Valutazione ecocardiografica completa della funzione del ventricolo destro in un modello di ratto di ipertensione arteriosa polmonare

Il presente protocollo descrive la caratterizzazione ecocardiografica della morfologia e della funzione ventricolare destra in un modello di ratto di ipertensione arteriosa polmonare.

L'ipertensione arteriosa polmonare (PAH) è una malattia progressiva causata dalla vasocostrizione e dal rimodellamento delle piccole arterie nei polmoni. Questo rimodellamento porta ad un aumento della resistenza vascolare polmonare, a un peggioramento della funzione ventricolare destra e alla morte prematura. Le terapie attualmente approvate per la PAH mirano in gran parte alle vie vasodilatatorie polmonari; tuttavia, le recenti modalità terapeutiche emergenti si concentrano su altri nuovi percorsi coinvolti nella patogenesi della malattia, incluso il rimodellamento del ventricolo destro (RV). Le tecniche di imaging che consentono la valutazione longitudinale di nuove terapie sono molto utili per determinare l'efficacia di nuovi farmaci negli studi preclinici. L'ecocardiografia transtoracica non invasiva rimane l'approccio standard per valutare la funzione cardiaca ed è ampiamente utilizzata nei modelli di roditori. Tuttavia, la valutazione ecocardiografica del RV può essere difficile a causa della sua posizione anatomica e struttura. Inoltre, mancano linee guida standardizzate per l'ecocardiografia nei modelli preclinici di roditori, rendendo difficile effettuare una valutazione uniforme della funzione RV tra gli studi in diversi laboratori. Negli studi preclinici, il modello di danno monocrotalino (MCT) nei ratti è ampiamente utilizzato per valutare l'efficacia del farmaco per il trattamento della PAH. Questo protocollo descrive la valutazione ecocardiografica del RV in ratti PAH naïve e indotti da MCT.

La PAH è una malattia progressiva definita come una pressione arteriosa polmonare media a riposo superiore a 20 mmHg¹. I cambiamenti patologici nella PAH includono il rimodellamento dell'arteria polmonare (PA), la vasocostrizione, l'infiammazione e l'attivazione e la proliferazione dei fibroblasti. Questi cambiamenti patologici portano ad un aumento della resistenza vascolare polmonare e, di conseguenza, al rimodellamento ventricolare destro, all'ipertrofia e al fallimento². La PAH è una malattia complessa che coinvolge la diafonia tra diverse vie di segnalazione. I farmaci attualmente approvati per il trattamento della PAH mirano principalmente alle vie vasodilatatorie, tra cui la via dell'ossido nitrico-guanosina monofosfato ciclico, la via della prostaciclina e la via dell'endotelina. Le terapie mirate a queste vie sono state utilizzate sia come monoterapie che in terapia combinata ^3,4. Nonostante i progressi nel trattamento per la PAH nell'ultimo decennio, i risultati del registro REVEAL con sede negli Stati Uniti mostrano uno scarso tasso di sopravvivenza a 5 anni per i pazienti di nuova diagnosi⁵. Più recentemente, le modalità terapeutiche emergenti si sono concentrate su agenti modificanti la malattia che possono avere un impatto sulla fisiopatologia multifattoriale del rimodellamento vascolare che si verifica nella PAH nella speranza di interrompere la malattia⁶.

I modelli animali di PAH sono strumenti inestimabili per valutare l'efficacia di nuovi trattamenti farmacologici. Il modello di ratto PAH indotto da MCT è un modello animale ampiamente utilizzato caratterizzato dal rimodellamento dei vasi arteriosi polmonari, che a sua volta porta ad un aumento della resistenza vascolare polmonare e ipertrofia e disfunzione ventricolare destra ^7,8. Per valutare l'efficacia dei nuovi trattamenti, i ricercatori normalmente si concentrano sulla valutazione terminale della pressione RV senza considerare la valutazione longitudinale della pressione PA, della morfologia RV e della funzione RV. L'uso di tecniche di imaging non invasive e non terminali è fondamentale per un esame completo della progressione della malattia nei modelli animali. L'ecocardiografia transtoracica rimane l'approccio standard per valutare la morfologia e la funzione del cuore nei modelli animali grazie al suo basso costo e alla facilità d'uso rispetto ad altre modalità di imaging, come la risonanza magnetica. Tuttavia, la valutazione ecocardiografica del RV può essere difficile a causa del posizionamento del RV sotto l'ombra dello sterno, della sua trabecolazione ben sviluppata e della sua forma anatomica, che rendono difficile delineare il bordo endocardico 9,10,11.

Questo articolo ha lo scopo di descrivere un protocollo completo per valutare le dimensioni, le aree e i volumi RV e la funzione sistolica e diastolica nella PAH naïve e indotta da MCT nei ratti Sprague Dawley (SD). Inoltre, questo protocollo descrive un metodo per valutare le dimensioni ecocardiografiche nell'atrio destro normale e dilatato.

Tutti gli esperimenti in questo protocollo sono stati eseguiti seguendo le linee guida per la cura degli animali dell'Università dell'Illinois a Chicago, Chicago Institutional Animal Care and Use Committee. I ratti maschi di Sprague Dawley (SD) pesavano tra 0,200-0,240 kg al momento dell'iniezione di MCT; Tuttavia, il protocollo descritto in questo articolo può essere utilizzato con un intervallo di peso corporeo più ampio. Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali).

