Analisi spaziotemporale dell'attività microgliale del Ca²⁺ alla risoluzione di una singola cellula

In questo articolo, descriviamo un protocollo per l'imaging in vivo dell'attività del Ca²⁺ microgliale e la successiva analisi delle sue dinamiche spaziotemporali. Questo metodo consente una caratterizzazione approfondita di come le microglia rispondono ai cambiamenti nell'ambiente cerebrale, catturando in modo appropriato le scale spazio-temporali sottili in cui si verificano tali eventi.

Le microglia sono le uniche cellule immunitarie residenti nel sistema nervoso centrale. La loro morfologia è altamente plastica, che cambia a seconda della loro attività. In condizioni omeostatiche, le microglia possiedono una morfologia altamente ramificata. Ciò facilita il loro monitoraggio dell'ambiente circostante attraverso il continuo allungamento e riavvolgimento dei loro processi. Durante le lesioni cerebrali e l'infiammazione, tuttavia, le microglia si attivano e subiscono drammatici cambiamenti morfologici, ritraendo i loro processi ramificati e gonfiando il loro corpo cellulare. Ciò facilita attività come la migrazione e la fagocitosi, che le microglia intraprendono per navigare nell'ambiente cerebrale verso uno stato meno patologico.

Questa stretta relazione tra la morfologia microgliale e i cambiamenti nella loro attività ha permesso di comprendere considerevolmente le varie funzioni microgliali. Tuttavia, tali cambiamenti morfologici e di attività sono essi stessi fenomeni che possono derivare da un numero qualsiasi di vie di segnalazione intracellulare. Inoltre, l'intervallo di tempo tra lo stimolo e la risposta, così come la morfologia altamente compartimentalizzata della microglia, rendono difficile isolare i meccanismi causali che sono alla base della funzione. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato una linea di topi geneticamente modificati in cui una proteina fluorescente altamente sensibile Ca²⁺-indicatore è specificamente espressa nella microglia.

Dopo aver descritto i metodi per l'imaging microgliale in vivo del Ca²⁺ , questo articolo presenta un approccio di analisi strutturato che classifica questa attività del Ca²⁺ in regioni subcellulari razionalmente definite, assicurando così che le dimensioni spaziali e temporali dell'informazione codificata siano estratte in modo significativo. Riteniamo che questo approccio fornirà una comprensione dettagliata delle regole di segnalazione intracellulare che governano la vasta gamma di attività microgliali associate sia alle funzioni cerebrali superiori che alle condizioni patologiche.

Le microglia sono le cellule immunitarie residenti nel sistema nervoso centrale (SNC) e svolgono un ruolo importante nel mantenimento di un ambiente cerebrale omeostatico e nella regolazione della formazione dei circuiti neurali durante lo sviluppo cerebrale ^1,2. Una caratteristica unica delle microglia nel SNC è che la loro morfologia è altamente plastica; Tuttavia, fenotipi morfologici distinti possono essere associati a funzioni particolari. Inoltre, la trasformazione tra fenotipi morfologici è altamente dinamica, avvenendo su scale temporali rapide in risposta ai cambiamenti nell'ambiente circostante ^3,4.

In condizioni fisiologiche omeostatiche, le microglia assumono una morfologia altamente ramificata, con molteplici processi che si irradiano verso l'esterno in tutte le direzioni. Questi processi ramificati dimostrano essi stessi un'elevata motilità, estendendosi e ritraendosi continuamente ^3,4. Tale attività è principalmente diretta verso il contatto periodico con sinapsi neuronali, assoni e somi per monitorare l'attività neuronale 5,6,7,8,9. Tuttavia, quando il cervello è danneggiato, le microglia rilevano rapidamente questa anomalia e, come primo passo nella loro risposta adattativa, dirigono l'estensione dei loro processi verso la corrispondente localizzazione ^3,4. Laddove le microglia sono necessarie per intraprendere la fagocitosi delle cellule morte e dei metaboliti, assumono una morfologia simile all'ameboide, accorciando i loro processi e ingrandendo i loro corpi cellulari, come parte della loro transizione nel fenotipo immunologicamente attivato^10,11.

Tuttavia, mentre i drammatici cambiamenti morfologici dei processi microgliali sono facilmente rilevabili, i cambiamenti di scala più fini del soma cellulare sono significativamente più difficili da catturare, specialmente a una risoluzione temporale fisiologicamente rilevante. Inoltre, i cambiamenti morfologici stessi rappresentano solo il risultato integrato di un numero qualsiasi di vie di segnalazione intracellulare. Questo è problematico per l'obiettivo di tracciare l'attività funzionale e collegare meccanicamente uno stimolo con la risposta finale che provoca.

