Quantificazione dell'area della sezione trasversale del nervo ottico sulla risonanza magnetica: un nuovo protocollo che utilizza il software Fiji

Abbiamo fornito un protocollo dettagliato per un metodo standardizzato di valutazione e quantificazione del nervo ottico utilizzando la risonanza magnetica, utilizzando una sequenza di imaging ampiamente disponibile e un software ad accesso aperto per l'analisi delle immagini. Seguire questo protocollo standardizzato fornirebbe dati significativi per il confronto tra diversi pazienti e diversi studi.

La valutazione del nervo ottico è un aspetto importante della diagnosi e del follow-up del glaucoma. Questo progetto descrive un protocollo per una metodologia unificata di valutazione e quantificazione della sezione trasversale del nervo ottico utilizzando la risonanza magnetica 3 T per l'acquisizione delle immagini e il software Fiji di ImageJ per la quantificazione dell'elaborazione delle immagini. L'acquisizione delle immagini è stata eseguita utilizzando la risonanza magnetica 3 T, con istruzioni adeguate per il paziente per garantire una fissazione diretta durante l'imaging. È stata utilizzata una sequenza soppressa dal grasso ponderata T2. Un taglio coronale preso 3 mm dietro il globo e perpendicolare all'asse del nervo ottico dovrebbe essere caricato sul software. Utilizzando la funzione di soglia, l'area della sostanza bianca del nervo ottico viene selezionata e quantificata, eliminando così la distorsione di misurazione interindiso. Abbiamo anche descritto i limiti normali per l'area trasversale del nervo ottico in base all'età, sulla base della letteratura precedentemente pubblicata. Abbiamo usato il protocollo descritto per valutare il nervo ottico di un sospetto paziente con glaucoma. L'area della sezione trasversale del nervo ottico è risultata entro i limiti normali, un risultato ulteriormente confermato dalla tomografia a coerenza ottica del nervo ottico.

Il glaucoma è una neuropatia ottica che è considerata la causa più comune di cecità irreversibile¹. Nonostante ciò, è ancora poco compreso in termini di fisiopatologia e diagnosi, senza un unico riferimento standard per stabilire la diagnosi². Secondo il National Institute for Health and Care Excellence (NICE) la diagnosi di glaucoma primario ad angolo aperto (POAG) richiede la valutazione di più domini, tra cui la valutazione del disco ottico all'esame del fondo oculare o l'imaging della tomografia a coerenza ottica (OCT), la valutazione del campo visivo e la misurazione della pressione intraoculare ³. L'idea alla base della diagnosi del glaucoma è stabilire la presenza di neuropatia ottica in progresso, che può essere fatto quantitativamente su OCT⁴. A questo proposito, la risonanza magnetica può anche essere utilizzata per la valutazione del nervo ottico e la quantificazione della sua area di sostanza bianca⁵, ma affinché ciò sia clinicamente significativo, il protocollo utilizzato nella quantificazione della sostanza bianca del nervo ottico deve essere standardizzato. Inoltre, un protocollo dovrebbe anche accogliere la variazione interisecuente, un fattore che potrebbe influenzare l'accuratezza in diverse malattie⁶.

La valutazione del nervo ottico nel glaucoma viene valutata in modo ottimale tramite imaging oftalmico, incluso l'OCT, in cui viene valutata la parte più anteriore del nervo ottico (ad esempio, il disco ottico). D'altra parte, l'uso della risonanza magnetica per la valutazione del nervo ottico di solito valuta la parte retrobulbare del nervo ottico a varie distanze dal globo. Diversi studi hanno trovato una forte correlazione tra la valutazione del disco ottico utilizzando OCT e MRI^7,8. Tuttavia, non esiste ancora un protocollo unificato per la valutazione e la quantificazione del nervo ottico sulla risonanza magnetica. Delineare il bordo del nervo ottico sulla risonanza magnetica è stato utilizzato per quantificare la sua area di sezione trasversale⁵. Tuttavia, questo metodo ha una notevole variabilità inter-rater, in quanto deve essere fatto da un valutatore esperto e richiede molto tempo per delineare. L'obiettivo dell'attuale progetto era quello di fornire un protocollo per una metodologia unificata per la valutazione e la quantificazione della sezione trasversale del nervo ottico utilizzando la risonanza magnetica 3 T per l'acquisizione delle immagini e il software Fiji di ImageJ per l'elaborazione e la quantificazione delle immagini.

