Screening della modificazione degli istoni mediante cromatografia liquida, spettrometria di mobilità ionica intrappolata e spettrometria di massa a tempo di volo

Un flusso di lavoro analitico basato sulla cromatografia liquida, sulla spettrometria di mobilità ionica intrappolata e sulla spettrometria di massa a tempo di volo (LC-TIMS-TOF MS/MS) per un'analisi "bottom-up" ad alta affidabilità e altamente riproducibile delle modificazioni istoniche e l'identificazione in base ai parametri principali (tempo di ritenzione [RT], sezione d'urto di collisione [CCS] e rapporto massa-carica [m/z] accurato).

Le proteine istoniche sono molto abbondanti e conservate tra gli eucarioti e svolgono un ruolo importante nella regolazione genica come risultato di strutture note come modificazioni post-traduzionali (PTM). Identificare la posizione e la natura di ogni PTM o pattern di PTM in riferimento a fattori esterni o genetici consente di correlare statisticamente queste informazioni con risposte biologiche come la trascrizione, la replicazione o la riparazione del DNA. Nel presente lavoro, viene descritto un protocollo analitico ad alto rendimento per la rilevazione di PTM istonici da campioni biologici. L'uso della cromatografia liquida complementare, della spettrometria di mobilità ionica intrappolata e della spettrometria di massa a tempo di volo (LC-TIMS-ToF MS/MS) consente la separazione e l'assegnazione PTM delle modifiche biologicamente più rilevanti in un'unica analisi. L'approccio descritto sfrutta i recenti sviluppi nell'acquisizione di dati dipendenti (DDA) utilizzando l'accumulo parallelo nella trappola della mobilità, seguito dalla frammentazione sequenziale e dalla dissociazione indotta dalla collisione. I PTM istonici vengono assegnati con sicurezza in base al tempo di ritenzione, alla mobilità e al modello di frammentazione.

Nelle cellule eucariotiche, il DNA è impacchettato come cromatina in unità funzionali chiamate nucleosomi. Queste unità sono composte da un ottamero di quattro istoni centrali (due ciascuno di H2A, H2B, H3 e H4)1,2,3,4. Gli istoni sono tra le proteine più abbondanti e altamente conservate negli eucarioti, che sono in gran parte responsabili della regolazione genica⁵. Le modificazioni post-traduzionali degli istoni (PTM) svolgono un ruolo importante nella regolazione della dinamica della cromatina e nella gestione di vari processi biologici come la trascrizione, la replicazione e la riparazione del DNA⁶. I PTM si verificano principalmente sulla superficie accessibile delle regioni N-terminali degli istoni che sono in contatto con il DNA ^3,7. Tuttavia, le modificazioni della coda e del core influenzano la struttura della cromatina, alterando le interazioni internucleosomiche e reclutando proteine specifiche ^3,8.

Una sfida attuale durante la proteomica basata sulla cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS) è la potenziale co-eluizione degli analiti di interesse. Nel caso di analisi data-dependent (DDA), ciò si traduce nella potenziale perdita di diversi ioni precursori durante il processo di acquisizione MS/MS⁹. Gli strumenti a tempo di volo (ToF) acquisiscono spettri ad altissima frequenza ^9,10 (fino a decine di kHz)¹¹; questo li rende in grado di scansionare rapidamente gli ioni precursori totali all'interno di un campione complesso (MS1), promettendo così una sensibilità ottimale e velocità di sequenziamento MS/MS (fino a 100 Hz)⁹ e rendendoli ideali per l'analisi di campioni biologici¹⁰. Ciononostante, la sensibilità disponibile a queste elevate velocità di scansione è limitata dalla velocità MS/MS⁹. Per mitigare queste limitazioni è stata utilizzata l'aggiunta della spettrometria di mobilità ionica intrappolata (TIMS) in combinazione con uno spettrometro di massa a tempo di volo (qToF) a quadrupolo ortogonale. In TIMS, tutti gli ioni precursori sono accumulati in tandem ed eluiti in funzione della loro mobilità, piuttosto che selezionare singole masse precursori con un quadrupolo⁹. La frammentazione seriale ad accumulo parallela (PASEF) consente centinaia di eventi MS/MS al secondo senza alcuna perdita di sensibilità⁹.

L'obiettivo principale di questo lavoro è stato quello di mostrare i recenti sviluppi della DDA utilizzando l'accumulo parallelo nella trappola della mobilità seguito dalla frammentazione sequenziale e dalla dissociazione indotta da collisione (CID). I PTM istonici sono stati assegnati con sicurezza in base ai loro tempi di ritenzione (RT), mobilità e modelli di frammentazione.

NOTA: I campioni di istoni sono stati estratti utilizzando un metodo adattato da Bhanu et al. (2020)¹².