Dato il suo ruolo diffuso come secondo messaggero, l'esame delle dinamiche intracellulari del Ca²⁺ cattura meglio le informazioni spaziotemporali associate quando si studiano i processi cellulari dinamici. Tale approccio è applicabile alle microglia dato che esprimono una varietà di recettori ionotropici e metabotropici legati all'elevazione intracellulare di Ca²⁺ a valle. Infatti, l'imaging in vivo del Ca²⁺ è stato utilizzato per caratterizzare gli aspetti spazio-temporali delle attività microgliali in tempo reale, correlando con successo i cambiamenti nell'attività del Ca²⁺ microgliale con lesioni cerebrali, infiammazione e iperattività e ipoattività nei neuroni 12,13,14,15,16. Ad esempio, gli aumenti di Ca²⁺ associati all'estensione del processo microgliale in risposta all'attività neuronale iper/ipoattiva probabilmente riflettono il sottostante processo di polimerizzazione dell'actina Ca²⁺-dipendente¹⁶. Inoltre, l'imaging in vivo del Ca²⁺ può anche essere facilmente combinato con approcci farmacologici. Ad esempio, mentre le microglia esprimono sia i recettori P2X (ionotropici) che P2Y (metabotropici), l'applicazione locale degli agonisti P2Y imita e successivamente desensibilizza la risposta microgliale del Ca²⁺ ai neuroni vicini danneggiati¹³, implicando così una maggiore rilevanza della segnalazione P2Y per la rilevazione del danno neuronale.

Ad oggi, precedenti rapporti che hanno esaminato l'attività del Ca²⁺ microgliale hanno impiegato metodi di analisi basati sulla regione di interesse (ROI). Uno svantaggio di questi approcci è che sono ancora troppo grossolani per essere in grado di risolvere le dinamiche spazio-temporali dell'attività del Ca²⁺ a livello dei singoli processi microgliali. Pertanto, questo protocollo descrive sia i metodi convenzionali basati sul ROI per l'analisi dell'attività del Ca²⁺ microgliale sia i più recenti approcci basati sugli eventi, in grado di estrarre singoli eventi di Ca²⁺ nei processi microgliali. Prima di questo, forniamo una guida generale per l'imaging in vivo a due fotoni per catturare in modo appropriato l'attività del Ca²⁺ microgliale per un'analisi dettagliata.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dai comitati per la ricerca sugli animali del National Institute for Physiological Sciences e sono stati conformi alle linee guida del National Institutes of Health. Per tutti gli esperimenti, topi maschi di 8-10 settimane sono stati allevati in un ciclo luce/buio di 12/12 ore con accesso ad libitum a cibo e acqua. Per visualizzare l'attività del Ca²⁺ nella microglia, i topi ionizzati Ca²⁺ binding adapter molecule 1 (Iba1)-tetracycline transactivator (Iba1-tTA) sono stati incrociati con topi tetraciclina operator-GCaMP6 (tetO-GCaMP6)^17,18. Pertanto, in assenza di supplementazione di tetraciclina-analogo, il promotore Iba1 guida l'espressione di GCaMP6, esclusivamente nella microglia. Per tutti gli esperimenti, l'integrazione alimentare di doxiciclina è stata interrotta a 6 settimane dopo la nascita. Alla fine di tutti gli esperimenti, i topi sono stati soppressi mediante sovradosaggio di isoflurano seguito da lussazione cervicale. Consulta la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, gli animali e i reagenti utilizzati in questo protocollo.

1. Preparazione chirurgica di topi per imaging in vivo a due fotoni; Giorno 1

1. Eseguire tutte le procedure chirurgiche all'interno di una cabina a flusso d'aria laminare per mantenere condizioni di lavoro sterili. Prima di iniziare l'intervento chirurgico, sterilizzare l'interno dell'armadio con luce UV per 5 minuti.
2. Sterilizzare tutte le superfici di lavoro, il telaio chirurgico e gli strumenti stereotassici strofinandoli con etanolo al 70%.
3. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici (forbici, pinze, lame, pinzette) e la piastra per la testa su misura da attaccare al cranio del topo immergendoli in una soluzione di clorexidina gluconato all'1%.
4. Anestetizzare il topo con ketamina (7,4 mg ^kg-1, per via intraperitoneale [i.p.]) e xilazina (10 mg ^kg-1, i.p.). Rimettilo nella sua gabbia di casa fino a quando l'anestesia non prende piede. Confermare l'induzione completa dell'anestesia mediante la perdita del riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi.
5. Sterilizzare il cuoio capelluto con clorexidina gluconato all'1%. Radere via il pelo con una lama di rasoio.
6. Fissare il mouse all'interno del telaio chirurgico tramite strumenti stereotassici.
7. Applicare un unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
8. Applicare la gelatina di xilocaina al 2% sul cuoio capelluto per la gestione del dolore. Attendere 5 minuti.
9. Rimuovere il cuoio capelluto con le forbici ed esporre il cranio. Pulisci il periostio e asciuga la superficie esposta del cranio strofinando con tamponi di cotone.
   NOTA: Le aree esposte del cranio devono essere completamente asciutte per garantire un forte legame con la piastra della testa su misura.
10. Fissare la piastra di testa su misura al cranio con cemento dentale.
11. Una volta che il cemento si è solidificato, riempire eventuali spazi tra la superficie del cranio e i bordi della placca di testa su misura con ulteriore cemento dentale.
12. Impermeabilizzare le superfici del cemento e del cranio applicando cemento resinoso adesivo dentale a base acrilica.
13. Rimetti il mouse nella sua gabbia di casa, posizionandolo su un tappetino riscaldante. Monitorare il topo fino a quando non riacquista una coscienza sufficiente per mantenere la decubito sternale (entro 2 ore).
    NOTA: I topi dovrebbero essere completamente guariti entro il giorno successivo e possono quindi essere ospitati con altri animali.