Il seguente studio è stato approvato dal comitato di ricerca e dal comitato di revisione istituzionale dell'ospedale dell'Università della Giordania. Il seguente protocollo descriverà la tecnica di imaging utilizzata per acquisire immagini MRI, seguita dall'elaborazione delle immagini e dalla quantificazione del nervo ottico utilizzando il software Fiji.

1. Acquisizione di immagini MRI

NOTA: l'acquisizione dell'immagine MR è stata effettuata utilizzando una risonanza magnetica a 3 Tesla (3 T) per eseguire la sequenza di soppressione del grasso multiplanare pesata T2 (Tabella dei materiali).

1. Spiegare completamente l'esame al paziente. Di seguito sono riportate istruzioni e spiegazioni che devono essere menzionate al paziente.
   1. Spiega al paziente che dovranno cambiare i vestiti e indossare un abito speciale per l'imaging.
   2. Fare in modo che i pazienti rimuova qualsiasi eyeliner usurato in quanto può produrre artefatti (specialmente a 3 T) a causa della conduttività elettrica del pigmento di ossido di titanio.
   3. Assicurarsi che il paziente non abbia controindicazioni per eseguire la risonanza magnetica⁹:
      1. Chiedi al paziente di eventuali materiali metallici, che potrebbero includere maschere per il viso, piercing, arti artificiali, impianti dentali magnetici, clip per aneurisma dell'arteria cerebrale.
      2. Chiedere al paziente informazioni sui corpi estranei intraoculari metallici. Per questo, chiedere al paziente se hanno saldato senza un adeguato equipaggiamento protettivo.
      3. Chiedere al paziente di eventuali dispositivi impiantabili che potrebbero essere incompatibili con la risonanza magnetica, inclusi pacemaker e pompe per insulina, farmaci analgesici o pompe chemioterapiche. Oltre a questo, impianti cocleari / impianto auricolare, sistemi di neurostimolazione impiantabili, sistemi di neurostimolazione impiantabili, cateteri con componenti metallici, sono tutti controindicati.
      4. Chiedi al paziente del corpo estraneo metallico lasciato all'interno del loro corpo. Ciò include proiettili, pallini di fucile e schegge di metallo
      5. Chiedi al paziente informazioni su eventuali clip chirurgiche o suture di filo, sostituzione articolare o protesi, filtro della vena cava inferiore (IVC), protesi oculare, stent o dispositivo intrauterino.
      6. Chiedi al paziente se si è fatto un tatuaggio nelle ultime 6 settimane.
      7. Chiedere al paziente se ha subito una procedura di colonscopia nelle ultime otto settimane.
      8. A causa dello spazio ristretto della macchina per la risonanza magnetica, chiedere al paziente se ha la claustrofobia.
         NOTA: La difficoltà potrebbe essere riscontrata con pazienti con alto indice di massa corporea (BMI).
   4. Spiega al paziente che l'esame dovrebbe richiedere 15 minuti, dove il paziente deve rimanere fermo.
2. Dopo aver completato le istruzioni e aver assicurato che il paziente comprenda appieno l'esame, ottenere un consenso firmato.
3. Durante l'acquisizione dell'immagine MRI, posare il paziente supino nella macchina MRI e fissarsi su un bersaglio dritto durante l'imaging senza alcun movimento della testa. Per i pazienti con scarsa acuità visiva, utilizzare uno stimolo sonoro per ottimizzare la fissazione. Metodi più completi per la fissazione comportano la chiusura di un occhio, l'uso di un bersaglio di fissazione centralmente sotto forma di uno schermo LCD che cambia colore e l'uso di lubrificanti oculari.
4. Assicurarsi che il paziente sia consapevole che esiste un pulsante di compressione che può essere premuto se ha bisogno di qualcosa mentre è nella macchina per la risonanza magnetica. Mentre è possibile utilizzare una bobina di testa, una bobina oculare e una bobina orbitale possono essere più adatte per l'imaging oftalmico.
5. Immettere i seguenti parametri per l'acquisizione dell'immagine: una sequenza di soppressione del grasso ponderata T2 (TR = 3000 millisecondi; TE = 90 millisecondi; TE = 100; campo visivo = 16 cm×16 cm; matrice = 296*384; spessore fetta = 3 mm; slice gap = 0,3 mm). L'immagine finale analizzata era un'immagine coronale obliqua di 3 mm dietro il globo. È importante notare che mentre la sequenza di soppressione del grasso ponderata T2 viene generalmente utilizzata per l'imaging del nervo ottico, è possibile utilizzare altre sequenze, tra cui l'ecografia a rotazione rapida T2.
6. Prendi un taglio coronale del nervo ottico ortogonale (cioè perpendicolare) al nervo 3 mm posteriore al globo. Utilizza immagini scout nei piani sagittali trasversali e obliqui per garantire una direzione ottimale del nervo ottico e il posizionamento ottimale della giunzione nervo-globo ottico.
7. Valutare la qualità della fissazione dello sguardo mediante la distribuzione del liquido cerebrospinale attorno al nervo ottico, dove dovrebbe essere distribuito uniformemente attorno al nervo ottico con spessore quasi uguale su tutti i lati.
8. Ripeti il processo per immaginare il nervo ottico per l'altro lato.