1. Disegno dello studio

1. Animali
   1. Ottenere ratti SD maschi e consentire loro di acclimatarsi per 4-7 giorni. Raggruppare i ratti dal gruppo sperimentale in gabbie pulite e tenerli in una stanza mantenuta a 20-26 ° C (68-79 ° F) e illuminata con luci fluorescenti programmate per dare una luce di 14 ore, ciclo di buio di 10 ore.
   2. Dare ai ratti ad libitum l'accesso a una dieta standard e all'acqua del rubinetto per tutta la durata dell'esperimento.
2. Amministrazione MCT
   1. Il giorno 0 dello studio, somministrare ai ratti una dose sottocutanea (3,0 ml/kg) di MCT (60 mg/kg in HCl/NaOH, pH 7,4; vedere Tabella dei materiali; MCT Group) o veicolo (acqua deionizzata, pH 7,4; Gruppo di controllo).
      NOTA: A causa delle precauzioni di manipolazione associate al dosaggio MCT, tutti i ratti devono essere trattati il giorno 0 di studio in una stanza di stabulazione a rischio chimico e ospitati lì fino al giorno di studio 7.
   2. Il giorno 7 dello studio, trasferire i ratti in una stanza di alloggio generale per tutta la durata dello studio.
3. Osservazioni cliniche
   1. Eseguire osservazioni lato gabbia per la salute generale e l'aspetto una volta al giorno. Osserva gli animali per la mortalità e i segni di dolore e angoscia.
   2. Registrare eventuali osservazioni insolite annotate per tutta la durata dello studio nel quaderno dei dati grezzi.
4. Pesi corporei
   1. Registrare i pesi corporei il giorno 0 dello studio (predose), settimanalmente durante lo studio e il giorno dell'ecocardiografia.

