condizioni, comprese le malattie infiammatorie, e si prevede che l'applicazione si espanderà in modo simile alla VNS cervicale.

La stimolazione del nervo vago (VNS) erogata nel sito cervicale del collo è un trattamento approvato dalla Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti per l'epilessia refrattaria, la depressione refrattaria e la riabilitazione post-ischemica^{dell'ictus 1} e approvato dalla Commissione Europea per l'insufficienza cardiaca in Europa². La VNS cervicale non invasiva è approvata dalla FDA per l'emicrania e il mal di testa¹. Si prevede che la sua applicazione si espanderà, con recenti studi clinici che mostrano l'efficacia del VNS in altre indicazioni come il morbo di Crohn³, l'artrite reumatoide ^4,5 e la ridotta tolleranza al glucosio e il diabete di tipo 2 ^6,7. Sebbene promettente, la VNS cervicale può causare bradicardia e apnea a causa dell'attivazione fuori bersaglio delle fibre nervose che innervano i polmoni e il cuore ^8,9,10. Effetti indesiderati come tosse, dolore, alterazione della voce, mal di testa e aumento dell'indice di apnea-ipopnea sono comunemente riportati nei pazienti trattati con VNS^{cervicale 11,12}. La riduzione della forza di stimolazione è una strategia comune per ridurre questi effetti collaterali, tuttavia la riduzione della carica può limitare l'efficacia della terapia con VNS non riuscendo ad attivare le fibre terapeutiche¹¹. A sostegno di questa ipotesi, il tasso di risposta dei pazienti che hanno ricevuto stimolazione ad alta intensità per il trattamento dell'epilessia è stato superiore a quello dei pazienti che hanno ricevuto stimolazione a bassa intensit๳.

La VNS addominale viene applicata sul nervo vago sottodiaframmatico, sopra i rami epatico e celiaco¹⁴ (Figura 1). Il nostro studio precedente ha dimostrato che nei ratti la VNS addominale non causa effetti collaterali cardiaci o respiratori associati alla VNS^{cervicale 10}. Studi precedenti dimostrano anche gli effetti antinfiammatori della VNS addominale in un modello di ratto di malattia infiammatoria intestinale e artrite reumatoide^10,15, nonché la riduzione della glicemia in un modello di ratto di diabete di tipo 2¹⁶. Recentemente, la tecnologia VNS addominale è stata tradotta per un primo studio clinico sull'uomo per il trattamento della malattia infiammatoria intestinale (NCT05469607).

L'array di elettrodi nervosi periferici utilizzato per fornire la stimolazione al nervo vago addominale (WO2019095020¹⁷) è stato sviluppato su misura per l'uso nei ratti e comprende da due a tre coppie di elettrodi di platino posizionati a 4,7 mm di distanza, supportati da una cuffia in elastomero siliconico di grado medico, una linguetta di sutura per ancorare l'array all'esofago, un filo conduttore e un connettore percutaneo da montare sulla regione lombare (Figura 2). Il filo di piombo è incanalato sotto la pelle sul lato sinistro dell'animale. Il design a coppie di elettrodi multipli consente la stimolazione elettrica del nervo e la registrazione dei potenziali d'azione composti evocati elettricamente (ECAP), che confermano il corretto posizionamento dell'impianto sul nervo e le intensità di stimolazione soprasoglia. La VNS addominale è ben tollerata nei ratti che si muovono liberamente per mesi 10,15,16. Ciò consente di valutare la sua efficacia su modelli di malattia.

Questo manoscritto descrive i metodi per la sterilizzazione dell'array di elettrodi, la chirurgia di impianto del nervo vago addominale e la stimolazione cronica e la registrazione di ECAP nei ratti svegli per studiare l'efficacia della VNS addominale in una varietà di modelli di malattia. Questi metodi sono stati originariamente sviluppati per studiare l'efficacia della VNS addominale nel modello di ratto di malattia infiammatoria intestinale¹⁰ e sono stati utilizzati con successo anche per un modello di ratto di artrite reumatoide¹⁵ e diabete¹⁶.