2. Analisi delle immagini

1. Scarica il pacchetto di elaborazione delle immagini fiji da (https://imagej.net/Fiji).
2. Carica l'immagine coronale del nervo ottico sul software ImageJ Fiji per l'analisi facendo clic su File dalla barra dei menu, seguito dal pulsante Apri. Scegli l'immagine coronale da elaborare. Trasferisci le immagini al software Fiji senza perdere la qualità dell'immagine durante il trasferimento, poiché la perdita di qualità dell'immagine porterà a risultati di analisi delle immagini inaffidabili.
3. Standardizzare la scala specificando il numero di pixel per unità di lunghezza disegnando una linea retta sulla scala della mappa. Quindi scegliete Imposta scala dalla barra dei menu Analizza. Specificare la lunghezza della linea come appare sulla scala della mappa con l'unione corretta di lunghezza (cioè per lo più mm).
4. Convertire l'immagine in una scala di grigi utilizzando il menu immagine, quindi scegliendo Tipo e 8 bit.
5. Quantificare l'intervallo di intensità dei pixel della sostanza bianca.
   1. Utilizzo dello strumento di selezione Lazo (Plugin | segmentazione | Strumento lazo), selezionare un'area sufficiente di sostanza bianca, assicurandosi di non includere l'area della materia grigia durante la selezione. Abbiamo scoperto che un'area totale selezionata di materia bianca di circa 1000 pixel è sufficiente. Utilizzare lo strumento Analizza e misura per quantificare l'area selezionata.
6. Mostrate lo strumento Istogramma dal menu Analizza, che mostra la distribuzione dell'intensità dei pixel nell'area della sostanza bianca selezionata. Fare clic sulla casella Live per assicurarsi che l'istogramma valuti l'area selezionata. Il grafico sull'istogramma dovrebbe mostrare una normale distribuzione dell'intensità.
7. Calcola l'intervallo di intensità della sostanza bianca come segue:
   Limite inferiore = intensità media - (3* deviazione standard)
   Limite superiore = intensità media + (3* deviazione standard)
8. Aprire lo strumento Soglia dal menu Immagine, seguito dalla funzione Regola. Specificare l'intervallo calcolato dal passaggio precedente. Spuntare solo la funzione di sfondo scuro e specificare l'annotazione in bianco e nero in bianco e nero dall'elenco a discesa, quindi fare clic su Applica. Apparirà la maschera per la sostanza bianca presente all'interno del disco ottico.
9. Utilizzo dello strumento di selezione Lazo (Plugin | segmentazione | Strumento lazo), selezionare l'area nera che rappresenta il disco ottico.
10. Utilizzare la funzione Misura dalla barra dei menu Analizza, che calcolerà l'area contrassegnata dalla funzione di soglia in mm.