2. Ecocardiografia

1. Preparazione
   1. Il giorno di studio 23 dopo la somministrazione di MCT, anestetizzare i ratti con isoflurano al 2%-3%, guidato dal 100% di ossigeno (1 L/min) in una camera di induzione (vedere Tabella dei materiali).
   2. Rimuovere i ratti dalla camera una volta che la coscienza è stata persa e trasferirli sulla piattaforma animale della stazione di imaging (vedi Tabella dei materiali) in posizione di decubito dorsale. Somministrare isoflurano utilizzando un cono naso collegato ad un vaporizzatore che eroga isoflurano all'1%-2% alimentato al 100% da ossigeno (1 L/min).
   3. Applicare il gel dell'elettrodo su ciascuna zampa e fissare le zampe nelle piastre di piombo dell'elettrocardiogramma della piattaforma animale.
   4. Rimuovere la pelliccia radendo il petto e usando un agente depilante (vedi Tabella dei materiali). Fissare una sonda di temperatura rettale (vedere la tabella dei materiali) in posizione. Posizionare rotoli di cotone sui lati destro e sinistro dell'animale e fissarli con del nastro adesivo per mantenere la posizione dell'animale quando la piattaforma è inclinata.
2. Monitoraggio
   1. Monitorare la temperatura corporea e la frequenza cardiaca (FC) tramite il sistema di imaging a ultrasuoni (vedere Tabella dei materiali) durante tutta la procedura.
   2. Mantenere la temperatura corporea a 37 ± 0,5 °C e mantenere la FC a 350 bpm o superiore, se possibile. Utilizzare il tavolo riscaldante e una lampada di calore per mantenere la temperatura.
3. Acquisizione di immagini
   1. Eseguire l'ecocardiografia transtoracica utilizzando un sistema di immagini ecografiche ad alta frequenza dotato di un trasduttore a ultrasuoni a stato solido (vedi Tabella dei materiali).
      NOTA: Tutte le direzioni annotate nei metodi ecocardiografici si riferiscono alla destra o alla sinistra dell'ecografista.
   2. Vista dell'asse lungo parasternale (LV) del ventricolo sinistro (LV) (PLAX)
      1. Con i ratti in posizione di decubito dorsale, inclinare la piattaforma verso sinistra e portarla caudalmente verso il basso di circa 10°.
      2. Posizionare il trasduttore nel supporto in una posizione semi-bloccante con la tacca rivolta nella direzione caudale. Spostare il trasduttore in modo che punti verso la linea parasternale sinistra. Ruotare il trasduttore in senso antiorario di circa 30°-45° e inclinarlo leggermente cranialmente lungo l'asse y (asse laterale del trasduttore).
      3. Applicare il gel caldo per ultrasuoni (vedere la tabella dei materiali) sul torace del ratto e abbassare il trasduttore fino a quando non è a contatto con il gel.
      4. Spostare la piattaforma a destra o a sinistra per ottenere una visione dell'intero LV al centro dello schermo. Se necessario, regolare la profondità dell'immagine e spostare la zona focale sulla parete posteriore.
      5. Effettuare regolazioni precise nella posizione della piattaforma per garantire che l'aorta e l'apice siano sullo stesso piano orizzontale e che il tratto di deflusso LV sia visibile.
      6. Premere Cine Store per registrare i dati. Esempi di viste PLAX delle immagini LV sono mostrati nella Figura 1A.
         NOTA: l'imaging del ventricolo sinistro consente di familiarizzare con la posizione del cuore nel torace. Un camper dilatato può spostare il LV.
   3. Vista PLAX modificata del tratto di efflusso ventricolare destro
      1. Inclinare la piattaforma verso destra di circa 10°-15° e portarla caudalmente verso il basso di circa 5°.
      2. Spostare il trasduttore in modo che punti alla linea parasternale destra del ratto. Ruotare il trasduttore in senso antiorario di circa 30°.
      3. Applicare il gel ad ultrasuoni sul petto del ratto e abbassare il trasduttore fino a quando non è in contatto con il gel.
      4. Spostare la piattaforma a sinistra o a destra fino a quando il camper è in vista. In questa vista PLAX modificata, la parete RV e il setto interventricolare (IVS) sono chiaramente visibili, come mostrato nella Figura 1B.
      5. Ruotare il trasduttore in senso antiorario, se necessario, per assicurarsi che l'aorta e la valvola mitrale siano visibili.
      6. Spostare la zona focale nella regione della parete libera del camper per migliorare la definizione del bordo endocardico e regolare il guadagno se necessario.
      7. Premere Cine Store per registrare i dati.
      8. Posizionare la linea del volume del campione M-mode nella regione in cui il RV è più largo e regolare il gate per includere RV e LV. La linea del volume del campione è generalmente posizionata tra l'ombra di due vertebre contigue nei ratti.
      9. Premere Aggiorna e quindi premere Cine Store per registrare i dati. Esempi di modalità M nelle immagini della vista PLAX modificata sono mostrati nella Figura 1C e queste immagini vengono utilizzate per analizzare il diametro interno del RV durante la diastole (RVIDd), il diametro interno del RV durante la sistole (RVID) e lo spessore della parete libera RV (RVFWT).
      10. Sollevare il trasduttore e riposizionarlo in modo che sia solo leggermente inclinato verso la linea parasternale destra del ratto. Spostare la piattaforma in una posizione solo leggermente inclinata verso destra.
      11. Abbassare il trasduttore fino a quando non è a contatto con il gel.
      12. Spostare la piattaforma caudalmente e a destra o a sinistra fino a quando la pista di deflusso del camper è in vista e la valvola polmonare (PV) è a fuoco e chiaramente visibile.
      13. Premere Cine Store per registrare i dati. Esempi di B-mode nella vista PLAX modificata a livello delle immagini del tratto di efflusso ventricolare destro sono mostrati nella Figura 2A; queste immagini vengono utilizzate per analizzare il diametro del fotovoltaico.
      14. Mantenendo la stessa posizione dell'immagine in modalità B, premere Colore per facilitare l'identificazione del flusso attraverso il PV. Regola la velocità per ottimizzare l'aliasing, in modo che sia visibile il punto di velocità più alto. Aumentare la frequenza dei fotogrammi, se necessario, diminuendo le dimensioni della casella dell'immagine Doppler a colori.
      15. Premere PW (onda pulsata) per quantificare lo spettro del flusso sanguigno. Aumentare al massimo le dimensioni del gate del volume del campione.
      16. Regolare la velocità della linea di base e il guadagno Doppler, se necessario, in modo che il flusso sia visibile.
      17. Allineare l'angolo PW parallelamente alla direzione del flusso attraverso il PV. Posizionare il volume del campione alla massima velocità (punto di aliasing) o sulle punte del foglietto fotovoltaico.
      18. Premere Aggiorna per visualizzare le velocità polmonari.
      19. Premere Cine Store per registrare i dati. Esempi di immagini PV PW Doppler sono mostrati nella Figura 2B; queste immagini vengono utilizzate per analizzare il tempo di eiezione polmonare (PET), il tempo di accelerazione polmonare (PAT), la velocità sistolica di picco polmonare (PV PSV), la gittata cardiaca (PV CO), il volume dell'ictus (PV SV), HR e la lunghezza del ciclo cardiaco (CL).
   4. Vista apicale a quattro camere focalizzata su camper
      1. Inclina la piattaforma nell'angolo sinistro e verso il basso cranialmente il più lontano possibile.
      2. Ruotare il trasduttore in senso antiorario di 30°-45° e spostare il trasduttore in modo che punti verso la spalla/l'orecchio destro dell'animale.
      3. Abbassare il trasduttore fino a quando non è a contatto con il gel. Questa posizione consente una tipica vista a quattro camere in cui sono visibili il LV e gli atri sinistri (LA), ma l'ombra dello sterno è sopra la parete libera del camper.