2. Preparazione chirurgica di topi per imaging in vivo a due fotoni; Giorno 2

1. Eseguire tutte le procedure chirurgiche all'interno di una cabina a flusso d'aria laminare per mantenere condizioni di lavoro sterili. Prima di iniziare l'intervento chirurgico, sterilizzare l'interno dell'armadio con luce UV per 5 minuti.
2. Stratificare insieme due vetrini coprioggetti di diverse dimensioni (vetro superiore: 3 mm × 3 mm; vetro inferiore: 2 mm × 2 mm) con resina di grado ottico polimerizzabile UV.
   NOTA: Il doppio vetrino coprioggetti fornisce una protezione a lungo termine alla regione cerebrale esposta dalla finestra cranica, consentendo al contempo l'accesso ottico cronico. Pertanto, le sue dimensioni possono essere modificate per adattarsi alla regione del cervello da visualizzare.
3. Sterilizzare tutte le superfici di lavoro e il telaio chirurgico strofinandoli con etanolo al 70%.
4. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici (trapano in acciaio, pinzette, gancio per aghi chirurgici) immergendoli in una soluzione di clorexidina gluconato all'1%.
5. Anestetizzare il topo con isoflurano (induzione 4%, mantenimento 1,2%-1,5%). Fissare il mouse all'interno del telaio chirurgico tramite la sua piastra di testa.
6. Per creare una finestra cranica sopra la corteccia motoria primaria, segnare un quadrato con dimensioni di 2 mm × 2 mm centrato 0,2 mm anteriormente e 1 mm lateralmente rispetto al punto di riferimento del cranio di Bregma.
7. Assottiglia il teschio lungo il bordo del quadrato segnato usando il trapano d'acciaio.
   NOTA: Quando si avvicina allo spessore desiderato, le aree del cranio assottigliate appariranno trasparenti se bagnate con soluzione salina e inizieranno a comparire crepe sottili.
8. Dopo aver confermato che l'intero bordo del quadrato segnato è stato adeguatamente assottigliato, inserire con cautela il gancio dell'ago chirurgico appena sotto la superficie del cranio, orientando la punta verso il centro del quadrato. Solleva delicatamente il pezzo quadrato del teschio con il gancio e usa una pinzetta per staccarlo dal resto del cranio. In caso di sanguinamento, lavare continuamente la superficie cerebrale esposta con soluzione fisiologica fino a quando non si attenua completamente.
9. Posizionare il doppio vetrino coprioggetti sulla superficie cerebrale esposta, orientando il lato con il vetrino coprioggetti più piccolo verso il cervello. Assicurarsi che i bordi del vetrino coprioggetti più grande siano a contatto con i bordi della finestra cranica.
10. Utilizzando un'asta di vetro con punta in silicone montata in un manipolatore, premere delicatamente sul doppio vetrino coprioggetti per assicurarsi che entri in contatto con la superficie del cervello.
11. Riempire lo spazio tra il doppio vetrino coprioggetti, il cranio e la superficie del cervello con resina polimerizzabile ai raggi UV e irradiare con luce UV fino a quando non si sarà indurito (~20 s). Sollevare lentamente l'asta di vetro con punta in silicone lontano dal doppio vetrino coprioggetti.
12. Lascia che il mouse si riprenda, posizionandolo su un pad riscaldante. Monitorare il topo fino a quando non riacquista una coscienza sufficiente per mantenere la decubito sternale (30 min).
13. Procedi al passaggio 3 o riporta il mouse nella sua gabbia di casa.
    NOTA: Dopo un intervento chirurgico esperto, la dura madre e tutti i vasi sanguigni sottostanti saranno completamente intatti senza sanguinamento. In questo caso, l'infiammazione è minima ed è possibile procedere immediatamente allo step 3. In caso di dubbi, attendere 1-3 settimane per assicurarsi che l'infiammazione si sia completamente risolta.