Il rapporto tazza-disco per un paziente maschio di 30 anni che si è presentato per un esame oftalmologico di controllo era 0,8 (Figura 1A), che è sospetto e potrebbe essere indicativo di glaucoma. Dopo aver eseguito una tomografia a coerenza ottica per lo spessore dello strato di fibre nervose, abbiamo scoperto che lo spessore del nervo rientrava nei normali limiti di età (Figura 1B). Il paziente è stato programmato per una risonanza magnetica orbitale, in cui è stato ordinato un taglio coronale per la valutazione del nervo ottico ed eseguito secondo il protocollo sopra menzionato.

Abbiamo ottenuto un taglio MRI coronale, 3 mm dietro il disco ottico. L'intensità media della sostanza bianca era 94,372 (SD 7,085), il che ha portato a un intervallo di intensità della sostanza bianca di:

Limite inferiore = 94.372 - 21.255 = 73.117

Limite superiore = 94.372 + 21.255 = 115.627

La Figura 2 mostra l'immagine coronale (Figura 2A), l'immagine coronale dopo aver applicato la soglia della sostanza bianca utilizzando i limiti superiore e inferiore calcolati (Figura 2B) e la sostanza bianca del nervo ottico per la quantificazione (Figura 2C). L'area della sezione trasversale per la sostanza bianca del nervo ottico sinistro era di 6,9 mm² (0,069 cm²), che rientra nei limiti normali per la sua età, come mostrato nella Tabella 1.

Figura 1: Immagine del fondo oculare che mostra un elevato rapporto tazza-disco, che potrebbe essere indicativo di glaucoma (A). Una tomografia a coerenza ottica per lo strato di fibre nervose (NFL) che mostra un entro i limiti normali NFL (B). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Immagine MRI soppressa dal grasso pesato T2 coronale ottenuta perpendicolarmente al nervo ottico 3 mm dietro il disco ottico (A). Lo stesso taglio coronale dopo l'applicazione di un intervallo di soglia pre-calcolato (B). Sostanza bianca del nervo ottico (C). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La Tabella 1 mostra il normale intervallo di diametro della sezione trasversale del nervo ottico utilizzando la risonanza magnetica a 3 mm dal globo, come rilevato da studi precedenti.

Abbiamo descritto un protocollo per valutare e quantificare la sostanza bianca del nervo ottico che potrebbe essere utilizzata per la valutazione del paziente con glaucoma. Il protocollo utilizza sequenze di imaging ampiamente disponibili per l'acquisizione di immagini e utilizza il software open source Fiji per l'analisi delle immagini. Abbiamo standardizzato i parametri dell'immagine che in precedenza risultavano essere più accurati e altamente riproducibili nell'acquisizione delle immagini del nervo ottico, tra cui chiedere al paziente di fissarsi dritto in avanti, utilizzare T2 con sequenza di soppressione del grasso e catturare l'area della sezione trasversale 3 mm dietro il globo. Inoltre, abbiamo descritto un metodo dettagliato di analisi delle immagini che elimina la segmentazione manuale e corregge la variabilità del segnale tra i pazienti. L'importanza di questo protocollo è che elimina la variazione della segmentazione della regione di interesse (ROI) da parte del radiologo, che di solito è la principale fonte di errore nella valutazione del nervo ottico sulla risonanza magnetica¹². Mentre abbiamo cercato di fornire dati normativi per l'area della sezione trasversale del nervo ottico con la Tabella 1,ulteriori dati utilizzando il protocollo standard descritto sono necessari per l'uso e il confronto in contesti clinici. Tali dati devono adattarsi a diversi gruppi di età a causa della variazione di età delle dimensioni del nervo ottico, come mostrato nella Tabella 1. Tale variazione non è evidente tra i sessi¹⁵, ma è stato recentemente suggerito di essere presente per l'errore di rifrazione¹⁶.