1. Preparazione del campione

1. Raccolta di cellule in coltura
   1. Quando le cellule sono confluenti all'80%, assicurarsi che siano vitali utilizzando l'esclusione del blu di tripano.
      NOTA: Per questi esperimenti è stata utilizzata una linea cellulare HeLa S3, ma questo metodo può essere applicato a qualsiasi cellula in coltura.
   2. Aspirare il terreno, quindi applicare 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) su ciascuna piastra.
   3. Agitare la/e piastra/e per risciacquare tutti i residui di fluido, quindi aspirare il PBS e applicare 5 mL di 1x PBS.
   4. Separare delicatamente le cellule dalla piastra raschiandole con un sollevatore cellulare monouso.
   5. Trasferire ciascuna sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL.
   6. Pellettare le cellule centrifugando a 800 x g per 5 min.
   7. Aspirare il PBS dal pellet della cella.
   8. Procedere all'estrazione degli istoni.
      NOTA: Congelare il pellet cellulare in azoto liquido se non può essere lavorato immediatamente. Conservare il pellet a -80 °C fino al momento di procedere.
2. Estrazione di istoni
   1. Stimare il volume di ogni pellet cellulare e contrassegnare il menisco con un pennarello indelebile.
   2. Preparare una quantità sufficiente di tampone di isolamento nucleare (NIB; 15 mM Tris-HCl (pH 7,5), 15 mM NaCl, 60 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂ e 250 mM saccarosio) per tutti i campioni. In alternativa, se è necessario processare molti campioni nel tempo, preparare il tampone alla rinfusa e conservarlo a 2-8 °C per un massimo di 6 mesi, oppure aliquotarlo e congelarlo a una temperatura compresa tra -15 °C e -25 °C a tempo indeterminato scongelando solo la quantità necessaria per ogni estrazione.
      NOTA: Il buffer deve rimanere libero durante la conservazione. Se il tampone assume un aspetto torbido o comunque anomalo in qualsiasi momento, scartare e preparare un tampone nuovo.
   3. Preparare 50 volte il volume dei pellet cellulari del tampone di lavaggio e aggiungere gli inibitori come segue (circa 10 mL di tampone di lavaggio per 2 campioni).
      1. Per preparare 10 mL di tampone di lavaggio, mescolare 10 mL di NIB, 30 μL di 200 mM di cloridrato di fluoruro di 4-(2-amminoetil)benzensulfonile [AEBSF], 10 μL di 1 M ditiotreitolo [DTT], 20 μL di microcistina 5 μM, 20 μL di butirrato di sodio 5 M.
   4. Rimuovere 1/5 del tampone di lavaggio per preparare il tampone di lisi (1/5 del volume dal tampone di lavaggio, alternativa allo 0,3% NP-40 o NP-40).
      NOTA: Non utilizzare Triton-X 100 al posto dell'alternativa NP-40 o NP-40, poiché potrebbe essere troppo abrasivo per alcuni tipi di cellule.
   5. Lavare accuratamente il pellet cellulare sospendendolo in 5 colonne di tampone di lavaggio e centrifugandolo a 800 x g per 5 minuti a 4 °C. Completare questo passaggio due volte, aspirando e scartando il surnatante tra un lavaggio e l'altro.
   6. Assicurarsi che il volume del pellet cellulare sia ancora contrassegnato con un pennarello indelebile. Risospendere in 10 volumi di tampone di lisi.
   7. Pipetta miscelare accuratamente ogni pellet per risospenderlo, quindi incubare per 15 minuti su ghiaccio.
   8. Dopo 15 min, centrifugare a 800 x g per 5 min a 4 °C.
   9. Aspirare ed eliminare il surnatante.
      NOTA: Il pellet deve ridursi a ≤ ¹/₂ della dimensione originale del pellet (come indicato dalla linea di marcatura). Se il pellet non si è ridotto a sufficienza, ripetere la procedura di lisi e includere una delicata fase di omogeneizzazione utilizzando un pestello per rompere le cellule.
   10. Una volta completata la lisi, risospendere il pellet in 500 μL di tampone di lavaggio, quindi centrifugare a 800 x g per 5 minuti a 4 °C. Aspirare ed eliminare il surnatante, quindi ripetere ancora una volta la fase di lavaggio per rimuovere tutte le tracce di NP-40.
       NOTA: A questo punto, il pellet è costituito da cromatina, che contiene istoni.
   11. Risospendere il pellet in 5 volumi (della dimensione originale del pellet della cella) di 0,4 N H₂SO₄.
   12. Incubare per 2 ore in cella frigorifera o in frigorifero utilizzando un agitatore.
   13. Dopo 2 ore, centrifugare il/i campione/i a 3400 x g per 5 minuti a 4 °C. Non gettare il surnatante.
   14. Trasferire il surnatante in nuove provette e aumentare il 100% di acido tricloroacetico (TCA) a 1/3 del volume del contenuto (la concentrazione finale di TCA sarà di circa il 20%).
   15. Capovolgere delicatamente la provetta e osservare che la soluzione limpida e incolore diventa bianca e/o torbida, indicando la precipitazione delle proteine.
       NOTA: Per le soluzioni con basse concentrazioni di istoni, la precipitazione proteica potrebbe non essere immediatamente evidente, ma il precipitato dovrebbe essere visibile dopo l'incubazione notturna.
   16. Incubare senza disturbi per una notte (12-18 ore) a 4 °C per far precipitare completamente le proteine istoniche.