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state approvate dal Comitato Etico per gli Animali del St. Vincent's Hospital (Melbourne) e sono conformi al Codice australiano per la cura e l'uso degli animali a fini scientifici (National Health and Medical Research Council of Australia) e alla legge sulla prevenzione della crudeltà verso gli animali (1986). In totale, per questo studio sono state utilizzate 24 femmine di ratti Dark Agouti (8-9 settimane di età). I gruppi sperimentali consistevano in: una coorte normale (n = 8) che non ha ricevuto alcuna iniezione di collagene o impianto VNS; una coorte di malattia non stimolata (n = 8) che ha ricevuto un impianto e un'iniezione di collagene (nessun test elettrofisiologico condotto); e una coorte di malattia stimolata (n = 8) che ha ricevuto un impianto, un'iniezione di collagene, test elettrofisiologici e terapia VNS. L'intervento chirurgico di impianto si è verificato 5 giorni prima dell'iniezione di collagene e l'assuefazione alla terapia con VNS è iniziata 4 giorni dopo l'iniezione di collagene e si è verificata nell'arco di 7 giorni. La terapia VNS è stata applicata dal giorno 11 al giorno 17 (compreso) dopo l'iniezione di collagene¹⁵. Per la coorte di malattia stimolata, il test elettrofisiologico è stato eseguito immediatamente dopo l'intervento chirurgico di impianto in anestesia, il giorno dell'iniezione di collagene, 10 giorni dopo l'iniezione di collagene e il giorno della cessazione (17 giorni dopo l'iniezione di collagene).

1. Sonicazione e sterilizzazione dell'array di elettrodi

1. Impostare il pulitore ad ultrasuoni su una frequenza di 80 kHz e riempire il serbatoio ad ultrasuoni con acqua di rubinetto. Immergere l'array di elettrodi nella soluzione detergente in un contenitore di plastica pulito e posizionarlo nella vasca a ultrasuoni.
   NOTA: La soluzione detergente e il tempo di sonicazione da utilizzare per ogni fase sono riepilogati nella Tabella 1. Utilizzare un contenitore pulito per ogni passaggio.
2. Posizionare l'array di elettrodi sonicati in un sacchetto di sterilizzazione utilizzando una pinza pulita sonicata con soluzione detergente liquida allo 0,5% in acqua distillata e risciacquata in acqua distillata. Autoclavare l'array di elettrodi per 45 minuti con una temperatura massima di 130 °C e lasciarlo asciugare su un banco pulito.

2. Impianto di una serie di elettrodi sul nervo vago addominale

NOTA: In questo studio sono state utilizzate femmine di ratti agouti scuri (8-9 settimane di età)¹⁵. Abbiamo anche utilizzato con successo questo protocollo per impiantare cronicamente ratti maschi adulti di Sprague-Dawley (10-14 settimane di età)^10,16. L'intervento chirurgico viene condotto in condizioni asettiche e tutti gli strumenti, l'array di elettrodi e i materiali di consumo come garze e cotton tip sono sterilizzati in autoclave.