      4. Regolare la vista apicale a quattro camere per acquisire la vista focalizzata sul camper posizionando il trasduttore leggermente lateralmente all'apice reale. Effettuare regolazioni fini fino ad ottenere il piano massimale. Spostare la piattaforma leggermente caudalmente, se necessario. In questa vista, l'ombra dello sterno è posizionata nel setto e il muro libero del camper è chiaramente visibile.
      5. Assicurarsi che il camper, gli atri destri (RA) e la valvola tricuspide (TV) siano visibili nella finestra acustica.
         NOTA: se la camera RV è molto dilatata, la camera BT potrebbe non essere completamente visibile. Tenendo manualmente il trasduttore è possibile regolare con precisione l'angolo del trasduttore per migliorare la visualizzazione del camper.
      6. Assicurarsi che il camper non sia scorciato e che il tratto di deflusso BT non sia aperto.
      7. Premere Cine Store per registrare i dati. Esempi di B-mode nelle immagini apicali a quattro camere focalizzate sul RV sono mostrati in Figura 3A,B; queste immagini vengono utilizzate per analizzare l'area atriale destra (RAA), l'area diastolica terminale RV (RVEDA) e l'area end-sistolica RV (RVESA).
      8. Posizionare il cursore M-mode attraverso l'anello tricuspide sulla parete libera del camper. Assicurati di avere un orientamento ottimale dell'immagine per evitare la sottostima delle velocità. Premere Aggiornamento e Cine Store per registrare i dati.
         NOTA: Esempi di immagini del movimento dell'anulus tricuspide sono mostrati nella Figura 4A,B; queste immagini sono utilizzate per analizzare l'escursione sistolica del piano anulare tricuspide (TAPSE).
      9. Premere B-Mode e quindi premere Color per facilitare l'identificazione del flusso attraverso il televisore. Regola la velocità per ottimizzare l'aliasing, in modo che sia visibile il punto di velocità più alto. Aumentare la frequenza dei fotogrammi diminuendo le dimensioni della casella dell'immagine Doppler a colori.
      10. Premere PW per quantificare lo spettro del flusso sanguigno. Aumentare al massimo le dimensioni del gate del volume del campione.
      11. Se necessario, regolare la velocità della linea di base e il guadagno Doppler.
      12. Allineare l'angolo PW parallelamente alla direzione dell'afflusso del camper. Posizionare il volume del campione alla massima velocità (punto di aliasing) o sulla punta del foglietto tricuspide.
          NOTA: l'imaging delle velocità di afflusso della tricuspide può essere difficile; Può essere necessaria una regolazione fine della posizione del trasduttore.
      13. Premere Aggiorna per visualizzare le velocità di afflusso della tricuspide.
      14. Premere Cine Store per registrare i dati. Esempi di immagini tricuspidi PW Doppler sono mostrati in Figura 5A,B; queste immagini vengono utilizzate per analizzare la velocità del flusso sanguigno attraverso il televisore durante il riempimento diastolico precoce (E), la velocità del flusso sanguigno attraverso il televisore durante il riempimento diastolico tardivo (A), il tempo di apertura della chiusura tricuspide (TCO) e il tempo di espulsione (ET).
      15. Tornare alla modalità B e premere Tissue. Regolare leggermente la piattaforma per assicurarsi che l'anulus tricuspide sia chiaramente visibile e posizionare la porta del volume del campione Doppler tissutale sull'anello tricuspide sulla parete libera del camper. Aumentare il gate del volume del campione alla larghezza massima.
      16. Se necessario, regolare la velocità della linea di base e il guadagno Doppler.
      17. Premere Aggiorna per visualizzare l'immagine Doppler tissutale.
      18. Premere Cine Store per registrare i dati. Esempi di immagini Doppler tissutali sono mostrati in Figura 6A,B; queste immagini sono utilizzate per analizzare la velocità anulare della tricuspide alla diastole precoce (E'), la velocità anulare della tricuspide alla diastole tardiva (A') e la velocità anulare della tricuspide alla sistole (S').
          NOTA: TAPSE e tissue doppler sono sempre misurati sulla parete libera del camper e non sul setto interventricolare.
4. Analisi delle immagini
   1. Eseguire l'analisi delle immagini offline utilizzando il software compatibile con lo strumento (vedere Tabella dei materiali).
   2. Evitare le aree in cui si verifica l'ispirazione per tutte le misurazioni e prendere sempre almeno tre misurazioni per ogni parametro da analizzare.
   3. Vista dell'asse lungo parasternale modificata del ventricolo destro M-mode
      1. Selezionare un'immagine ottenuta dalla vista dell'asse lungo parasternale modificata del modo M ventricolare destro e analizzare RVIDd (mm), RVID (mm) e RVFWT (mm).
      2. Selezionate Profondità (Depth) dagli strumenti di misurazione generici.
      3. Tracciare il diametro interno della camera RV alla diastole e alla sistole (Figura 1C) ed etichettare le misurazioni rispettivamente come RVIDd e RVID.
      4. Selezionate lo strumento profondità per misurare lo spessore della parete libera RV. Allineare il cursore con il picco dell'onda R dell'ECG e tracciare la parete alla diastole finale (Figura 1C). Escludere le trabecolazioni RV e il muscolo papillare dal bordo endocardico RV, se presente, per misurare con precisione lo spessore della parete RV. Escludere anche il grasso epicardico, se presente, per evitare misurazioni erroneamente aumentate.
         NOTA: le trabecolazioni RV e il muscolo papillare si mostrano come linee interrotte che seguono il movimento della parete del camper. Le misurazioni RVIDd, RVID e RVFWT verranno visualizzate nel report nella sezione del pacchetto generico. Quando c'è un ispessimento significativo del pericardio, la misurazione della parete del camper può essere difficile; Pertanto, selezionare attentamente l'area di analisi.
   4. Modalità B fotovoltaica
      1. Selezionare un'immagine ottenuta dalla modalità B PV e analizzare il diametro FV (mm).
      2. Selezionare Funzione RV e PV dal menu a discesa del pacchetto cardiaco.
      3. Selezionare PV diam e scegliere un telaio in cui la valvola è aperta. A livello della valvola, tracciare la distanza da parete a parete, evitando l'anello della valvola (Figura 2A).
         NOTA: le misurazioni verranno visualizzate nel rapporto nella sezione Funzione RV e PV.
   5. PV PW Doppler
      1. Selezionare un'immagine ottenuta dal PV PW Doppler per analizzare PET (ms), PAT (ms), PV PSV (mm/s), HR (battiti al minuto), CL (ms), rapporto PAT/PET, gittata cardiaca (PV CO; mL/min), volume della corsa (PV SV; μL) e rapporto PAT/CL.
      2. Selezionare RV and PV Function (Funzione RV e PV) dal menu a discesa del pacchetto cardiaco e scegliere almeno tre velocità PA rappresentative.
      3. Selezionare PAT e tracciare la velocità del flusso PA a partire dal punto di accelerazione e termina al picco della velocità.
      4. Selezionare PET e iniziare la misurazione dal punto di accelerazione e terminare quando il segnale raggiunge la linea di base.
      5. Selezionare PV peak vel, posizionare il cursore nel punto di massima velocità e fare clic con il pulsante sinistro del mouse.
      6. Per ottenere la misura dell'integrale del tempo di velocità del PV (PV VTI), scegliete l'opzione negativa sotto lo strumento Vevo di picco.
         NOTA: la sensibilità di rilevamento può essere modificata, ma deve essere mantenuto un valore costante per tutto lo studio.