3. Raccolta dati mediante imaging in vivo a due fotoni

1. Attivare la configurazione di imaging in anticipo per assicurarsi che il laser abbia il tempo sufficiente per riscaldarsi e stabilizzarsi. Sintonizzare il laser in modo che emetta a una lunghezza d'onda di 920 nm, che è lo spettro a due fotoni che eccita in modo ottimale il fluoroforo GCaMP6.
2. Posizionare il mouse sotto l'obiettivo di un microscopio 25x e abituarlo per 30 minuti. Se necessario, anestetizzare il topo con isoflurano durante l'imaging (induzione 4%, mantenimento 1,2%-1,5%).
   NOTA: L'isoflurano potrebbe non essere appropriato per alcune applicazioni di ricerca, in quanto influisce sulla motilità del processo microgliale e sull'attività del Ca²⁺ 19,20,21.
3. Impostare lo zoom su 1x, quindi cercare la microglia che esprime GCaMP6 nell'area della finestra cranica. Cerca a una profondità compresa tra 100 μm e 300 μm sotto la superficie del cervello.
4. Una volta trovata una microglia che esprime GCaMP6 appropriata, massimizzare lo zoom in modo che l'attività del Ca²⁺ possa essere catturata con una risoluzione di una singola cellula.
5. Confermare visivamente che l'attività del Ca²⁺ sia chiaramente catturata e, se necessario, regolare la potenza del laser e il guadagno di imaging.
   NOTA: La potenza del laser deve essere ridotta al minimo il più possibile per evitare il fotosbiancamento e lesioni alla microglia.
6. Eseguire l'acquisizione di immagini quadridimensionali (4D) come segue (passaggi 3.6.1-3.6.3; Figura 1B):
   1. Imposta le dimensioni dell'immagine su area XY = 512 × 512 pixel, 0,25 μm/pixel; Area Z = cinque piani z, passo z di 3 μm (Figura 1B).
   2. Impostare la velocità di acquisizione su 2,5 fotogrammi/s.
      NOTA: La scansione Z a questa velocità è facilitata da un sistema di nano-posizionamento piezoelettrico.
   3. Acquisire i dati fino a quando non si osservano almeno 10 singoli eventi di Ca²⁺ (di solito 10 minuti).

4. Preparazione per l'analisi (correzione del movimento, proiezione z media/massima)

1. Prima di procedere con l'analisi dell'attività del Ca²⁺ della microglia, correggere le immagini 4D per verificare la presenza di artefatti legati al movimento (registrazione dell'immagine) utilizzando l'algoritmo di allineamento dell'immagine ECC²² all'interno dell'ambiente di programmazione MATLAB (R2020a). Scarica il codice da: https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/27253-ecc-image-alignment-algorithm-image-registration.
2. Crea un'immagine 3D di riferimento registrando tutte le immagini entro il primo intervallo di tempo utilizzando l'operazione di registrazione MATLAB (toolbox standard per l'elaborazione delle immagini).
3. Registra tutte le immagini successive, abbinandole al piano z corrispondente dell'immagine 3D di riferimento utilizzando la funzione ecc (libreria di algoritmi di allineamento delle immagini ECC).
4. Genera proiezioni z di intensità media dalle immagini registrate utilizzando l'operazione MATLAB media . Se il segnale di imaging è troppo debole, generare invece proiezioni z di massima intensità utilizzando l'operazione MATLAB massima .
   NOTA: Il rapporto segnale/rumore è peggiore quando si utilizzano proiezioni z di massima intensità.
5. Procedere al passaggio 5 o 6. Utilizzare le proiezioni z generate nella fase 4 come obiettivo dell'analisi per mappare la dinamica spazio-temporale dell'attività del Ca²⁺ nelle fasi 5 e 6.