1. Anestetizzare il ratto in una camera di induzione utilizzando isoflurano al 3% e 1 L/min di ossigeno. Una volta che non c'è alcun riflesso del pedale al pizzicamento delle dita dei piedi, sposta il ratto sul tappetino riscaldante con un termostato sul tavolo operatorio e posiziona una maschera di isoflurano sul naso.
2. Monitorare la frequenza respiratoria e la temperatura rettale durante l'intervento chirurgico e regolare il livello di isoflurano tra l'1,5% e il 2,5% per mantenere la frequenza respiratoria tra 40 e 62 respiri al minuto. Se necessario, regolare l'impostazione del tappetino riscaldante per mantenere l'intervallo di temperatura rettale compreso tra 35,9 e 37,5 °C.
3. Somministrare analgesia pre-medicazione per via sottocutanea utilizzando siringhe da 1 mL con aghi da 25G (carprofene 5 mg/kg e buprenorfina 0,03 mg/kg per via sottocutanea) prima dell'inizio dell'intervento.
4. Radersi generosamente intorno al sito di incisione, compresa l'area lungo la linea mediana ventrale dal processo xifoideo alla fine della gabbia toracica, l'aspetto lombare della schiena lungo la linea mediana dorsale e il lato sinistro del corpo tra l'arto anteriore e l'arto posteriore per consentire il tunneling sottocutaneo dell'array.
5. Pulire i siti chirurgici con un movimento circolare per tre volte con cicli alternati di betadine e alcol e posizionare un telo chirurgico sull'animale. Somministrare bupivacaina (1-2 mg/kg) per via sottocutanea utilizzando una siringa da 1 ml con un ago da 25 G nei siti di incisione dorsale e ventrale.
6. Posizionare l'animale in decubito ventrale e praticare un'incisione lunga 2 cm sul dorso dove verrà ancorato il piedistallo percutaneo utilizzando una lama di bisturi.
7. Ruotare il ratto in decubito dorsale e praticare un'incisione di 3 cm sulla pelle lungo la linea mediana appena sotto il processo xifoide utilizzando una lama di bisturi. Tieni la pelle vicino al sito dell'incisione e, usando le forbici da dissezione, seziona con un blunt lo strato di pelle dallo strato muscolare intorno all'incisione.
8. Per consentire il tunneling sottocutaneo dell'array dal piedistallo al sito di impianto, posizionare l'animale sul lato destro, inserire un emostatico dall'incisione ventrale e sezionare smussato verso il sito dell'incisione dorsale. Tagliare il bordo di un cappuccio dell'ago e inserire l'array di elettrodi per proteggerlo durante il trasporto (Figura 1B). Usando le mani (indossare guanti sterili), scavare l'array di elettrodi sotto la pelle verso l'incisione ventrale.
9. Per accedere all'esofago e al nervo vago, adagiare nuovamente l'animale in decubito dorsale. Praticare un'incisione di 3 cm sullo strato muscolare lungo la linea mediana sotto il processo xifoideo, abbastanza grande da esporre l'intera lunghezza del fegato. Evita di danneggiare il fegato durante questa fase.
10. Praticare un'incisione più piccola (meno di 1 cm) sullo strato muscolare lateralmente (il lato sinistro dell'animale) all'incisione ventrale principale. Scavare un tunnel attraverso l'array di elettrodi attraverso questa piccola incisione utilizzando il cappuccio dell'ago utilizzato nel passaggio 2.8 per inserire l'array nella cavità addominale.
    NOTA: Questo passaggio riduce la tensione applicata al sito di incisione principale e riduce il rischio di scoppio dei punti di sutura.
11. Ritrarre gli strati cutanei e muscolari per mantenere aperta la cavità addominale. Assicurarsi di mantenere i fazzoletti umidi utilizzando punte di cotone e garze imbevute di soluzione fisiologica sterile per maneggiare il tessuto.
12. Ritrarre delicatamente il fegato tagliando il tessuto connettivo intorno ad esso usando le forbici Vannas e posizionando un divaricatore su un piccolo pezzo di garza imbevuto di soluzione fisiologica per protezione. Ritrarre delicatamente lo stomaco, per consentire il raddrizzamento dell'esofago e del nervo vago sovrastante, posizionando un divaricatore tra l'esofago e lo stomaco.
    NOTA: I divaricatori sono realizzati arrotondando l'estremità appuntita degli ami da pesca.
13. Dopo l'esposizione della superficie ventrale dell'esofago, identificare il nervo vago addominale e i suoi sottorami, tra cui il nervo epatico, il nervo celiaco e due rami gastrici (Figura 1D).