Studi precedenti hanno applicato diverse metodologie per la quantificazione della sostanza bianca del nervo ottico e hanno utilizzato principalmente il software presente nella loro workstation per l'analisi delle immagini. Gli studi iniziali sulla valutazione del nervo ottico hanno adottato un approccio di quantificazione basato sull'area trasversale, utilizzando la segmentazione manuale da parte di tecnici o radiologi^12,17. Wang et al. hanno anche utilizzato la segmentazione manuale dell'area della sezione trasversale del nervo ottico a diverse distanze dal globo per la correlazione con OCT ¹¹. Omodaka et al. hanno utilizzato l'area media della sezione trasversale sul taglio coronale e la lunghezza del nervo ottico dal disco al chiasma ottico sul taglio assiale attraverso l'annotazione manuale per estrarre gli indicatori del nervo ottico per la correlazione con OCT⁸. Nonostante sia correlata con l'OCT, la riproducibilità di questo metodo potrebbe non produrre l'accuratezza richiesta per la valutazione longitudinale del nervo ottico. Ramli et al. hanno quantificato il volume del nervo ottico attraverso la segmentazione manuale del segnale isointense in tutte le sezioni assiali ⁵, un approccio che potrebbe perdere la materia del nervo ottico non catturata dalle sezioni assiali stesse, errore umano durante la segmentazione manuale dell'immagine, o anche nella determinazione della lunghezza del nervo ottico da includere nella valutazione della quantificazione.

Mentre diversi studi hanno utilizzato la valutazione dell'area della sezione trasversale del nervo ottico, differivano nella distanza delle misurazioni dal globo. Wang et al. hanno valutato 3 mm, 9 mm e 15 mm dietro il globo e hanno scoperto che la valutazione della sezione trasversale di 3 mm aveva la più alta correlazione con la pressione intraoculare¹¹. Bäuerle et al. hanno analizzato la riproducibilità della valutazione del nervo ottico sulla risonanza magnetica a 3 mm e 5 mm dietro il globo, e hanno trovato una buona valutazione per entrambi i casi¹⁰. Lagrèze et al. hanno misurato l'area della sezione trasversale di 5 mm, 10 mm e 15 mm dietro il globo e hanno scoperto che la valutazione della sezione trasversale era più accurata nell'area della sezione trasversale di 5 mm rispetto alle misurazioni più lontane dal globo¹⁷. In questo protocollo, abbiamo utilizzato una risonanza magnetica 3 T per l'acquisizione di immagini, in cui il suo uso nella valutazione del nervo ottico è risultato precedentemente superiore a 1,5 T MRI^18,19. La risonanza magnetica 7 T sempre più utilizzata potrebbe anche fornire risultati superiori, ma richiederà anche i suoi valori normativi. Per quanto riguarda la sequenza MRI utilizzata, abbiamo utilizzato la sequenza di soppressione del grasso T2, principalmente a causa della sua ampia disponibilità e della sua capacità intrinseca di delineare il nervo ottico che circonda il liquido cerebrospinale dopo aver eliminato il grasso intraconale circostante. Studi precedenti hanno utilizzato altre sequenze con risultati affidabili, tra cui la sequenza a mezzo quattro colpi a singolo colpo turbo spin-echo (HASTE) e la sequenza^7,12di Diffusion Tensor Imaging (DTI) , che potrebbe non essere ampiamente disponibile.