5. Analisi basata sul ROI

1. Utilizzando le proiezioni z generate nella fase 4, identificare i processi microgliali che mantengono un profilo di area stabile (area stabile) durante il periodo di imaging per la successiva analisi dell'attività del Ca²⁺ come segue (fasi 5.3-5.6):
   1. Genera proiezioni t separate di massima intensità delle immagini 4D registrate da campioni di 2 minuti prelevati all'inizio e alla fine del periodo di imaging utilizzando l'operazione MATLAB massima .
   2. Binarizzare le proiezioni t per generare poligoni della morfologia microgliale corrispondenti all'inizio e alla fine del periodo di imaging utilizzando l'operazione di imbinarizzazione MATLAB. Utilizzare la soglia predefinita impostata automaticamente.
      NOTA: Se il segnale Ca²⁺ è debole durante l'inizio e la fine del periodo di imaging, la binarizzazione può generare poligoni con bordi mancanti. In questo caso, disegnate manualmente i bordi mancanti utilizzando lo strumento matita in ImageJ.
   3. Sovrapponi i poligoni di proiezione t utilizzando l'operazione imadd MATLAB. Le regioni sovrapposte rappresentano l'area stabile (Figura 2B).
   4. All'interno delle aree stabili identificate, utilizzare l'operazione MATLAB drawpolygon per definire e tracciare manualmente le ROI per ciascuno dei processi microgliali primari e per eventuali sottorami evidenti del secondo ordine.
2. Traccia le intensità di fluorescenza assolute medie di un singolo ROI in tutti gli intervalli di tempo (Figura 2C, D).
3. Dalla serie temporale delle intensità assolute di fluorescenza, calcolare la variazione relativa delle serie temporali di intensità di fluorescenza (ΔF/F) secondo l'equazione (1). Questa serie temporale rappresenta la dinamica microgliale normalizzata del Ca²⁺ a livello di ROI individuali.
   ΔF/F = (F(t) - F₀) / F₀ (1)
   Dove F(t) è l'intensità di fluorescenza registrata in un dato momento e F0 è il 10^° percentile dell'intensità di fluorescenza in tutti gli intervalli di tempo (Figura 2E).
4. Identificare gli eventi di attivazione Ca²⁺ candidati che si verificano in un determinato ROI individuale come segue (passaggi 5.5.1-5.5.3):
   1. Applicare il filtro passa-basso a risposta all'impulso finito (FIR) di tipo I sulle serie temporali ΔF/F utilizzando l'operazione MATLAB fir1 . Impostare la frequenza di taglio sul valore di Nyquist (metà della frequenza di campionamento).
   2. Ispezionare visivamente la traccia filtrata per confermare che i singoli picchi di traccia corrispondano a raffiche di attività del Ca²⁺ nelle immagini 4D registrate (Figura 2F).
   3. Identificare gli eventi di attivazione del Ca²⁺ candidati come inflessioni concave verso il basso nella traccia della serie temporaleΔF/F. Definire una soglia di base come valore mediano ΔF/F all'interno dei massimali superiore e inferiore che escludono le ampiezze massime e minime del 10% in tutti gli intervalli di tempo. Definire una soglia di rilevamento di tre SD al di sopra della soglia di base (Figura 2F,H).
5. Identificare gli eventi di attivazione Ca²⁺ reali dai candidati come segue (passaggi 5.5.1-5.5.2):
   1. Calcola la pendenza di ciascun evento candidato differenziando i corrispondenti intervalli di serie temporali ΔF/F filtrati utilizzando l'operazione MATLAB a gradiente numerico .
   2. Successivamente identificare i veri eventi di Ca²⁺ in base al tempo di salita del profilo. Definire una soglia di base come media dei valori di pendenza in tutti gli eventi candidati. Definire una soglia di rilevamento di tre SD al di sopra della soglia di base (Figura 2G,H).
6. Caratterizzare gli eventi Ca²⁺ veri come segue (passaggi 5.6.1-5.6.3):
   NOTA: Quello che segue non è un elenco esaustivo di parametri che possono essere utilizzati per caratterizzare gli eventi microgliali di Ca²⁺ . I parametri di interesse dipendono dallo scopo dello studio.
   1. Ricavare l'ampiezza massima di un vero evento di attivazione Ca²⁺ come valore ΔF/F del corrispondente sistema di riferimento della serie temporale ΔF/F .
   2. Ricavare l'ampiezza media di un vero evento di attivazione Ca²⁺ come valore medio ΔF/F nell'intero sottoinsieme di fotogrammi corrispondenti della serie temporale ΔF/F .
   3. Ricava la frequenza degli eventi veri di Ca²⁺ come il numero di eventi diviso per il tempo di imaging.