14. Tagliare il tessuto connettivo che fissa il nervo vago addominale all'esofago usando una pinza fine e forbici Vannas e sezionare la lunghezza del nervo da appena sopra i rami epatico e celiaco verso il diaframma. Assicurati di non strappare, allungare o pizzicare il nervo. Posizionare un array di elettrodi accanto al nervo per confermare che la lunghezza sufficiente del nervo sia separata dal tessuto connettivo per adattarsi all'array.
15. Una volta che il tessuto connettivo è stato liberato intorno al nervo, passare le suture di seta (7-0) sul lato dell'elettrodo della cuffia dell'array sotto il nervo. Aprire la cuffia dell'array e posizionare con cautela il nervo nel canale dell'array.
16. Assicurarsi che l'intera lunghezza del nervo si trovi all'interno del canale dell'array. Legare insieme i punti di sutura attorno alla cuffia per chiudere saldamente la cuffia per garantire che il nervo non scivoli fuori dal canale. Taglia i punti di sutura.
17. Utilizzando la sutura di seta 7-0, suturare la linguetta dell'array sull'esofago per fissare l'array in posizione ed evitare che si attorcigli. Evitare di danneggiare gli altri rami del nervo vago o di inserire l'ago troppo in profondità nella muscolatura liscia dell'esofago.
18. Rimuovere delicatamente i divaricatori e assicurarsi che tutta la garza sia stata rimossa dalla cavità addominale. Somministrare 1-2 mL di soluzione fisiologica sterile calda utilizzando una siringa da 1 mL nella cavità addominale e riposizionare il fegato nella posizione corretta.
19. Chiudere lo strato muscolare con una sutura di seta 3-0 utilizzando la semplice tecnica della sutura a corsa, facendo nodi quadrati sicuri con almeno 3 lanci ad entrambe le estremità. Punti spaziali ravvicinati (a circa 3 mm di distanza) per prevenire complicazioni come ernia/protrusione del processo xifoide.
20. Utilizzare la sutura per chiudere l'incisione del peritoneo insieme all'incisione dello strato muscolare, per ridurre la possibilità di adesione dei tessuti.
21. Utilizzando un materiale di sutura riassorbibile (Vicryl 4-0), chiudere l'incisione cutanea. Utilizzare una tecnica di sutura interrata come la sutura a materasso verticale interrato in esecuzione o la sutura dermica interrata in esecuzione per impedire all'animale di rimuovere la sutura.
22. Ruotare l'animale in decubito ventrale e, usando le forbici, estendere l'incisione dorsale a 4-5 cm e sezionare ulteriormente tra il muscolo e lo strato cutaneo in modo che la base del connettore percutaneo possa appoggiarsi piatta sullo strato muscolare.
23. Usando la sutura 3-0 in seta, fai da 6 a 8 semplici suture interrotte attorno alla base del connettore per fissarlo allo strato muscolare sottostante. Chiudere l'incisione cutanea con la sutura in seta 3-0, utilizzando la tecnica della sutura a materasso orizzontale, garantendo nodi quadrati sicuri con almeno 3 lanci.
    NOTA: In questa fase, le suture in seta intrecciata sono preferite per la loro maneggevolezza e la loro capacità di creare nodi più sicuri rispetto alle suture monofilamento.
24. Al termine dell'intervento, somministrare la soluzione di Hartmann per via sottocutanea (1 ml/100 g/h). Spegnere l'isoflurano e lasciare che l'animale si riprenda su un tappetino termico mentre scorre l'ossigeno (1,5 L/min). Una volta che il ratto è cosciente e completamente mobile, riportarlo nella sua gabbia di casa, posizionato su un cuscinetto termico, fino a quando non si è completamente ripreso dall'anestesia.
25. Osservare attentamente il recupero dell'animale dall'isoflurano e assicurarsi che l'animale sia in grado di accedere a cibo e bevande. Nei due giorni successivi, somministrare per via sottocutanea analgesia post-chirurgica (carprofene 5 mg/kg, al giorno) per alleviare il dolore. Monitorare l'animale almeno 2 volte al giorno e verificare la presenza di segni di defecazione, qualità del mantello, livello di attività e presenza di eventuali gonfiori o secrezioni dalle ferite chirurgiche.
26. Record di peso dell'animale e, nel raro caso in cui l'animale perda il 10% o più, iniziare un trattamento intensivo. Il trattamento intensivo include la somministrazione sottocutanea di liquidi (soluzione di Hartmann, 2x 10 ml) ogni giorno, fornendo cibo aggiuntivo come verdure fresche e integratore alimentare in gel e posizionando metà della gabbia su un termoforo con un termostato per un calore extra. Aumentare la frequenza del monitoraggio fino a quando l'animale non si riprende. Continuare con la somministrazione di analgesia (carprofene 5 mg/kg, SQ, giornaliero) se necessario sulla base di una scala di Grimace.