      7. Selezionare PV VTI dal menu a discesa. Iniziare la misurazione facendo clic con il pulsante sinistro del mouse sull'inizio del picco e terminare facendo clic con il pulsante destro del mouse alla fine del picco per completare la misurazione. Regolate il contorno del picco spostando le linee in base alle esigenze.
      8. Posizionare il cursore su una misurazione VTI PV e fare clic con il pulsante destro del mouse per selezionare Proprietà, quindi abilitare la misurazione FC nell'opzione parametri. Ripetere questo passaggio per tutte e tre le misurazioni VTI PV.
      9. Selezionare Tempo dagli strumenti di misurazione generici e tracciare il tempo dal punto di accelerazione di un ciclo al punto di accelerazione del ciclo successivo per calcolare il CL (Figura 2B).
         NOTA: le misurazioni verranno visualizzate nel rapporto nella sezione Funzione RV e PV. Il rapporto PAT/PET, PV CO e PV SV sono calcolati dal software dello strumento.
   6. Vista apicale a quattro camere focalizzata su RV B-mode
      1. Selezionare un'immagine ottenuta dalla vista apicale a quattro camere focalizzata su RV B-mode per analizzare RAA (mm 2), RVEDA (mm 2), RVESA (mm²) e la variazione dell'area frazionaria RV [RVFAC = (RVEDA-RVESA)/RVEDA, %].
      2. Selezionare SAX (asse corto parasternale) dal menu a discesa del pacchetto cardiaco.
      3. Scegli un'immagine in modalità B alla diastole finale dalla vista apicale a quattro camere focalizzata su RV. Assicurarsi che l'intero camper sia in vista, compresi l'apice e la parete laterale.
      4. Selezionare ENDOarea;d e tracciare l'endocardio RV dall'anulus, lungo la parete libera fino all'apice, e poi di nuovo all'anello lungo il setto interventricolare, escluse le trabecolazioni se presenti.
      5. Scegliere un'immagine B-mode a end-systole, selezionare ENDOarea;s dalla finestra a discesa SAX B-mode e ripetere la traccia del RV. Utilizzando la stessa immagine, selezionare l'area 2D dagli strumenti di misurazione generici e tracciare la RA seguendo l'endocardio ed escludendo la vena cava e l'appendice RA. Anche l'area tra i lembi della valvola tricuspide e l'anulus è esclusa (Figura 3).
      6. Ripetere la misurazione dell'area ENDO alla diastole e alla sistole e la misurazione dell'area RA in due immagini aggiuntive.
         NOTA: le misurazioni dell'area RV in diastole e sistole verranno visualizzate nel rapporto nella sezione Modalità SAX-B. L'area RA verrà visualizzata sotto le misure del pacchetto generico. RVFAC è calcolato utilizzando la formula RVFAC = (RVEDA-RVESA)/RVEDA¹⁰.
   7. M-mode nella parte laterale dell'anulus tricuspide
      1. Selezionare un'immagine M-mode ottenuta dalla parte laterale dell'anello tricuspide per analizzare il TAPSE (mm).
      2. Selezionare Profondità dagli strumenti di misurazione generici e scegliere una regione di almeno tre siti cardiaci consecutivi privi di interferenze inspiratorie.
      3. Tracciare la distanza dalla diastole terminale alla sistole di picco del segmento anulare RV in tre cicli cardiaci consecutivi (Figura 4).
         NOTA: le misurazioni verranno visualizzate nel report nella sezione relativa al pacchetto generico.
   8. TV PW Doppler
      1. Selezionare un'immagine ottenuta dal doppler TV PW per analizzare l'indice di prestazione miocardica E (mm/s), A (mm/s), TCO (ms), ET (ms) e RV [RVMPI = (TCO-ET)/ET]¹¹.
      2. Selezionare TV Flow dal menu a discesa della confezione cardiaca e scegliere almeno tre velocità TV rappresentative.
      3. Selezionare TV E (riempimento iniziale tricuspide), posizionare il cursore nel punto di velocità più alta dell'onda E e fare clic con il pulsante sinistro del mouse; Una linea viene tracciata dalla velocità massima alla linea di base. Allo stesso modo, selezionare TV A (riempimento tardivo tricuspide), posizionare il cursore alla massima velocità dell'onda A e fare clic con il pulsante sinistro del mouse; un'altra linea viene tracciata dalla velocità massima alla linea di base (Figura 5).
      4. Per misurare il tempo di espulsione (ET), selezionare lo strumento Tempo dagli strumenti di misurazione generici e misurare il tempo dall'inizio (bordo d'attacco) alla cessazione (bordo finale) dell'afflusso di tricuspidi (un'area in cui il flusso viene espulso). Etichettare le misurazioni come ET (Figura 5).
      5. Per misurare il tempo TCO, selezionare lo strumento Tempo e tracciare il tempo dalla fine dell'onda tricuspide A di un ciclo all'inizio dell'onda tricuspide E del ciclo successivo. Etichettare le misurazioni come TCO (Figura 5).
         NOTA: le misurazioni di TV E e TV A verranno visualizzate nel rapporto nella sezione Flusso TV. Le misurazioni ET e TCO verranno visualizzate sotto le misurazioni del pacchetto generico. RVMPI è calcolato come (TCO-ET)/ET11. E, ET e TCO vengono misurati con un intervallo R-R costante per ridurre al minimo l'errore. Le misurazioni ET possono anche essere eseguite dal bordo centrale al bordo d'uscita; La coerenza nel modo in cui la misurazione viene acquisita durante l'analisi è molto importante.
   9. RV Doppler laterale tricuspide anulus
      1. Selezionare un'immagine ottenuta dal Doppler del tessuto andulo tricuspide laterale RV per analizzare il rapporto E' (mm/s), A' (mm/s), S' (mm/s) e E/E'.
      2. Selezionare TV Flow dal menu a discesa del pacchetto cardiaco e scegliere almeno tre velocità rappresentative del tessuto a parete libera.
      3. Selezionare TV LW E, posizionare il cursore nel punto di massima velocità dell'onda E' e fare clic con il pulsante sinistro del mouse; Una linea viene tracciata dalla velocità massima alla linea di base. Allo stesso modo, selezionare TV LW A, posizionare il cursore nel punto di velocità più alta dell'onda A' e fare clic con il pulsante sinistro del mouse; un'altra linea viene tracciata dalla velocità massima alla linea di base (Figura 6).
      4. Selezionare MV Flow dal menu a discesa del pacchetto cardiaco e selezionare S WAVE.
      5. Posizionare il cursore alla massima velocità sistolica durante la fase di espulsione, senza sovraccaricare l'inviluppo Doppler, e fare clic con il pulsante sinistro; viene tracciata una linea dalla velocità massima alla linea di base (Figura 6).
         NOTA: le misurazioni verranno visualizzate nel report nelle sezioni Flusso TV e Flusso MT. Il rapporto E/E' viene calcolato manualmente.
5. Autopsia
   1. Eutanasia dei ratti mediante dissanguamento sotto sovradosaggio di isoflurano al giorno di studio 24 post-somministrazione MCT seguendo il protocollo approvato istituzionalmente.
   2. Rimuovere il blocco cuore-polmone e infondere delicatamente attraverso la vascolarizzazione con soluzione salina ghiacciata fino a quando il perfusato non si esaurisce. Separare il cuore e i polmoni e rimuovere la soluzione salina in eccesso.
   3. Pesare ogni organo separatamente.
   4. Rimuovere gli atri e scartare.
   5. Separare il ventricolo sinistro con il setto (LV + S) dal camper e pesare i ventricoli separatamente.
   6. Rimuovere la tibia sinistra e separarla dal tessuto molle.
   7. Ottenere una misurazione longitudinale della tibia utilizzando un calibro digitale (vedi Tabella dei materiali).
   8. Smaltire il cuore, i polmoni e la tibia sezionati con il resto della carcassa.
      NOTA: Il peso cardiaco (HW), il peso polmonare (LW), il peso LV + S e il peso RV sono normalizzati dalla lunghezza della tibia (TL). L'ipertrofia RV è valutata dall'indice di Fulton, dove il peso RV è normalizzato dal peso LV+S [indice di Fulton = RV/(LV+S)]¹².