6. Analisi basata sugli eventi

1. Esegui l'analisi basata sugli eventi sulle proiezioni z dal passaggio 4 utilizzando la libreria AQuA all'interno dell'ambiente di programmazione MATLAB. Scarica il codice da: https://github.com/yu-lab-vt/AQuA.
   NOTA: Una guida generale per la libreria AQuA è disponibile all'indirizzo: https://drive.google.com/file/d/1a3lhe0dUth-5J1-S2fZlPOCZlPbeuvUr/view. La documentazione dettagliata per la libreria AQuA è disponibile all'indirizzo: https://drive.google.com/file/d/1CckDLbrkw16b7MPlOQdYpZciIz80Snm_/view.
2. Dopo aver avviato MATLAB, passare dalla cartella della directory di lavoro predefinita alla cartella della directory di lavoro designata da AQuA utilizzando l'operazione cd .
3. Caricare le immagini 4D registrate nella pipeline di analisi AQuA come segue (passaggi 6.3.1-6.3.2):
   1. Avviare l'interfaccia grafica di AQuA. Digita aqua_gui nella finestra di comando di MATLAB nella cartella della directory di lavoro designata da AQuA.
   2. All'interno della GUI di AQuA, fare clic su nuovo progetto e selezionare le immagini registrate da analizzare. Specificare il tipo di dati (GCaMPInVivo_cyto_Lck_) e i parametri di imaging (risoluzione temporale secondi per fotogramma = 1,993; risoluzione spaziale μm per pixel = 0,25; escludere i pixel più corti di questa distanza dal bordo = 5). Fare clic su Apri per caricare i dati.
4. Definisci i punti di riferimento per le pipeline di analisi successive tracciando le aree di interesse. Di solito, i punti di riferimento si basano sul confine cellulare e sull'area del corpo cellulare.
5. Successivamente, rileva gli eventi Ca²⁺ candidati eseguendo le pipeline di analisi automatizzate per i seguenti parametri: segnale attivo, super voxel, rilevamento eventi, eventi puliti ed eventi di unione.
   NOTA: una spiegazione dettagliata su ciascuno di questi parametri e sui relativi output del punteggio candidato viene fornita nella procedura dettagliata di AQuA. In breve, questi parametri regolano la soglia di rilevamento degli eventi Ca²⁺ come segue: segnale attivo = ampiezza della fluorescenza, super voxel = clustering della fluorescenza nello spazio 3D, rilevamento degli eventi = cinetica di aumento/decadimento, eventi puliti = rapporto segnale/rumore ed eventi di fusione = separazione temporale degli eventi.
6. Ispeziona visivamente gli eventi Ca²⁺ rilevati (sovrapposti automaticamente alle immagini originali registrate). Se necessario, regolare le impostazioni dei parametri delle pipeline di analisi considerando la qualità dell'immagine in termini dei parametri di cui sopra; Se la qualità dell'immagine per un determinato parametro è buona, è possibile impostare una soglia più alta e viceversa.
7. Una volta che tutti gli eventi di Ca²⁺ sono stati rilevati in modo appropriato, caratterizzare questi eventi all'interno dell'ambiente MATLAB principale come segue (passaggi 6.8-6.14):
8. Esportare i file di output dell'analisi AQuA.
   NOTA: Una spiegazione dettagliata sui file di output, sulle funzioni estratte utilizzate per definire gli eventi Ca²⁺ e sui parametri sottostanti di queste funzioni estratte è fornita nella documentazione di AQuA.
9. (Facoltativo) Categorizza tutti gli eventi Ca²⁺ in due gruppi: 1) eventi che iniziano dal soma e 2) eventi che iniziano dai processi.
10. Accedi all'ampiezza dei singoli eventi Ca²⁺ all'interno della struttura res.dffMat MATLAB del file di output dell'analisi AQuA (file .mat).
11. Ricava la frequenza dei singoli eventi Ca²⁺ utilizzando l'operazione res.fts.loc.x3D MATLAB (libreria AQuA).
12. Ricava la durata dei singoli eventi Ca²⁺ utilizzando l'operazione MATLAB res.fts.curve.width11 (libreria AQuA).
13. Ricava l'area dei singoli eventi Ca²⁺ utilizzando l'operazione MATLAB res.fts.basic.area (libreria AQuA).
14. Categorizza tutti gli eventi Ca²⁺ come: 1) eventi locali, 2) eventi propagativi che viaggiano verso il soma e 3) eventi propagativi che viaggiano lontano dal soma. A tale scopo, utilizzare le operazioni MATLAB res.fts.region.landmarkDir.chgToward e res.fts.region.landmarkDir.chgAway (libreria AQuA) (Figura 3C).

Nei topi transgenici che esprimono esclusivamente GCaMP6 (proteina fluorescente sensibile al Ca²⁺) nelle microglia, osserviamo tipicamente diversi modelli di attività del Ca²⁺ microgliale (Figura 2A). È importante sottolineare che, anche all'interno di una singola microglia, i modelli di attività del Ca²⁺ possono differire notevolmente tra i processi.

Per quantificare tali differenze da processo a processo nelle dinamiche spazio-temporali dell'attività microgliale del Ca²⁺, le aree stabili devono prima essere identificate e poi suddivise in ROI finemente segmentate (Figura 2B, C). Per ogni ROI, i parametri dell'attività del Ca²⁺ devono essere derivati e quantificati, come l'ampiezza e la frequenza, estraendo caratteristiche come le ampiezze locali e le pendenze delle tracce dalla serie temporale dell'intensità della fluorescenza (Figura 2D-G).

Successivamente, i singoli eventi di Ca²⁺ devono essere esaminati applicando l'algoritmo di quantificazione accurata AQuA (Figura 3A). Da tali analisi basate sugli eventi, si osservano in genere grandi differenze nelle caratteristiche di origine, ampiezza, durata, posizione e direzione del flusso dei singoli eventi di Ca²⁺ (Figura 3B). Se ci si concentra sull'analisi delle dinamiche dell'attività del Ca²⁺ nei processi microgliali, uno schema di classificazione degli eventi locali, degli eventi che viaggiano verso il soma e degli eventi che viaggiano lontano dal soma è informativo (Figura 3C).