   17. Il giorno seguente, centrifugare a 3400 x g per 5 minuti a 4 °C.
   18. Aspirare il surnatante, facendo attenzione a non toccare i lati della provetta con il puntale della pipetta. In questa fase, gli istoni si depositano principalmente come una pellicola attorno ai lati dei tubi.
   19. Aggiungere 500 μL di acetone ghiacciato + 0,1% di HCl (acetone acido) in ciascuna provetta, utilizzando una pipetta Pasteur in vetro, quindi capovolgere delicatamente la provetta o le provette più volte. Disporre i campioni in ordine (1, 2, 3, ecc.) mentre si esegue questa operazione, poiché qualsiasi acetone errante può rimuovere i segni sulle provette. Centrifugare a 3400 x g per 5 minuti a 4 °C e decantare delicatamente il surnatante.
   20. Ripetere questa fase di risciacquo con 500 μL di acetone ghiacciato al 100%, anche con una pipetta Pasteur in vetro. Centrifugare a 3400 x g per 5 minuti a 4 °C e decantare delicatamente il surnatante.
   21. Lasciare asciugare i tubi aperti a temperatura ambiente fino a quando l'acetone rimanente non sarà evaporato.
   22. Una volta asciutta, aggiungere 100 μL di acqua per spettrometria di massa (MS) a ciascuna provetta. Utilizzare questa gocciolina per tamponare tutti i lati del contenitore per risospendere l'intero film istonico. A tale scopo, pipettare la goccia sul lato della provetta e ruotarla durante il pipettaggio su e giù o erogare metà dei 100 μL e utilizzare la punta per mescolarla tutt'intorno. Una combinazione di entrambi i metodi funziona meglio. Gli istoni sono facilmente solubili in acqua e saranno nella soluzione.
   23. Dopo aver risospeso tutti i campioni, se rimane un solido bianco, sonicare in un bagno a temperatura ambiente per 5 minuti.
   24. Centrifugare a 800 x g per 5 min a 4 °C. Trasferire la soluzione limpida in provette fresche. Scartare il pellet insolubile rimanente.
   25. Eseguire una SDS-PAGE in condizioni di riduzione per verificare che l'estrazione sia pulita.
       NOTA: I gel possono essere utilizzati utilizzando qualsiasi concentrazione appropriata di poliacrilammide, purché sia in grado di differenziare le proteine nell'intervallo 10-20 kDa. Vedere la tabella dei materiali per i gel utilizzati in questo protocollo.
   26. Eseguire un test di concentrazione proteica (ad esempio, Bradford o BCA) per determinare la concentrazione proteica totale.
3. Derivatizzazione chimica (propionilazione) dei residui di lisina
   1. Trasferire 20 μg di istoni (determinati dal test delle proteine) in una provetta pulita. Essiccare il campione fino a <5 μL utilizzando un concentratore sottovuoto, quindi risospendere utilizzando 20 μL di bicarbonato di ammonio 100 mM (NH₄CO₃) (soluzione ~1 μg/μL). Regolare il pH a ~8 utilizzando idrossido di ammonio, se necessario.
      ATTENZIONE: Non utilizzare idrossido di ammonio (NH₄OH) per risospendere, ma solo per regolare il pH se necessario. In caso contrario, le proteine si denaturano e precipitano.
      NOTA: Per controllare il pH con una perdita minima di campione, utilizzare il puntale di una pipetta per immergere il campione e tamponare su una striscia di pH. Questa procedura di analisi sarà utile durante le restanti fasi di preparazione del campione.
   2. Preparare il reagente di propionilazione aggiungendo anidride propionica all'acetonitrile (ACN) in un rapporto 1:3 (v/v) (cioè, per produrre 40 μL di reagente, combinare 10 μL di anidride propionica con 30 μL di ACN).
      NOTA: Tradizionalmente, il metanolo o l'isopropanolo sono stati utilizzati nella preparazione di un reagente di propionilazione. Poiché la propionilazione è una reazione di formazione di ammide, è necessario un solvente non protonico, come l'acetonitrile, per prevenire prodotti collaterali e reazioni indesiderate, come l'estere metilpropionilico, che deriva dall'uso del metanolo. Preparare solo una quantità sufficiente di reagente di propionilazione per un massimo di 4 campioni alla volta, in modo che il reagente rimanga fresco. Utilizzare il reagente entro 1-2 minuti dalla preparazione. Quando il reagente si trova, l'anidride propionica reagirà con qualsiasi umidità ambientale e inizierà a formarsi acido acetico, che può modificare l'efficacia del reagente e cambierà il pH della soluzione istonica una volta aggiunto il reagente.
   3. Aggiungere il reagente di propionilazione a ciascun campione in un rapporto 1:4 (v/v) (cioè, per 20 μL di istoni, aggiungere 5 μL di reagente di propionilazione).
   4. Aggiungere rapidamente NH₄OH 1:5 (v/v) (cioè aggiungere 4 μL per 20 μL della soluzione istonica) per ristabilire il pH della soluzione a ~8. Se il pH è ancora troppo basso, aggiungere 1-2 μL di NH₄OH alla volta fino a raggiungere un pH di 8. In genere, un rapporto 1:5 (v/v) è adeguato.
   5. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 15 minuti senza disturbi.
   6. Ripetere la reazione di propionilazione per non più di 3-4 campioni per lotto di reagente di propionilazione per garantire una formazione di acido minima.