3. Test elettrofisiologici

NOTA: La registrazione dei potenziali d'azione composti evocati (ECAP) conferma il posizionamento appropriato dell'array di elettrodi sul nervo vago. Inoltre, la registrazione degli ECAP utilizzando l'array di elettrodi sopra descritto fornisce una probabile conferma dell'attivazione elettrica delle fibre C vagali e della sovrasoglia VNS^10,15.

1. Misurare l'impedenza di terra comune degli elettrodi per valutarne l'integrità e rilevare eventuali circuiti aperti o cortocircuiti dei fili prima di registrare gli ECAP. Gli elettrodi del nervo vago addominale funzionanti in vivo dovrebbero avere valori di impedenza compresi tra 4 e 20 kΩ.
2. Testare gli animali mentre sono anestetizzati cioè subito dopo l'intervento chirurgico o svegli e in movimento liberamente. Eseguire il test da sveglio almeno 2-3 giorni dopo l'intervento chirurgico per consentire alle ferite cutanee chirurgiche di guarire e stabilizzarsi. Raccogliere l'attrezzatura necessaria per i test di impedenza ed elettrofisiologici, tra cui uno stimolatore personalizzato, un dispositivo di acquisizione dati, un amplificatore differenziale isolato e un software di acquisizione e analisi dei dati, come elencato nella tabella dei materiali.
3. Avvolgere l'animale in un asciugamano, se necessario, collegare un cavo al connettore percutaneo posteriore e collegare l'altra estremità del cavo a uno stimolatore. Per testare l'impedenza di terra comune degli elettrodi, applicare impulsi di corrente bifasica (100 μs per fase e corrente di 107 μA) tra l'elettrodo di interesse e tutti gli altri elettrodi sull'array.
4. Misurare la tensione di picco alla fine della prima fase della forma d'onda della tensione (V_totale) e calcolare l'impedenza totale (Z_totale) utilizzando la legge di Ohm (Z = tensione/corrente).
5. Collegare una coppia di elettrodi allo stimolatore e una coppia di elettrodi all'apparecchiatura di registrazione e applicare la stimolazione bipolare per generare ECAP utilizzando l'elettrodo di riferimento dell'impianto VNS posto sotto la pelle come riferimento per la registrazione differenziale degli ECAP. Effettua due serie di registrazioni mediate da un totale di 50 ripetizioni utilizzando il software di acquisizione e analisi dei dati.
6. Utilizzare le seguenti impostazioni per le misurazioni.
   Correnti: da 0 a 2 mA con incrementi di 0,1 mA;
   Larghezza dell'impulso: 25 - 200 μs;
   Gap di interfase: 8 - 50 μs;
   Frequenza di stimolazione: 10 - 30 impulsi/s;
   Frequenza di campionamento: 100 kHz;
   Filtro: passa alto 200 Hz, passa basso 2000 Hz, guadagno di tensione 1 x 10².
7. Utilizzando il software di analisi dei dati, analizzare la risposta ECAP misurando la tensione picco-picco delle forme d'onda all'interno della finestra di analisi (4 - 10 ms dopo lo stimolo, indicato dall'ombreggiatura nella Figura 3A,B). La soglia ECAP è definita come l'intensità minima della corrente di stimolo che produce un'ampiezza di risposta di almeno 0,1 μV_picco-picco in entrambi i set di registrazioni elettrofisiologiche medie. Una risposta valida sarà ripetuta per almeno due livelli di corrente al di sopra della soglia e non sarà presente per almeno due livelli di corrente al di sotto della soglia^10,15.

4. VNS addominale cronica nei ratti svegli

NOTA: La VNS addominale può essere applicata agli animali svegli una volta che la ferita chirurgica intorno al connettore percutaneo è guarita e stabilizzata. Per ridurre qualsiasi risposta allo stress e consentire una migliore raccolta dei dati, gli animali sono abituati all'ambiente di manipolazione e stimolazione dei tester, un'ora al giorno per sette giorni prima dell'intervento chirurgico di impianto e dell'inizio della terapia VNS.

1. Misurare l'impedenza di ciascun elettrodo come descritto al punto 3.4, prima di applicare qualsiasi VNS. Assicurarsi che l'impedenza degli elettrodi stimolanti sia inferiore a 20 kΩ.
2. Collegare un cavo al connettore percutaneo posteriore e collegare l'altra estremità del cavo a uno stimolatore programmato per applicare una stimolazione appropriata (ad es. 27 Hz, 1,6 mA, larghezza di impulso di 200 μs con intervallo di interfase di 50 μs, 30 s ON, 2,5 min off¹⁵) e accendere lo stimolatore.
   NOTA: Sebbene gli animali si addormentino spesso durante la stimolazione se adeguatamente abituati, utilizzare un cavo con materiale esterno protettivo come bobine di acciaio, ove possibile, per evitare che venga masticato.
3. Osservare l'animale all'inizio di ogni sessione di terapia VNS per assicurarsi che non vi siano reazioni avverse come un'eccessiva toelettatura o un improvviso aumento/diminuzione del livello di attività in sincronia con i tempi di stimolazione.
4. Monitorare ogni 30 minuti per verificare la presenza di torsioni o disconnessioni del cavo. Per applicare la VNS in modo cronico (ad esempio, 3 ore al giorno per 7 giorni¹⁵), ripetere i passaggi 4.1-4.3 all'inizio di ogni sessione.
   NOTA: L'uso di un commutatore può ridurre la possibilità che i cavi si attorciglino e potrebbe richiedere un monitoraggio meno frequente.

La registrazione dei potenziali d'azione composti evocati (ECAP, Figura 3A,B) immediatamente dopo l'intervento chirurgico è una tecnica che può essere utilizzata per confermare il corretto posizionamento del nervo all'interno del canale array e che la stimolazione è efficace nell'attivazione del nervo vago.

