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Il baculovirus expression vector system (BEVS) è una solida piattaforma per lo screening dell'espressione e la produzione di proteina arginina metiltransferasi (PRMT) da utilizzare per studi biochimici, biofisici e strutturali. Quantità di milligrammo di materiale possono essere prodotte per la maggior parte dei PRMT e di altre proteine di interesse che richiedono una piattaforma di espressione eucariotica.
Protein arginina metiltransferasi (PRMTs) metilati arginina residui su un'ampia varietà di proteine che svolgono un ruolo in numerosi processi cellulari. I PRMT possono essere mono- o dimetilati gruppi arginina guanidino simmetricamente o asimmetricamente. La queste proteine è un'area complessa e intensamente studiata che richiede quantità di milligrammo di proteine ricombinanti di alta qualità. Il sistema di vettori di espressione del baculovirus (BEVS) che utilizza il nucleopolidrovirus multiplo autographa californica (AcMNPV) e le cellule di insetti Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) è stato utilizzato per lo screening dell'espressione e la produzione di molti PRMT, tra cui PRMT 1, 2 e da 4 a 9. Per schermare contemporaneamente l'espressione di più costrutti di queste proteine, inclusi domini e frammenti troncati, nonché le proteine a lunghezza intera, abbiamo applicato metodi scalabili utilizzando pipette multicanale regolabili e programmabili, combinate con piastre e blocchi a 24 e 96 pozzi. Nel complesso, queste regolazioni del metodo hanno permesso una generazione su larga scala di DNA bacmid, virus ricombinanti e screening dell'espressione proteica. L'utilizzo di vasi di coltura con un volume elevato di sospensioni cellulari Sf9 ha contribuito a superare i limiti di spazio nella pipeline di produzione per la produzione di proteine su larga scala mono lotti. Qui descriviamo protocolli dettagliati per l'espressione efficiente ed economica di PRMT funzionali per studi biochimici, biofisici e strutturali.
Proteina arginina metiltransferasi (PRMTs) metilati residui di arginina in modo monometile o simmetrico/asimmetrico dimetile. Le sequenze ripetitive RG/RGG/GRG sono altamente preferite dalla maggior parte dei PRMT e si trovano in un'ampia varietà di proteine1,2. Le proteine metilate dell'arginina come istoni o fattori di trascrizione e fattori di giunzione regolano la trascrizione, la giunzione e la struttura della cromatina3,4. La crescente conoscenza della diversa regolazione dell'utilizzo del substrato e del cofattore, del turnover e della cinetica dei PRMT, nonché della generazione di inibitori selettivi, ha fatto luce meccanicistica su questi enzimi e sui lorocomplessi 5,6. Tuttavia, non tutti i membri della famiglia PRMT sono studiati nella stessa misura; Ad esempio, PRMT9 è stato scoperto solo di recente come membro della famiglia PRMT1. Gli studi di struttura e funzione enzimatica per queste proteine richiedono quantità sufficienti, spesso milligrammi, di proteine ricombinanti per essere disponibili.