   7. Ripetere le fasi 1.3.2-1.3.5 della procedura di propionilazione. Un secondo ciclo di propionilazione assicura che il >95% delle lisine disponibili sia derivatizzato.
   8. Essiccare i campioni fino a <5 μL utilizzando un concentratore sottovuoto. Questo farà evaporare qualsiasi reagente di propionilazione non reagito, prodotti acidi e gas di ammoniaca rilasciati dall'NH₄OH. Se i campioni si asciugano completamente, va bene, poiché non si verificano perdite significative di campioni.
      NOTA: Spostare l'aria nella bombola di anidride propionica con gas argon prima della conservazione per evitare la formazione di acido acetico a causa del contatto con l'umidità ambientale rimasta nella bottiglia.
4. Digestione proteolitica con tripsina
   1. Risospendere gli istoni in 100 mM NH₄HCO₃ per ottenere un volume di 20 μL, ottenendo una concentrazione ottimale di 1 μg/μL.
      NOTA: Le soluzioni campione con concentrazioni inferiori a 1 μg/μL comporteranno una diminuzione dell'efficienza della tripsina.
   2. Aggiungere tripsina ai campioni istonici in un rapporto 1:10 (wt/wt) (cioè, aggiungere 2 μL di soluzione 1 μg/μL di tripsina a 20 μg di istoni).
   3. Reazioni di incubazione a 37 °C per 6-8 h. In alternativa, incubare per una notte (12-18 h) a temperatura ambiente.
   4. Interrompere la digestione congelando a -80 °C per almeno 1 ora.
      NOTA: Non utilizzare acido per spegnere la reazione di digestione, poiché ciò causerebbe un calo indesiderato del pH a questo punto della procedura. Il campione può essere conservato a -80 °C fino al momento di procedere (punto di arresto intermedio).
5. Derivatizzazione chimica (propionilazione) di N-terminali peptidici
   1. Essiccare i campioni a <5 μL utilizzando un concentratore sottovuoto.
   2. Risospendere i campioni fino a 20 μL (1 μg/μL) utilizzando 100 mM NH₄HCO₃.
   3. Ripetere la propionilazione come prima (passaggio 1.3).
      NOTA: È normale che i campioni impieghino più tempo ad asciugarsi in questa fase a causa di un rapporto acquoso/fase organica più elevato.
6. Dissalazione del campione con punte di fase
   1. Risospendere o diluire i campioni con 50 μL di acqua di grado MS + 0,1% TFA.
   2. Utilizzando un detorsolatore per campioni da 11 G, perforare 5 dischi di materiale C₁₈ da un disco di estrazione in fase solida (perforare tutti e 5 i dischi prima di trasferirli al puntale della pipetta). Inserire e assicurarsi che i dischi siano incastrati in modo sicuro e uniforme sul fondo di un puntale per pipette da 200 μL (Figura 1).
      NOTA: Utilizzare un detorsolatore da 15 G se si esegue la desalinizzazione di oltre 25 μg di campione attraverso una punta a stadio singolo.
   3. Utilizzare un adattatore per centrifuga per tenere in posizione le punte dello stage in provette per microcentrifuga da 1,5 mL o 2 mL.
      NOTA: Per le seguenti fasi di centrifugazione, utilizzare un giro lento (400-500 x g) a 4 °C, per 1-2 minuti alla volta; i solventi normalmente passano attraverso la resina in meno di 1 minuto, a seconda di quanto strettamente il materiale C₁₈ è impacchettato nelle punte.
   4. Risciacquare la resina centrifugando con 50 μL di acetonitrile al 100% per attivare il materiale C₁₈ e rimuovere potenziali contaminanti.
      NOTA: Potrebbe essere più facile caricare le soluzioni sui puntali dello stage utilizzando i puntali per pipette a caricamento di gel. Una volta attivato il materiale C₁₈ , è importante non lasciare che la resina si asciughi per tutta la durata della procedura di dissalazione.
   5. Equilibrare il materiale del disco con 80 μL di acqua di grado MS + 0,1% di TFA mediante centrifugazione.
   6. Acidificare il campione a pH 4 o inferiore utilizzando acido acetico glaciale. Controllare il pH con le strisce pH come prima per ridurre al minimo la perdita di campione.
   7. Caricare l'intero campione sul disco di resina mediante centrifugazione lenta.
   8. Lavare il campione con 80 μL di acqua di grado MS + 0,1% TFA mediante centrifugazione.
   9. Emulsionare il campione in una provetta pulita da 1,5 mL lavando 70 μL di acetonitrile al 75% e acido acetico allo 0,5% mediante centrifugazione lenta. È possibile utilizzare un tempo di centrifugazione aggiuntivo per garantire che l'intero volume del campione venga eluito dalla punta dello stage. Va bene se la resina si asciuga con il tempo di centrifugazione aggiuntivo, poiché non è più necessaria dopo l'eluizione del campione.
   10. Asciugare completamente ogni campione in un concentratore sottovuoto.
       NOTA: I campioni possono essere conservati a -80 °C fino al momento di procedere (punto di arresto intermedio).
   11. Per l'analisi LC-MS/MS, ricostituire i campioni in un volume di solvente A (acido formico allo 0,1%) dal protocollo di cromatografia liquida (LC) che fornisce la concentrazione finale di 0,4 μg/μL (cioè, sciogliere 20 μg di istoni in 50 μL di solvente A).