In questo studio, i ratti trattati con MCT sono stati utilizzati come modello di IPA. L'analisi ecocardiografica è stata eseguita il giorno di studio 23 dopo la somministrazione di MCT e tutte le misurazioni e i calcoli rappresentavano medie di tre cicli consecutivi. I parametri ecocardiografici ottenuti da ratti di controllo (veicolo: acqua deionizzata) e trattati con MCT (60 mg/kg) sono mostrati nella Tabella 1.

Le immagini rappresentative della vista PLAX nei ratti trattati con MCT e MCT sono mostrate nella Figura 1A. Queste immagini sono utilizzate come una valutazione iniziale della posizione del cuore e della morfologia del ventricolo sinistro. Le valutazioni quantitative del RV sono ottenute in una vista PLAX modificata, perché ciò consente la visualizzazione del RV (Figura 1B). Nella vista PLAX modificata, i ratti trattati con MCT mostrano un ventricolo destro allargato e il ventricolo sinistro appare spostato dalla sua posizione rispetto ai ratti di controllo (Figura 1B). Il modo M è ottenuto nella vista PLAX modificata nell'area più ampia del camper e utilizzato per misurare RVIDd, RVID e RVFWT (Figura 1C). RVIDd, RVID e RVFWT vengono misurati, esclusa la trabecolazione nella parete, e RVFWT è ottenuto al picco dell'onda R dell'ECG. Come previsto, un aumento significativo di RVIDd, RVID e RVFWT è stato osservato nei ratti trattati con MCT (Figura 1C e Tabella 1), indicando la dilatazione del RV e l'ispessimento della parete libera del RV.

L'imaging Doppler viene utilizzato per misurare le velocità del flusso PA (Figura 2B). Nei ratti di controllo, il flusso polmonare mostra una forma a V simmetrica, con una velocità di picco che si verifica a metà sistole (Figura 2B, pannello superiore). Al contrario, nei ratti trattati con MCT, la velocità di picco è più lenta e si verifica prima nella sistole, con conseguente PAT significativamente ridotto e rapporti PAT/PET e PAT/CL più piccoli (Tabella 1). Inoltre, i ratti trattati con MCT mostrano una tacca nella sistole tardiva (Figura 2B, pannello inferiore). PV PW Doppler viene utilizzato per misurare il PV VTI (Figura 2B); PV CO e PV SV sono calcolati utilizzando rispettivamente le misurazioni del diametro VTI e PV . PV CO e PV SV sono significativamente più bassi nei ratti trattati con MCT (Tabella 1), indicando una funzione sistolica compromessa. L'HR è ottenuta dalle misurazioni PV PW Doppler ed è comparabile tra i ratti di controllo e quelli trattati con MCT (Tabella 1).

La vista apicale a quattro camere focalizzata su RV viene utilizzata per misurare RVEDA, RVESA e RAA (Figura 3) e RVFAC viene calcolato da RVEDA e RVESA. Come affermato in precedenza, le trabecolazioni nel muro, se presenti, devono essere escluse da queste misurazioni. La RVFAC è significativamente diminuita nei ratti trattati con MCT (Tabella 1), suggerendo una disfunzione sistolica RV. I ratti trattati con MCT mostrano anche una dilatazione RA a causa dell'aumento della pressione PA (Figura 3A, B, pannelli di destra e Tabella 1). In condizioni normali, la cavità LV ha una pressione più elevata rispetto al RV, con conseguente curvatura settale del LV durante tutto il ciclo cardiaco (Figura 3A, B, pannelli di sinistra). Quando la pressione RV aumenta patologicamente in PAH, questa curvatura normale viene persa e il setto interventricolare appare "appiattito"¹³, come mostrato in Figura 3A,B (pannelli di destra). La vista apicale a quattro camere focalizzata su RV viene anche utilizzata per misurare TAPSE dall'interrogazione M-mode dell'anulus tricuspide (Figura 4). La TAPSE è significativamente ridotta nei ratti trattati con MCT (Figura 4B e Tabella 1), suggerendo una compromissione della funzione RV.

La funzione diastolica viene valutata dalla valutazione PW Doppler del flusso TV e del tessuto anulare laterale TV laterale. I ratti trattati con MCT mostrano un'onda E e RVMPI significativamente più elevate e una tendenza verso un aumento del rapporto E/E' (Figura 5 e Tabella 1), suggestivo di una compromissione della funzione diastolica. La vista Doppler del tessuto anulus TV viene utilizzata anche per misurare E' e S' (Figura 6B). I ratti trattati con MCT mostrano S' significativamente più lento, confermando la diminuzione della funzione sistolica RV (dimostrata anche da una riduzione di PV CO e PV SV). Non si osserva alcuna variazione significativa dell'E' nei ratti trattati con MCT. A e A' possono anche essere ottenuti dal flusso TV PW Doppler e dal tessuto anulare laterale laterale TV Doppler, rispettivamente. Questi parametri non sono discussi in questo articolo.

Le misurazioni della massa tissutale cardiaca al prelievo terminale e le analisi ecocardiografiche supportano l'ipertrofia RV nei ratti trattati con MCT rispetto ai ratti di controllo. Come mostrato nella Tabella 2, l'indice di Fulton e il rapporto RV/TL sono significativamente aumentati nei ratti trattati con MCT rispetto ai ratti di controllo. Inoltre, i ratti trattati con MCT mostrano un aumento del rapporto LV + S / TL, indicando ipertrofia LV. I ratti trattati con MCT mostrano anche un aumento del rapporto LW / TL, suggerendo edema polmonare.