Un aspetto importante da considerare durante l'acquisizione dell'immagine è assicurarsi che il paziente si fissi su un bersaglio dritto, poiché fissarsi su un bersaglio non dritto durante l'imaging produrrà una quantificazione del nervo ottico non accurata¹². La fissazione nell'OCT è monoculare su un bersaglio vicino, richiedendo al paziente di avere una buona acuità visiva nell'occhio da valutare per vedere il bersaglio vicino con un occhio, mentre per la risonanza magnetica il bersaglio è più lontano, la fissazione è binoculare e richiede meno richieste visive. Tuttavia, la fissazione potrebbe ancora essere un problema per i pazienti che hanno un errore di rifrazione elevato o una visione scarsa. Mentre l'uso della risonanza magnetica per valutare e seguire i pazienti con glaucoma potrebbe non essere fattibile in presenza di tecniche di imaging a basso costo e più semplici, incluso l'OCT, la risonanza magnetica può essere utile in situazioni speciali in cui l'OCT non fornisce dati conclusivi o l'OCT stesso non può essere ottenuto, come in presenza di una significativa opacità oculare mediale. Inoltre, il protocollo descritto può essere utilizzato quando l'imaging MRI è giustificato nei casi di neuropatia ottica inspiegabile per escludere cause secondarie^20,21.

Uno dei principali limiti di questo protocollo è l'incapacità di valutare i pazienti che non possono fissarsi correttamente, compresi i pazienti con scarsa acuità visiva in entrambi gli occhi. A questo proposito, l'uso dello stimolo sonoro migliorerà la qualità della fissazione durante l'acquisizione dell'immagine²². Inoltre, come nuova metodologia, sono necessari studi futuri per rappresentare valori normali per le aree trasversali basate sulla risonanza magnetica per la sostanza bianca del nervo ottico. L'importanza di stabilire valori normali è ulteriormente sottolineata dal fatto che il nervo ottico è anche composto da una quantità significativa di tessuto connettivo²³, un tessuto che non ha capacità funzionali simili alle fibre nervose. Mentre la quantificazione dello spessore dello strato di fibre nervose ottiche nell'OCT potrebbe fornire una falsa impressione di tessuto nervoso remanente a causa dell'inclusione del tessuto connettivo nel processo di quantificazione²⁴, tale falsa impressione non è presente in questo metodo di quantificazione basato sulla risonanza magnetica. Gli artefatti di movimento potrebbero anche portare a sfocature nelle immagini, specialmente durante il movimento degli occhi durante l'esame. Mentre dovrebbe essere evitato durante l'imaging, stabilire l'intervallo di sostanza bianca ridurrà l'impatto di tali artefatti sull'accuratezza della quantificazione della sostanza bianca del nervo ottico, poiché i cambiamenti causati dall'artefatto di movimento sulla sostanza bianca cerebrale sono quasi come la sostanza bianca del nervo ottico.

Il principale punto di forza dell'attuale protocollo è l'eliminazione delle differenze interi individuali durante la quantificazione del nervo ottico, anche se eseguita da medici o tecnici non specializzati. Inoltre, ha utilizzato un software open source ampiamente disponibile per l'analisi delle immagini. Sebbene non sia possibile eseguire una risonanza magnetica dedicata per la quantificazione del nervo ottico, specialmente in presenza dell'OCT, si raccomanda di eseguire questo protocollo durante l'imaging MRI eseguito per altri scopi, inclusa l'esclusione delle cause secondarie di neuropatia ottica e glaucoma.

Tutti gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Vorremmo ringraziare Faris Haddad e Hasan El-Isa per il loro importante contributo nelle riprese video e nello sviluppo.