2. Interfaccia software TIMS

1. Selezionare la scheda Instrument (Strumento ) e passare a Operate (verificare che il nome dello strumento venga evidenziato in verde) (Figura 2).
2. Verificare i parametri TIMS (Figura 2).
3. Verificare le impostazioni MS (inizio e fine scansione, polarità degli ioni, modalità di scansione) (Figura 2).
4. Verificare le impostazioni TIMS (modalità, inizio e fine mobilità, tempo di rampa, tempo di accumulo, ciclo di lavoro, velocità di rampa, velocità MS, media MS e calibrazione automatica) (Figura 2).
5. Andare alla scheda Source (Sorgente ) e attivare l'opzione siringa (Hamilton 500 μL) solo per la fase di calibrazione TuneMix (Figura 3)¹³.
6. Vai alla scheda Calibrazione , fai clic su m/z, seleziona Modalità di calibrazione e scegli la modalità (Q avanzato, in generale), zoom (+0,01%) STD Dev (0,24) e fai clic su Calibra; quando viene raggiunto un punteggio del 100%, accettare (Figura 4).
7. Vai alla scheda mobilità e ripeti il processo di calibrazione (modalità lineare, generalmente), intervallo di rilevamento (+5%), larghezza (0.1 Da), STD Dev (0.1855), quindi fai clic su calibra; quando si ottiene un punteggio ≥ 98,5%, accettare (Figura 5).
8. Vai al metodo e seleziona il metodo da utilizzare; per questo esempio, è stato selezionato Proteomic_/2023-01-19-CF/20230119-Hela Control histone_prep_pasefDIA_1-24_1_451.d/451.m-TimsControl (Figura 5).

3. LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS

1. Utilizzare le tipiche condizioni operative nESI: tensione capillare di 4500 V, offset della piastra terminale di 800 V, pressione del nebulizzatore di 3,0 bar, gas secco di 10,0 L/min, riscaldatore a secco di 200 °C e portata di iniezione di 50 μL/min.
2. Utilizzare le impostazioni tipiche di MS: energia di collisione di 6 eV, RF di collisione di 1200 Vpp, tempo di trasferimento di 75 μs, memorizzazione pre-impulso di 5 μs.
3. Determinare il flusso di gas alla deriva utilizzando la differenza di pressione tra l'imbuto di ingresso P1 e l'imbuto di uscita P2. La frammentazione seriale ad accumulo parallela (PASEF) si verifica nella cella TIMS, accumulando tutti gli ioni precursori contemporaneamente piuttosto che individualmente. Gli ioni precursori vengono quindi rilasciati in picchi ionici stretti rispetto ai picchi normalmente molto più ampi (circa 50 volte più corti), aumentando il rapporto segnale/rumore pur separando i peptidi co-eluiti attraverso la mobilità¹⁴.
4. Sviluppare un metodo LC-TIMS-TOF MS/MS per l'analisi di peptidi istonici proteolitici. Accoppiare un cromatografo liquido ad alte prestazioni (HPLC) dotato di una colonna C₁₈ (300 Å, 5 μm, 4,6 mm x 250 mm) con uno strumento commerciale TIMS-TOF MS con tecnologia proprietaria PASEF.
   NOTA: Questa dimensione della colonna è stata determinata per fornire una buona separazione sia ad alto che a basso pH per le miscele peptidiche, sulla base dei lavori pubblicati in precedenza 15,16,17.
   1. Impostare il volume di iniezione su 20 μL (8 μg) di campione e una portata di 0,4 mL/min.
   2. Eseguire un gradiente LC non lineare di 60 minuti utilizzando acqua con acido formico allo 0,1% (solvente A) e acetonitrile con acido formico allo 0,1% (solvente B). Impostare la pendenza: 10% B per 2,7 min, poi al 20% B in 5,3 min, 28% B in 4 min, 35% B in altri 18 min, al 40% B in 13 min e al 100% B in altri 2 min. Dopo aver mantenuto il 100% B per 5 minuti, abbassare la concentrazione al 10% B in 5 minuti e mantenere la concentrazione per gli ultimi 5 minuti.
5. Verificare l'eluizione del campione dall'HPLC nel TIMS-TOF tramite ionizzazione nano-elettrospray (nESI) in modalità di ionizzazione positiva.

4. Analisi dei dati

1. Identificare le sequenze peptidiche e i siti di modificazione.
   1. Preparare un elenco teorico di peptidi utilizzando ProteinProspector [https://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msdigest] con lo strumento MS-digest.
      1. Eseguire una digestione teorica prendendo in considerazione le condizioni del digerito (enzima utilizzato), i tipi di PTM ricercati (ad esempio, mono-, di- o trimetilazione), l'intervallo di dimensioni dei peptidi ricercati, nonché l'intervallo di rilevamento della massa e il numero potenziale di scissioni mancate.
2. Analizzare manualmente i dati acquisiti in base ai peptidi teorici (Figura 6)¹².
   1. Si cercano le masse a diversi stati di carica (da +1 a +4) per ogni peptide teorico.
   2. Dopo l'identificazione iniziale di ogni m/z, selezionare il picco e confermare il MS/MS utilizzando un elenco teorico di ioni di frammentazione basato sulla sequenza peptidica, compresi i PTM.
      NOTA: Se la mobilità del peptide identificato era nota in precedenza, anche questo è confermato.
3. Calcola le abbondanze relative di vari PTM e riporta ogni modifica come percentuale della sequenza peptidica specificata.
   1. L'abbondanza relativa di ogni PTM rilevato viene calcolata utilizzando la seguente equazione:
      Abbondanza relativa = Area di PTM/Area totale di PTM e PTM non modificati per un dato peptide

Un flusso di lavoro proteomico bottom-up (Figura 7) prevede in genere quanto segue: estrazione delle proteine target da un campione grezzo, seguita dalla quantificazione della concentrazione delle proteine e quindi frazionamento, di solito mediante elettroforesi su gel o cromatografia liquida. Dopo il frazionamento, le proteine vengono digerite utilizzando un enzima proteolitico (spesso tripsina) e, infine, l'analisi spettrometrica di massa dei peptidi risultanti e l'identificazione delle proteine utilizzando un database stabilito¹⁸. Le informazioni sulla sequenza sono derivate da ioni precursori all'interno dell'intervallo massa-carica (m/z) indicato, che sono soggetti a dissociazione indotta da collisione (CID), producendo modelli di frammentazione da identificare e sequenziare utilizzando un database¹⁹ (Figura 8).