Figura 1: Viste dell'asse lungo parasternale (PLAX). (A) Immagini rappresentative di PLAX convenzionale per visualizzare il deflusso ventricolare sinistro (LV), gli atri sinistri (LA), gli atri destri (RA) e la valvola aortica (AV) in un ratto di controllo (pannello di sinistra) e di ratto trattato con monocrotalina (MCT) (pannello di destra). (B) Immagini rappresentative della vista PLAX modificata per visualizzare il tratto di efflusso ventricolare destro (RV), il setto interventricolare (IVS), il LV e l'AV in un ratto di controllo (pannello di sinistra) e ratto trattato con MCT (pannello di destra). Nei ratti, la linea del volume del campione M-mode è solitamente posizionata tra l'ombra di due vertebre contigue (mostrate con frecce blu). (C) Esempi di misurazioni in modo M in un ratto di controllo (pannello superiore) e in un ratto trattato con MCT (pannello inferiore). Le misurazioni includono lo spessore della parete libera da RV (RVFWT), il diametro interno del RV durante la diastole (RVIDd) e il diametro interno del RV durante la sistole (RVID). Per una facile visualizzazione, vengono mostrate le misurazioni di un solo ciclo cardiaco. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Diametro PV e velocità di flusso dell'arteria polmonare. (A) Immagini rappresentative della vista PLAX modificata per visualizzare l'arteria polmonare e misurare il diametro della valvola polmonare (PV) in un ratto di controllo (pannello di sinistra) e di ratto trattato con monocrotalina (MCT) (pannello di destra). (B) Il tempo di eiezione polmonare (PET) viene misurato a partire dal punto di accelerazione fino al punto di ritorno al basale in un ratto di controllo (pannello superiore) e in un ratto trattato con MCT (pannello inferiore). Il tempo di accelerazione polmonare (PAT) è l'intervallo di tempo tra il punto di accelerazione e il picco di velocità. La velocità sistolica di picco della valvola polmonare (PV PSV) viene misurata al picco del flusso Doppler. L'integrale del tempo di velocità del PV (PV VTI) viene tracciato in blu utilizzando l'opzione software. La lunghezza del ciclo cardiaco (CL) viene misurata dal punto di accelerazione di un ciclo al punto di accelerazione del ciclo successivo. L'intaglio tardivo della sistole è osservato nei ratti trattati con MCT. Le frecce indicano i tre cicli consecutivi considerati per i calcoli. Le misurazioni rappresentative sono mostrate in diversi cicli per una facile visualizzazione, ma tutte le misurazioni sono state prese in ciascuno dei tre cicli. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Vista apicale a quattro camere focalizzata su RV. (A) Immagini rappresentative dell'area ventricolare destra end-sistolica (RVESA) e dell'area atriale destra (RAA) in un ratto di controllo (pannello di sinistra) e monocrotalino (MCT) trattato con ratto (pannello destro). I pannelli superiori mostrano le immagini senza tracciatura e i pannelli inferiori mostrano le aree tracciate. Le misurazioni sono state effettuate utilizzando gli strumenti ENDOarea;s e 2D area per calcolare rispettivamente RVESA e RAA. (B) Immagini campione dell'area diastolica terminale del ventricolo destro (RVEDA) utilizzando lo strumento software ENDOarea;d in un ratto di controllo (pannello di sinistra) e di un ratto trattato con MCT (pannello di destra). I pannelli superiori mostrano le immagini senza tracciatura e i pannelli inferiori mostrano le aree tracciate. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Escursione sistolica del piano anulare tricuspide (TAPSE). (A) Pannello superiore: vista apicale a quattro camere focalizzata sul ventricolo destro in un ratto di controllo. Vengono visualizzati il ventricolo destro (RV), gli atri retti (RA) e la valvola tricuspide (TV). Pannello inferiore: interrogazione M-mode dell'anulus tricuspide per misurare TAPSE in ratti di controllo. (B) Pannello superiore: vista apicale a quattro camere focalizzata sul ventricolo destro in un ratto trattato con monocrotalina (MCT). Pannello inferiore: interrogazione M-mode dell'anulus tricuspide per misurare TAPSE in un ratto trattato con MCT. Le frecce indicano le tre misurazioni consecutive che sono state prese in considerazione per i calcoli. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5: Doppler ad onda pulsata dell'afflusso di tricuspidi. Esempio di registrazioni Doppler pulsate dell'afflusso di tricuspidi per misurare la velocità di afflusso del sangue attraverso la valvola tricuspide durante il riempimento diastolico precoce (E, in blu), il riempimento diastolico tardivo (A, in blu), il tempo di apertura della tricuspide (TCO) e il tempo di eiezione (ET) in (A) un ratto di controllo e in (B) un ratto trattato con monocrotalina (MCT). Le frecce indicano i tre cicli consecutivi considerati per i calcoli. Le misurazioni rappresentative sono mostrate in un ciclo per una facile visualizzazione, ma tutte le misurazioni sono state prese in ciascuno dei tre cicli. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 6: Doppler tissutale dell'anulus tricuspide laterale. Immagini campione Doppler tissutale della velocità miocardica sistolica di picco all'anulus tricuspide laterale (S', in blu) e della velocità di rilassamento miocardico di picco alla diastole precoce (E', in blu) e alla diastole tardiva (A', in blu) in (A) un ratto di controllo e in (B) un ratto trattato con monocrotalina (MCT). Le frecce indicano i tre cicli consecutivi considerati per i calcoli. Le misurazioni rappresentative sono mostrate in un ciclo per una facile visualizzazione, ma tutte le misurazioni sono state prese in ciascuno dei tre cicli. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella 1: Parametri ecocardiografici del ventricolo destro al giorno 24 post-MCT (MCT Group) o somministrazione del veicolo (Control Group) nei ratti Sprague Dawley. Dati presentati come media ± SD. Il t-test di Student è stato utilizzato per analizzare i dati. *p < 0,05. Abbreviazioni: Monocrotalina (MCT), diametro interno RV durante la diastole (RVIDd), diametro interno RV durante la sistole (RVID), spessore della parete libera RV (RVFWT), area atriale destra (RAA), area diastolica terminale del ventricolo destro (RVEDA), area ventricolare destra end-sistolica (RVESA), variazione dell'area frazionaria RV (RVFAC), tempo di eiezione polmonare (PET), tempo di accelerazione polmonare (PAT), velocità sistolica di picco polmonare (PV PSV), gittata cardiaca (PV CO), volume della corsa (PV SV), frequenza cardiaca (HR), lunghezza del ciclo cardiaco (CL), escursione sistolica del piano anulare tricuspide (TAPSE), tempo di eiezione (ET), tempo di apertura della chiusura tricuspide (TCO), indice di prestazione miocardica RV (RVMPI), velocità anulare della tricuspide alla sistole (S'), velocità del flusso sanguigno attraverso il televisore durante il riempimento diastolico precoce (E) e velocità anulare tricuspide alla diastole precoce (E').