Nella Figura 3, le femmine di ratto agouti scuro (8-9 settimane di età) sono state impiantate con l'array di elettrodi VNS. Nei ratti selezionati in modo casuale per ricevere la stimolazione terapeutica, gli ECAP sono stati registrati immediatamente dopo l'intervento chirurgico (giorno 0, Figura 3A) e alla fine della sessione di terapia VNS (giorno 23, Figura 3B). La presenza di ECAP (Figura 3B) indicava che l'intensità della stimolazione era al di sopra della soglia neurale e che il nervo era stato attivato con successo. Gli animali nel gruppo di trattamento VNS sono stati esclusi se gli ECAP non sono stati registrati, in quanto non vi era alcuna garanzia che la stimolazione fosse stata erogata con successo¹⁵. La latenza della risposta neurale (Figura 3A,B, indicata dalla freccia verde) può essere utilizzata per valutare quale classe di fibre è stata attivata.

In studi precedenti, abbiamo osservato che la maggior parte delle risposte neurali si verifica in genere tra 4 ms e 10 ms^10,15. Dato che la distanza tra le coppie di stimolazione e registrazione è di 4,7 mm, la velocità di conduzione approssimativa di questa finestra di risposta è di 0,47 - 1,2 m/s, che è coerente con la velocità di conduzione delle fibre C¹⁸.

C'è un aumento della soglia neurale tra il giorno 0 (377 μA, Figura 3A) e il giorno 23 (1335 μA, Figura 3B), che si verifica nel tempo probabilmente a causa di una fibrosi benigna minore che si forma intorno all'interfaccia tessuto-elettrodo^10,15.

La figura 3C ha indicato l'impostazione dei test sperimentali e il posizionamento del connettore posteriore, che è rimasto stabile per tutta la durata del periodo di prova di 3 settimane¹⁵.

Figura 1: Siti per VNS cervicale e VNS addominale. (A) Il VNS cervicale viene applicato sopra i rami del cuore e delle vie aeree, mentre il VNS addominale viene applicato al di sotto di questi rami. (B) L'array di elettrodi viene inserito in un cappuccio dell'ago (con il bordo rimosso) per proteggerlo durante il tunneling sotto la pelle. (C) L'array VNS addominale di ratto viene impiantato e fissato con punti di sutura (D) sopra i rami celiaco ed epatico sotto il diaframma. Abbreviazioni: VN = nervo vago, b. = ramo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Array VNS di ratto. (A) Un array VNS di ratto comprende un connettore percutaneo e un array di elettrodi collegati tramite filo conduttore. (B) Una linguetta vicino all'array di elettrodi può essere suturata all'esofago per aiutare a stabilizzare la posizione dell'array. L'array standard del nervo vago addominale di ratto è dotato di due coppie di elettrodi (E1 ed E2 ed E3 ed E4). Entrambe le coppie di elettrodi possono essere utilizzate sia per la stimolazione che per la registrazione. Il connettore percutaneo è montato sulla regione del legname dell'animale e il filo conduttore è incanalato sotto la pelle sul lato sinistro dell'animale. L'elettrodo di riferimento lungo il filo conduttore viene posizionato sotto la pelle sul lato sinistro dell'animale una volta impiantato l'array di elettrodi. L'array di elettrodi viene impiantato sul nervo vago lungo l'esofago sopra lo stomaco e appena sotto il diaframma. (C) La lunghezza extra del filo di piombo sul lato sinistro dell'animale sotto la pelle fornisce un sollievo dalla trazione. Abbreviazioni: E = elettrodo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Tracce elettrofisiologiche tipiche registrate dal nervo vago addominale durante l'impianto cronico e un ratto che riceve la terapia con VNS. (A) Ogni traccia elettrofisiologica è una media di 25 ripetizioni. I riquadri ombreggiati in verde indicano la latenza tipica della risposta della fibra C nel nervo vago addominale del ratto, compresa tra 4 ms e 10 ms (utilizzando un array di elettrodi con distanza di 4,7 mm tra le coppie di elettrodi stimolanti e registranti, da centro a centro). Gli ECAP sono contrassegnati da frecce verdi. (B) Un ratto che riceve la terapia VNS attraverso il connettore percutaneo sulla schiena nella gabbia domestica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Fasi di sonicazione. La tabella fornisce i dettagli della sonicazione eseguita qui.