Per questo lavoro, l'obiettivo principale è stato quello di sviluppare e applicare un metodo LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS DDA seguendo i passaggi descritti in precedenza nella sezione del protocollo. Determinare la posizionalità delle modificazioni post-traduzionali su peptidi isomerici e isobarici ha presentato una sfida particolare per quanto riguarda l'identificazione e l'interpretazione dello spettro. In questo studio, sono stati utilizzati come campioni standard di istoni umani ricombinanti e cellule HeLa S3.

L'analisi PTM degli istoni umani standard tramite ESI-TIMS-PASEF-ToF MS/MS ha prodotto peptidi di dimensioni medio-grandi (3-30 amminoacidi di lunghezza) rilevati con fino a 5 cariche per peptide. La procedura di propionilazione ha avuto successo nella produzione di peptidi più lunghi e più informativi rispetto a quelli comunemente prodotti dalla digestione triptica. Dopo l'analisi dei dati, i peptidi sono stati identificati in stati variamente modificati. Come vantaggio, il metodo basato su TIMS ha differenziato alcuni peptidi isomerici posizionali che trasportano gli stessi PTM. Ad esempio, due specie isomeriche possono sovrapporsi nel tempo di ritenzione e m /z; tuttavia, i due segnali potrebbero essere separati nel dominio della mobilità (Figura 9).

I corrispondenti spettri di frammentazione per i peptidi mostrati nella Figura 9 sono stati annotati da un software di analisi proteomica utilizzando i file FASTA appropriati. Nella Figura 9A, il peptide non modificato è visto con tre gruppi di propionile (+56,03) (sul N-terminale, lisina 18 e lisina 23). Nella Figura 9B, il peptide è osservato con un gruppo acetilico (+42,02) sulla lisina 18 e due gruppi propionilici (uno al N-terminale e uno sulla lisina 23). Infine, nella Figura 9C il peptide è visto con un'acetilazione osservata sulla lisina 23 e due gruppi propionilici (sull'N-terminale e sulla lisina 18). Come pubblicato in precedenza, il vantaggio PASEF potrebbe essere utilizzato per aumentare la velocità e la sensibilità del sequenziamento puntando ripetutamente sulla stessa funzione⁹. Ciò consente all'utente di ottenere maggiori informazioni strutturali dai campioni biologici. In questo caso, questo viene applicato al tipo e alla posizione dei PTM che si verificano su ciascun istone.

L'analisi delle modificazioni post-traduzionali può anche essere rappresentata visivamente come un grafico di copertura della sequenza, come mostrato nella Figura 10. Nella Figura 10A, lo standard dell'istone H3 che è stato propionilato prima della digestione, si presenta con peptidi più lunghi di quelli che altrimenti sarebbero risultati, indicati dalle linee blu. Gli istoni estratti dalle cellule HeLa S3 sono stati processati nello stesso modo, come rappresentato dalla Figura 10B. Sono stati indicati diversi PTM, tra cui molti modelli diversi nelle stesse posizioni degli amminoacidi. C'è da aspettarselo dai campioni biologici. Da notare che le poche linee grigie nella Figura 10B denotano peptidi che sono stati identificati in modo ambiguo a causa della mancanza di un MS² derivante dalla bassa intensità.

Figura 1: Rappresentazione schematica e produzione di punte di fase. (A-G) Guida passo-passo sulla produzione di una punta di tavolino a disco di silice C18. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Elaborazione dei dati: 20210804 Propionilato Standard Histones Mix_QC Peptide. Prima di iniziare l'elaborazione dei dati, assicurarsi di preparare l'elenco teorico dei possibili stati di carica e delle loro frammentazioni (1550.9013; 775.9543; 517.6386; ecc.) per estrarre tali valori dal cromatogramma di picco di base (BPC +All MS). Dopo aver estratto ciascun peptide, assicurarsi che assomigli all'elenco di analisi mostrato in figura. Il picco 775,9543 è stato selezionato come esempio. Sul lato destro della figura sono mostrati tre grafici: il primo corrisponde al cromatogramma (grafico dell'intensità rispetto al tempo), il secondo al mobilogramma e il terzo allo spettro di massa con la frammentazione PASEF inclusa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: passaggi 1-4 del protocollo timsControl. La figura mostra i primi quattro passaggi della procedura timsControl. In alto a sinistra, fare clic sul pulsante Strumento per attivare e disattivare la connessione tra lo strumento e il software. Prima di eseguire qualsiasi attività, è necessario assicurarsi che il software sia in modalità operativa. Infine, verificare che i parametri TIMS siano corretti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Parametri di origine. In questo caso, la siringa Hamilton da 500 μL è stata utilizzata solo per TuneMix. Verificare che gli altri parametri rimangano corretti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Calibrazione massa-carica (m/z). Selezionare Calibra fino a ottenere un punteggio del 100% nel pannello in basso a sinistra Modalità di calibrazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Calibrazione della mobilità. Selezionare Calibra fino a quando non è stato ottenuto un punteggio di almeno il 98,5% nel pannello in basso a sinistra Modalità di calibrazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Tipico flusso di lavoro di proteomica bottom-up. Passo dopo passo delle procedure bottom-up dalla preparazione del campione all'identificazione⁹. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Tempo di ritenzione, pattern isotopico e profili di mobilità H3 18-26. (A) propionilato non modificato, (B) peptide K23Ac propionilato nelle altre due posizioni e (C) K18Ac propionilato nelle altre due posizioni. Si notino i vantaggi della separazione della mobilità per il caso degli isomeri strutturali mostrati nei pannelli B e C. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: Esempio di sequenziamento di peptidi di frammentazione MS/MS mediante PASEF. Gli spettri dei frammenti sono stati ottenuti da un software di analisi proteomica per il peptide H3 con posizioni aminoacidiche 18-26. (A) propionilato non modificato, (B) peptide K23Ac propionilato nelle altre due posizioni e (C) K18Ac propionilato nelle altre due posizioni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 10: Esempio di riepilogo dell'analisi PTM degli istoni visivi. Risultati dei peptidi e dei PTM osservati da (A) uno standard H3 e (B) H3 da cellule HeLa S3. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Caratteristiche standard e del peptide HeLa S3 LC-TIMS-TOF MS/MS. Elenco dei peptidi target e osservati, comprese le proprietà sperimentali (ad esempio, tempo di ritenzione, m/z, 1/K_o e aree di picco LC). Clicca qui per scaricare questa tabella.