Tabella 2: Misurazioni degli organi al giorno 24 dopo la somministrazione di MCT (gruppo MCT) o veicolo (gruppo di controllo) nei ratti Sprague Dawley. Dati presentati come media ± SD. Il t-test di Student è stato utilizzato per analizzare i dati. *p < 0,05. Abbreviazioni: Monocrotalino (MCT), peso cardiaco (HW), peso polmonare (LW), ventricolo destro (RV), ventricolo sinistro (LV) e lunghezza della tibia (TL).

La valutazione ecocardiografica del RV è un prezioso strumento di scoperta per lo screening dell'efficacia di nuovi trattamenti in modelli animali di PAH. Una caratterizzazione approfondita della struttura e della funzione del RV è necessaria come nuovi bersagli nel trattamento del rimodellamento dei RV con indirizzo PAH ^4,14. Questo studio descrive un protocollo dettagliato che consente la caratterizzazione di successo della struttura e della funzione del camper.

La complessa geometria strutturale e il posizionamento dietro lo sterno rendono difficile la caratterizzazione ecocardiografica del camper; pertanto, le viste ecocardiografiche modificate vengono utilizzate per facilitare la visualizzazione RV e per aiutare nell'identificazione precisa dei bordi endocardici RV durante le analisi. A questo proposito, PLAX modificato viene utilizzato per una migliore visualizzazione e per ottenere le velocità di flusso polmonare e le misurazioni morfologiche del camper. Altri protocolli hanno descritto l'uso di viste parasternali ad asse corto per misurare il flusso polmonare e lo spessore della parete RV¹⁵; tuttavia, l'uso di PLAX modificato consente di ottenere viste rappresentative coerenti delle velocità del flusso polmonare e migliora anche la definizione della parete libera del camper. Inoltre, la vista apicale a quattro camere focalizzata su RV viene utilizzata per migliorare la visualizzazione delle pareti della camera RA e RV e ottenere costantemente misurazioni dei parametri sistolici e diastolici RV.

I seguenti parametri sono raccomandati per valutare la funzione sistolica RV: TAPSE, RVFAC, RIMP e S'. La TAPSE è una misura della contrazione longitudinale del RV ed è stata riportata per essere correlata al grado di disfunzione RV¹⁶; tuttavia, TAPSE valuta solo la contrazione longitudinale senza prendere in considerazione la componente radiale della contrazione che diventa rilevante in un RV¹¹ dilatato. Nonostante i suoi limiti, TAPSE rimane un parametro ottenuto di routine, in quanto è più facile da acquisire rispetto a RVFAC e RIMP; tuttavia, una valutazione completa del grado di disfunzione sistolica dovrebbe includere la valutazione di S', RIMP, e RVFAC. S' è facilmente misurabile, affidabile e riproducibile, tuttavia valuta solo la funzione sistolica longitudinale. Nell'uomo, RVFAC correla bene con la frazione di eiezione RV (EF)¹⁰ ed è una misura più accurata della funzione RV rispetto a TAPSE. RIMP, definito come [TCO-ET]/ET, è un indice delle prestazioni globali della RV, riflette sia la funzione sistolica che diastolica RV ed è un marker prognostico nei pazienti con PAH¹⁷. RIMP è misurato da TV PW Doppler poiché può essere ottenuto più facilmente, sebbene possa anche essere misurato dal Doppler tissutale dell'anulus tricuspide laterale. È importante utilizzare diversi indici della funzione sistolica RV quando si valuta l'efficacia del trattamento farmacologico nei modelli animali di PAH per superare la limitazione di ciascuna misurazione. L'uso del RVEF come misura della funzione sistolica non è raccomandato a causa della complessità della geometria RV, che porta a volumi grossolanamente sottostimati¹⁰.

La funzione diastolica RV nei ratti è un'area poco studiata a causa delle difficoltà tecniche nell'ottenere le velocità di flusso TV e il Doppler del tessuto anulus laterale TV. Utilizzando la vista apicale a quattro camere focalizzata su RV come indicato in questo protocollo, è possibile ottenere viste ecocardiografiche coerenti con una buona definizione del bordo endocardico. Il rapporto E/E' e RAA devono essere usati come misura della funzione diastolica RV nella disfunzione precoce del RV. L'analisi del ceppo è diventata un potente strumento per accedere alla disfunzione sistolica del ventricolo sinistro nelle fasi iniziali della disfunzione del ventricolo sinistro; tuttavia, solo pochi studi utilizzano questo tipo di analisi per valutare il RV^14,18, a causa delle difficoltà incontrate nella visualizzazione dell'intera parete e nell'ottenere immagini ecocardiografiche di alta qualità necessarie per l'analisi della deformazione. Sebbene le analisi della deformazione non siano state eseguite in questo studio, la qualità delle immagini ottenute seguendo questo protocollo è sufficiente per eseguire questo tipo di analisi, se necessario.

Infine, questo protocollo fornisce una descrizione dettagliata delle viste ecocardiografiche necessarie per valutare la morfologia RV e RA, nonché per caratterizzare la funzione sistolica e diastolica RV. Questi dati forniscono una valutazione migliorata dell'efficacia di nuovi composti per interrompere lo sviluppo di PAH in modelli animali di roditori.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo lavoro è stato supportato da NHLBI K01 HL155241 e AHA CDA849387 assegnato all'autore P.C.R.