Figura 1: Configurazione sperimentale per l'imaging microgliale in vivo del Ca²⁺ . (A) Configurazione sperimentale. Un topo Iba1-tTA × tetO-GCaMP6 con espressione GCaMP6 specifica per microglia. Inserendo una finestra cranica nel cranio del topo, l'attività del Ca²⁺ microgliale può essere osservata in vivo utilizzando la microscopia a due fotoni. (B) Calendario sperimentale e procedura di analisi. Le immagini 4D vengono acquisite per almeno 10 minuti come z-stack di cinque fotogrammi. La velocità di acquisizione dei fotogrammi è di 2,5 fotogrammi/s. Prima di analizzare l'attività del Ca²⁺ microgliale, gli z-stack di cinque fotogrammi vengono convertiti in proiezioni z 2D prendendo l'intensità media (o massima). La velocità di riproduzione della proiezione z è di 0,5 fotogrammi/s. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Analisi basata sul ROI per l'attività del Ca²⁺ microgliale. (A) Proiezione media dell'intensità di GCaMP6 su 10 minuti per una singola microglia. (B) Le aree stabili (bianco) sono definite da una sovrapposizione di proiezioni t di massima intensità GCaMP6 binarizzate derivate da campioni di 2 minuti prelevati all'inizio (magenta) e alla fine (verde) di un periodo di imaging. (C) Le aree stabili sono ulteriormente segmentate in ROI regionali. I singoli colori indicano i singoli ROI. (D) Tracce ΔF/F di tutti i ROI individuali in C. Si noti la variazione dei modelli di attività tra i ROI. (E) Traccia originale di una serie temporale ΔF/F derivata da valori assoluti di intensità per un singolo ROI. (F) La stessa serie temporale ΔF/F dopo il filtraggio passa-basso. Gli eventi Ca²⁺ candidati vengono rilevati da una soglia di cut-off di ampiezza (linea rossa) definita come basale + tre SD. Il valore di base (linea verde) è definito come il valore mediano dell'intera serie temporale ΔF/F all'interno di un massimale superiore e inferiore che esclude il 10% massimo e minimo dei valori ΔF/F . (G) La traccia di pendenza derivata dalla serie temporale ΔF/F filtrata in F. Gli eventi Ca²⁺ reali vengono ordinati dagli eventi Ca²⁺ candidati in base a una soglia di cut-off della pendenza (linea rossa) definita come linea di base + tre SD. La linea di base (linea verde) è definita come il valore medio dell'intera serie temporale della pendenza all'interno di un massimale superiore e inferiore che esclude il 10% massimo e minimo dei valori di pendenza. (H) Gli eventi candidati al Ca²⁺ identificati in F con criteri di ampiezza sono indicati in arancione. Gli eventi Ca²⁺ veri sono ordinati dagli eventi Ca²⁺ candidati in base ai criteri di pendenza in G in rosso. Si noti che alcuni eventi candidati Ca²⁺ sono stati uniti in base ai criteri di pendenza. La corrispondente serie temporale ΔF/F filtrata è sovrapposta di seguito come riferimento. La linea nera indica un'ampiezza zero (ΔF/F). L'ampiezza media e massima degli eventi veri di Ca²⁺ sono derivate come media e massima dei loro picchi corrispondenti nella serie temporale ΔF/F filtrata. La frequenza (eventi/min) è derivata dal numero di eventi di attivazione di Ca²⁺ reali diviso per il periodo di imaging (10 min). Barre di scala = 20 μm (A,B), 10 μm (C). Abbreviazione: ROI = regione di interesse. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Analisi basata su eventi per l'attività microgliale del Ca²⁺. (A) Immagini rappresentative degli eventi rilevati utilizzando l'algoritmo AQuA. I colori indicano le singole aree dell'evento rilevate in un determinato momento storico. (B) Attività rappresentativa normalizzata del Ca²⁺ (ΔF/F) in singoli eventi ordinati in base all'ordine di insorgenza. La barra di destra indica il colore indicato ΔF/F. (C) Impronte di attività rappresentative di eventi che si propagano verso e lontano dal soma o dagli eventi locali. Per gli eventi locali, la forma dell'evento viene visualizzata in blu. Per gli eventi di propagazione, il tempo di insorgenza dell'evento è indicato dalla scala blu-gialla. Poiché AQuA inizialmente rileva gli eventi di Ca²⁺ individualmente, gli eventi di propagazione vengono identificati successivamente in base alle posizioni spaziali sovrapposte e alle serie temporali di più eventi di Ca²⁺ individuali. Si noti che questo è lo stesso ramo dendritico utilizzato per l'analisi del ROI nella Figura 2E-H. Barre di scala = 20 μm (A), 10 μm (C). Abbreviazione: ROI = regione di interesse; S = soma. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Questo articolo introduce un approccio migliorato per l'imaging dell'attività del Ca²⁺ microgliale con un'elevata risoluzione spaziotemporale. Questo metodo è abbastanza sensibile da rilevare diversi tipi di attività microgliale del Ca²⁺ a livello di singoli processi ramificati, distinguendo facilmente tra eventi locali e propagativi.