Gli istoni sono proteine di base che regolano la struttura della cromatina interagendo con il DNA sotto forma di ottameri costituiti dai quattro istoni principali (due ciascuno di H2A, H2B, H3 e H4)²⁰. Gli istoni contengono numerosi residui di lisina e arginina, che vengono prontamente modificati, portando a PTM estesi che alterano la chimica della cromatina influenzando la funzione degli istoni o legandosi ad altre proteine cellulari²¹. I PTM possono suscitare risposte biologiche lavorando in tandem, con gruppi specifici di PTM che sono stati segnalati in diverse malattie, in particolare diversi tipi di cancro²².

Quando il danno al DNA viene riconosciuto a livello cellulare, è immediatamente seguito dall'azione di una complessa cascata di segnalazione in cui le lesioni sono marcate, seguita dal coordinamento della progressione del ciclo cellulare e dall'attivazione delle vie di riparazione richieste. Inoltre, il danno al DNA induce varie modificazioni, come gli addotti acetilici e metilici, che facilitano il reclutamento proteico²³. La grande varietà di PTM che sono coinvolti nelle lesioni del DNA porta a chiedersi come questi meccanismi molecolari ne regolano la coesistenza e quale sia l'importanza funzionale di difendere l'integrità del genoma attraverso una rete integrata estremamente complessa. Ad esempio, la trimetilazione della lisina 9 dell'istone H3 (H3K9me3) è stata collegata a diverse patologie in varie malattie²⁴. Per questi motivi, è necessario sviluppare metodologie analitiche strumentali che permettano la completa caratterizzazione di queste modificazioni a livello cellulare²³.

L'analisi delle estrazioni di istoni HeLa S3 utilizzando un software di analisi manuale dei dati e un software di analisi proteomica ha rivelato PTM, tra cui acetilazione (+42,01 Da), metil-propionilazione (+70,04 Da), dimetilazione (+28,03 Da) e trimetilazione (+42,05) per diverse proteine istoniche. Inoltre, il metodo MS/MS basato su PASEF è stato in grado di differenziare alcuni peptidi isomerici posizionali che trasportano gli stessi PTM.

Nell'introduzione, vengono brevemente descritti i vantaggi dell'accoppiamento di LC-TIMS-TOF MS/MS nello studio dei PTM per mostrare i recenti sviluppi della DDA utilizzando l'accumulo parallelo nella trappola di mobilità seguito dalla frammentazione sequenziale e dalla dissociazione indotta dalla collisione. L'idea principale è quella di stabilire una metodologia che consenta la risoluzione di segnali provenienti da diversi peptidi e che, fino ad ora, le tecniche classiche non sono state in grado di risolvere. Il processo di derivatizzazione che utilizza l'anidride propionica impedisce la scissione dei terminali C della lisina da parte della tripsina, generando peptidi più lunghi e informativi. I peptidi con lo stesso m/z e lo stesso tempo di ritenzione sono stati identificati dai loro modelli di frammentazione, ma si è anche visto che alcune di queste specie potevano essere separate nel dominio della mobilità utilizzando questo metodo LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS.

Per comprendere meglio questo concetto, la Figura 8 rappresenta tre caratteristiche principali di ogni molecola, permettendo così l'identificazione di un composto, siano essi proteine, lipidi o peptidi intatti (in questo caso, l'istone H3 18-26), per citare alcuni esempi. Queste caratteristiche includono il tempo di ritenzione (min) di un composto nella colonna cromatografica, il rapporto massa-carica (m/z) di ciascun composto e la mobilità (1/K_o) che questi composti presentano quando interagiscono con il gas alla deriva. Nella Figura 8A, il peptide H3 18-26 non modificato ha un RT di 28,15 min e che presenta due bande nel suo spettro di mobilità, indicando che ha almeno due conformazioni, un risultato che si sospetta sia il risultato delle due lisine (18 e 23) che sono state propionilate seguendo il protocollo precedentemente descritto. Gli spettri seguenti (Figura 8B,C) mostrano lo stesso peptide (H3 18-26) ma variando la posizione del gruppo di acetilazione (42.02) tra B, K18Ac e C, K23Ac. Questi due isomeri (K18Ac e K23Ac) sono stati identificati attraverso il mobilogramma, in quanto si presentano con distribuzioni spaziali diverse, che si traducono in diverse interazioni con il gas nella cella TIMS. L'importanza di questa metodica risiede nella possibilità di identificare e studiare in modo più dettagliato i diversi PTM che sono stati associati a diverse malattie attraverso, ad esempio, il danno al DNA.