Questo metodo di chirurgia implantare VNS addominale e la stimolazione cronica del nervo vago e la registrazione di ECAP sono stati utilizzati con successo e ben tollerati per 5 settimane nei ratti dopo l'impianto 10,15,16. La retrazione dello stomaco, del fegato e dell'intestino per ottenere una buona visione dell'esofago e del nervo vago è uno dei passaggi chiave dell'intervento chirurgico. Una volta che questi organi sono retratti, il nervo vago diventa accessibile. La retrazione dello stomaco rischia di compromettere la respirazione, nel qual caso il divaricatore viene allentato. Inoltre, quando si taglia il tessuto connettivo che circonda l'esofago per accedere al nervo vago, è necessario prestare attenzione per evitare danni al diaframma, che possono portare a un'interruzione della pressione intratoracica, a una grave soppressione respiratoria e alla morte dell'animale durante l'intervento chirurgico. Si raccomanda che il tessuto connettivo che circonda l'esofago sia liberato quanto basta per adattarsi all'array di elettrodi sopra i rami epatico e celiaco.

Le possibili complicanze post-chirurgiche includono l'adesione dei tessuti intorno all'esofago, l'ernia e l'ileo post-operatorio. L'adesione dei tessuti può essere ridotta al minimo con l'applicazione abbondante di soluzione fisiologica sterile nella cavità addominale durante l'intervento chirurgico e prima della chiusura della cavità addominale. La sutura che chiude lo strato peritoneo insieme allo strato muscolare dovrebbe anche aiutare a proteggere gli organi interni e ridurre l'adesione dei tessuti. Poiché il fegato è facilmente contuso e la manipolazione dell'intestino può causare ileo post-operatorio, è importante una manipolazione minima e delicata di questi organi. Infine, in particolare negli animali più pesanti, è fondamentale che i punti di sutura in esecuzione siano posizionati vicini tra loro o che vengano utilizzate suture interrotte quando si chiude la cavità addominale per prevenire l'ernia e la protrusione del processo xifoide.

Come cura post-operatoria standard, gli animali devono essere controllati regolarmente dopo l'intervento chirurgico per verificare la presenza di defecazione, cambiamento di peso, pelo, livello di attività e presenza di gonfiore o secrezione dalle ferite chirurgiche. In rare occasioni, possono verificarsi perdite eccessive, arrossamento e gonfiore intorno alle ferite chirurgiche, suggerendo un'infezione. In tali occasioni, vengono somministrati antibiotici come Baytril (0,2 mg/mL, in acqua potabile per 3-5 giorni) fino a quando l'infezione non si è risolta. Mentre i ratti normali generalmente si riprendono bene dall'intervento chirurgico, i ratti con condizioni di salute compromesse (cioè modelli di malattia) possono richiedere più tempo prima che i test e la stimolazione possano iniziare dopo l'intervento chirurgico. Un'adeguata assistenza post-operatoria (come riassunto nella fase 2.26) per tali animali è essenziale per il benessere degli animali.

Uno dei limiti di questo protocollo è che, mentre il design dell'array di elettrodi VNS di ratto è eccellente per registrare una risposta più lenta della fibra C, la spaziatura tra le coppie di elettrodi (4,7 mm) potrebbe non essere adatta per catturare l'attività di alcuni dei tipi di fibre più veloci. Sebbene la lunghezza totale dell'array sia limitata dalla lunghezza disponibile del nervo vago sottodiaframmatico al di sopra dei rami epatico e celiaco, questi array VNS possono essere acquistati con coppie di elettrodi aggiuntive. Tali array possono essere utilizzati per esplorare l'applicazione della stimolazione bloccante in grado di manipolare la direzione di VNS^16,19, ampliando il possibile uso di questo modello.