Nel metodo generale per l'imaging in vivo a due fotoni dell'attività del Ca²⁺ microgliale, è necessario prestare particolare attenzione ai seguenti punti per massimizzare la qualità dell'imaging. Innanzitutto, poiché le microglia sono estremamente sensibili alle lesioni, è importante ridurre al minimo il contatto diretto con la superficie del cervello con strumenti chirurgici durante l'intervento chirurgico. Le indicazioni chiave che l'intervento chirurgico è stato eseguito in modo competente sono i vasi sanguigni intatti e la dura madre e il sanguinamento minimo durante l'intervento chirurgico. In secondo luogo, l'attacco sicuro della piastra per la testa al cranio del topo e un buon contatto tra il doppio vetrino coprioggetti e la superficie del cervello riducono notevolmente gli artefatti legati al movimento durante l'imaging. Ciò è particolarmente importante quando si esegue l'imaging con risoluzioni spaziotemporali elevate e in topi completamente svegli. Sebbene la pipeline di analisi compensi in modo affidabile gli artefatti legati al movimento derivanti dal battito cardiaco, dalla respirazione e dalla deriva generale, è meno robusta quando gestisce distorsioni geometriche significative derivanti da movimenti improvvisi e ampi.

I due metodi di analisi qui descritti offrono vantaggi diversi e sono adatti a diverse domande di ricerca. Nell'analisi basata sul ROI, l'utente predefinisce il ROI (come i singoli processi), consentendo di estrarre la dinamica aggregata dell'attività del Ca²⁺ di questo ROI. Pertanto, è più adatto a situazioni in cui ci si aspetta che i fenomeni siano localizzati in un'area subcellulare che ha sia confini morfologici ben definiti che un'area relativamente ampia (cioè un ramo di processo). Nell'analisi basata sugli eventi, i singoli eventi sono definiti in base alle dinamiche spaziotemporali dell'attività del Ca²⁺ microgliale stessa e devono quindi essere collocati nel contesto di punti di riferimento definiti dall'utente all'interno della microglia affinché la loro funzione possa essere interpretata. Pertanto, è più adatto a situazioni in cui non è possibile fare ipotesi sulla localizzazione dei fenomeni o in cui l'area di interesse è relativamente piccola (ad esempio, una punta di processo). Pertanto, l'analisi basata sugli eventi offre una migliore risoluzione spazio-temporale nella caratterizzazione dell'attività microgliale del Ca²⁺ rispetto ai metodi precedenti.

In questi topi, l'unico marcatore fluorescente espresso dalla microglia è l'indicatore Ca²⁺ GCaMP6. Pertanto, nelle regioni in cui l'attività del Ca²⁺ è bassa, la morfologia microgliale deve essere estratta combinando più intervalli di tempo, il che può degradare la risoluzione temporale. Tuttavia, questa limitazione può essere superata esprimendo una proteina rossa stabilmente fluorescente separata nella microglia. In particolare, sono stati recentemente descritti nuovi virus adeno-associati in grado di trasfettare la microglia 23,24,25.

Il modo in cui l'attività microgliale del Ca²⁺ viene alterata dall'ambiente circostante è un argomento emergente di interesse. In particolare, l'attività microgliale del Ca²⁺ sembra mostrare correlazioni significative con l'attività neuronale, sebbene il significato funzionale di ciò debba ancora essere completamente caratterizzato. Pertanto, la combinazione della manipolazione dell'attività neuronale con i metodi di imaging e analisi per l'attività del Ca²⁺ microgliale qui presentati dovrebbe fornire nuove intuizioni sulla fisiologia della microglia e far progredire ulteriormente la nostra comprensione dei ruoli che la microglia svolge negli stati fisiologici e patologici.

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse associati a questo manoscritto.

Siamo grati al Prof. Kenji Tanaka (Keio University, Tokyo, Giappone) per aver fornito i topi Iba1-tTA e i topi tetO-GCaMP6. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni per giovani scienziati (B) [16K19001 (a S.S.)], sovvenzioni a favore di scienziati all'inizio della carriera [18K14825 (a S.S.)], sovvenzioni a favore della ricerca scientifica (B) [21H03027 (a S.S.)], sovvenzioni a favore di aree di ricerca trasformativa (A) [21H05639 (a S.S.)], sovvenzioni a favore della ricerca scientifica (A) [17H01530, 20H00500 (a J.N.)] e sovvenzioni JST CREST [JPMJCR1755 (a J.N.)], Giappone.