Quando i dati di frammentazione sono scarsi, l'identificazione di una modifica in un residuo specifico è difficile perché due o più modifiche dissimili potrebbero verificarsi contemporaneamente in corrispondenza (o in prossimità) degli stessi residui e possono essere intese come un'unica modificazione²⁵. Questo potrebbe essere risolto assicurandosi che il peptide non modificato sia stato identificato, in particolare utilizzando uno standard per confermare o negare la presenza di una singola modificazione piuttosto che di più modifiche (Tabella 1).

Per evitare un'eccessiva contaminazione o estrazioni di istoni impuri, è importante controllare la qualità dei reagenti prima dell'uso. Ad esempio, se la soluzione tampone NIB viene conservata e utilizzata alla rinfusa, assicurarsi che la soluzione sia limpida e priva di torbidità o presentazione anomala. La torbidità può essere il risultato della crescita batterica, che contaminerebbe i campioni e potrebbe provocare una miscela di istoni e proteine batteriche. Inoltre, si raccomanda di preparare nuove curve di calibrazione per i saggi, come il BCA o il saggio di Bradford utilizzato per determinare la concentrazione proteica, assicurandosi che la proteina utilizzata per la curva di calibrazione non sia scaduta o degradata.

Questo metodo può essere esteso ad altri tipi di cellule o organismi, ad esempio le zanzare. Nel caso di organismi interi o parziali, la selezione di un numero appropriato di organismi è particolarmente importante per garantire che la concentrazione finale di istoni sia adatta per l'analisi.

Inoltre, come linea guida generale per la manutenzione dello spettrometro di massa, l'estremità anteriore deve essere pulita periodicamente per evitare accumuli sullo strumento e contaminazione tra le esecuzioni. Questa pulizia dovrebbe includere la tenda, l'orifizio e il quadrupolo, secondo necessità.

Generalmente, quando si utilizza un LC, è necessario prendere in considerazione la preparazione di nuove fasi mobili ogni settimana utilizzando solventi di grado MS. È buona norma mantenere pipette e vetreria dedicate per la preparazione della fase mobile e spurgare le linee LC ogni volta che vengono inserite nuove soluzioni nel sistema. Le colonne di protezione e di separazione devono essere sostituite di solito ogni 100-200 iniezioni e 500-1500 iniezioni, rispettivamente²⁶. Assicurarsi di iniettare i bianchi prima e dopo l'esecuzione di un lotto di campioni. Se c'è un gran numero di campioni all'interno di un determinato lotto, si può anche prendere in considerazione l'esecuzione di un bianco a vari intervalli all'interno del lotto.

Il protocollo fornisce un flusso di lavoro DDA basato su PASEF per il rilevamento di PTM istonici e la differenziazione di specie isobariche e isomeriche in base alla mobilità ionica.

Questo protocollo richiede un'ampia preparazione del campione e deve essere tenuto conto del tempo complessivo di preparazione del campione sperimentale. In media, il protocollo di preparazione del campione richiede 2-3 giorni lavorativi per essere completato. Inoltre, le differenze tra i laboratori e le versioni dello strumento possono influire sulla sensibilità complessiva dell'analisi.

Pochissimi software di analisi dei dati proteomici sono stati ritenuti adeguati per l'uso nell'analisi degli istoni tramite metodi bottom-up senza regolazione o correzione manuale 27,28,29. I risultati dovrebbero (almeno all'inizio) essere confermati utilizzando l'analisi manuale, che richiede anche molto tempo. Se si utilizza un software analitico, dovrebbe avere funzionalità di annotazione MS/MS, che sono generalmente facili da confermare o rifiutare.

Vale anche la pena ricordare che è impossibile separare gli isomeri attraverso la spettrometria di massa a meno che non venga inserita una cella TIMS e non vengano utilizzati i valori di mobilità; ad esempio, le posizioni delle modificazioni istoniche possono essere determinate utilizzando modelli di frammentazione (PASEF).

Melvin A. Park e Matthew Willetts sono dipendenti della Bruker Daltonics Inc., il produttore dello strumento timsTOF.

Questo materiale si basa sul lavoro sostenuto dalla National Science Foundation nell'ambito della sovvenzione n. HRD-1547798 e Grant No. HRD-2111661. Queste sovvenzioni NSF sono state assegnate alla Florida International University nell'ambito del programma CREST (Centers of Research Excellence in Science and Technology). Questo è il contributo numero 1672 dell'Institute of Environment, un programma preminente presso la Florida International University. Un ulteriore sostegno è stato fornito dal National Institute of Health nell'ambito della sovvenzione n. R21AI135469 a Francisco Fernandez-Lima e Grant No. R01HD106051 a Benjamin A. Garcia, così come dalla National Science Foundation nell'ambito della sovvenzione n. CHE-2127882 a Benjamin A. Garcia. Gli autori desiderano riconoscere il supporto iniziale del Dr. Mario Gomez Hernandez durante gli sviluppi iniziali del metodo.