La registrazione degli ECAP può essere utilizzata per valutare il posizionamento dell'array attorno al nervo, la qualità dell'interfaccia dell'elettrodo e la capacità del dispositivo di attivare le fibre vagali. Il nervo vago è un nervo autonomo, costituito per il 97%-99% da fibre C^18,20, mentre il restante 1%-3% di fibre è costituito da fibre mieliniche (funzione sconosciuta), come confermato da studi di microscopia elettronica a trasmissione²⁰. Le risposte nella Figura 3 sono probabilmente dovute all'attività evocata elettricamente del nervo vago, piuttosto che all'attività miogenica, in quanto si adattano alla forma e alla forma del potenziale d'azione composto per un nervo periferico^21,22. Inoltre, la velocità di conduzione tipica degli ECAP del nervo vago addominale di ratto è di 0,47 - 1,2 m/s, che è coerente con la velocità di conduzione delle fibre C¹⁸. Negli studi pilota iniziali di sviluppo del dispositivo, le registrazioni sono state convalidate in studi sui ratti anestetizzati tagliando il nervo vago tra l'elettrodo stimolante e quello di registrazione, con conseguente eliminazione di qualsiasi risposta evocata (dati non mostrati). L'array di elettrodi è stato progettato in modo che il nervo vago si trovi all'interno di un canale in platino-silicone, isolandolo efficacemente elettricamente dalle strutture circostanti (ad esempio, l'esofago). Anche la stimolazione e la registrazione vengono eseguite utilizzando configurazioni bipolari che utilizzano elettrodi adiacenti, riducendo ulteriormente le opportunità di diffusione della stimolazione e la contaminazione della registrazione. Abbiamo costantemente riportato forme d'onda simili a seguito della stimolazione elettrica del nervo vago addominale in preparazioni anestetizzate e sveglie 10,15,16,19,23, compresi gli studi in cui gli effetti fisiologici della stimolazione hanno confermato l'attivazione del nervo vagale 10,15,16. Sebbene sia impossibile escludere la contaminazione della registrazione da parte dell'attività miogenica, le risposte miogeniche sono solitamente distinguibili dalla risposta neurale a causa del loro profilo di ampiezza di crescita rapido e grande²⁴ in contrasto con i profili di crescita graduati e più piccoli osservati nei nostri studi^10,15 e nella Figura 3A,B: Giorno 0: livello attuale 377 μA latenza: 7,24 ms > livello di corrente 1750 μA: 6,74 ms.

Mentre l'attivazione del nervo vago sottodiaframmatico, che consiste quasi interamente di fibre C^20,25, si è dimostrata efficace per il trattamento di modelli preclinici di malattia infiammatoria intestinale¹⁰, artrite reumatoide¹⁵ e diabete¹⁶, i parametri VNS addominali ottimali per massimizzare il suo effetto terapeutico non sono stati completamente esplorati¹⁴. Ulteriori ricerche su questo argomento sarebbero di grande utilità, poiché l'applicazione della VNS addominale per il trattamento delle malattie infiammatorie intestinali è attualmente in fase di studio in uno studio clinico per la prima volta sull'uomo. Poiché l'effetto antinfiammatorio della VNS addominale è considerato sistemico²⁶, c'è un grande potenziale che questa terapia sia efficace anche per altre condizioni infiammatorie come il lupus eritematoso sistemico²⁷ e la malattia renale cronica²⁸.

I nostri studi sui ratti dimostrano che la VNS addominale ha un vantaggio unico rispetto alla VNS cervicale in quanto non provoca effetti cardiaci o respiratori fuori bersaglio¹⁰. La stimolazione ad alta intensità può essere applicata per periodi di tempo più lunghi senza compromettere la respirazione o la frequenza cardiaca dell'animale. Abbinato alla capacità di monitorare la risposta neurale evocata confermando l'intensità della stimolazione soprasoglia, questo metodo fornisce un ottimo modello per studiare l'efficacia della VNS addominale per il trattamento di una varietà di malattie. Poiché l'applicazione di VNS continua ad espandersi, si prevede che anche l'applicazione di questo metodo di VNS si espanderà.

Questa ricerca è stata condotta in assenza di relazioni commerciali o finanziarie che possano essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.

Lo sviluppo dell'impianto VNS addominale di ratto è stato finanziato dalla Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) BTO, sotto gli auspici del Dr. Doug Weber e del Dr. Eric Van Gieson attraverso lo Space and Naval Warfare Systems Center (Contratto n. N66001-15-2-4060). La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata supportata dal Bionics Institute Incubation Fund. Il Bionics Institute riconosce il sostegno che ricevono dal governo del Victoria attraverso il suo programma di supporto infrastrutturale operativo. Vorremmo ringraziare il Sig. Owen Burns per la progettazione meccanica, il Prof. John B Furness per l'esperienza anatomica, il Prof. Robert K Shepherd per l'interfaccia periferica, la neuromodulazione e l'esperienza di registrazione, la Sig.ra Philippa Kammerer e la Sig.ra Amy Morley per la zootecnia e i test, la Sig.ra Fenella Muntz e la Dott.ssa Peta Grigsby per i loro consigli sulla cura post-operatoria degli animali, e la Sig.ra Jenny Zhou e il team di fabbricazione degli elettrodi di NeoBionica per la produzione degli array VNS.