Il sistema di espressione procariotica Escherichia coli (E. coli)è di solito la prima scelta per lo screening dell'espressione utilizzando più costrutti per una data proteina7,8,9. Tuttavia, l'espressione basata su E. colinon sempre si traducono in quantità sufficienti di proteine PRMT nelle loro forme attive, come abbiamo notato in particolare per PRMT5 e PRMT7 (vedi sotto). Pertanto, i PRMT che non si esprimevano in E. coli o che dovevano essere prodotti dai meccanismi di espressione eucariotica sono stati sottoclorati in vettori appropriati per lo screening dell'espressione nel sistema vettoriale di espressione baculovirus alternativo (BEVS). Mentre I campioni espressi da E. coli di PRMT1, PRMT3 e PRMT8 sono stati ampiamente utilizzati per saggi in vitro e cristallografia, altri PRMT come PRMT5, che richiede il partner vincolante MEP50 del suo doppio dominio metiltransferasi, e PRMT come PRMT7 e 9, richiedono l'espressione delle cellule di insetti per ottenere quantità sufficienti di proteine attive. Nel complesso, i test standardizzati di media throughput metiltransferasi per PRMT4, 5, 6, 7 e 9 hanno utilizzato il BEVS nelle cellule degli insetti6. Il baculovirus expression vector system (BEVS) è una piattaforma versatile per produrre proteine ricombinanti che richiedono il meccanismo di espressione eucariotica che consente modifiche post-traslazionali essenziali per gli studi biochimici, biofisici e strutturali10,11,12. Diversi BEVS sono diventati disponibili in commercio dal primo uso segnalato di baculovirus nel 1983 per l'espressione proteica13. La maggior parte di questi protocolli utilizza diverse strategie per il trasferimento dell'espressione plasmide in cellule di insetti. Questi includono Bac-to-Bac, flashBAC, BaculoGOLD Bright, BacVector-3000, BacMagic, BacPAK, ecc. Il nostro protocollo si basa sul sistema più comunemente utilizzato in BEVS, il sistema Bac-to-Bac14, che è progettato per trasferire il gene / cDNA che codifica la proteina di interesse (POI, qui i PRMT) nel genoma del baculovirus mantenuto in un ceppo specializzato di E. coli tramite trasposizionesite-specific 15.
In breve, il vettore di trasferimento plasmide contenente il gene di interesse è stato trasformato in cellule competenti DH10Bac E. coli per generare DNA bacmidi virale ricombinante. Le cellule Sf9 aderenti sono state poi trasfette con DNA bacmid. Da quattro a cinque giorni dopo la trasfezione, i baculovirus ricombinanti iniziali secreti nel terreno di coltura cellulare sono stati recuperati ed etichettati come virus P1. Le scorte di baculovirus P1 sono state quindi utilizzate per l'amplificazione del virus (cioè la generazione di stock di baculovirus P2) e lo screening dell'espressione proteica. Sulla base dei risultati dello screening dell'espressione, i virus P2 per il miglior costrutto di espressione della proteina sono stati identificati e utilizzati per generare colture di sospensione di cellule di insetti infettate da baculovirus (SCBIIS) per la produzione di proteine su larga scala. Qui descriviamo i nostri protocolli dettagliati e descriviamo la logica alla base delle nostre scelte di recipienti reagenti e di coltura per supportare la nostra strategia di sviluppo di una metodologia più efficiente in termini di tempo, economica e scalabile per ottenere quantità sufficienti di proteine ricombinanti desiderate.
NOTA: la panoramica dei passaggi del protocollo BEVS è descritta nella figura 1.
1. Generazione di un DNA bacmid ricombinante
2. Generazione di scorte di baculovirus ricombinante
NOTA: Utilizzare cellule Sf9 in crescita esponenziale con una vitalità del 95% o superiore per qualsiasi fase del protocollo di espressione del baculovirus, inclusa la trasfezione cellulare per la generazione di baculovirus, l'amplificazione del volume del baculovirus, lo screening dell'espressione proteica e la produzione di proteine.
3. Screening dell'espressione proteica su piccola scala e amplificazione del virus
4. Preparazioni delle cellule di insetti infettate da baculovirus (SCBIIC) per la produzione di proteine
5. Preparazioni cellulari Sf9 per la produzione di proteine su larga scala
6. Infezione delle cellule Sf9 con SCBIIS per la produzione di proteine su larga scala
Una panoramica del protocollo BEVS è descritta nella figura 1. Più costrutti di espressione di PRMT, tra cui lunghezza intera, domini e frammenti troncati, sono stati generati presso il Structural Genomics Consortium (SGC, Toronto) secondo strategie internamente con il tentativo di aumentare il tasso di successo per identificare proteine solubili e stabili con un livello di espressionerelativamente alto 7,9. I lettori interessati sono incoraggiati a rivedere le definizioni e la metodologia dell'SGC di progettare un "frammento" come segmento della sequenza genica incorporata in un clone dell'espressione, "dominio" come dominio strutturale annotato da PFAM e "costrutto" come il frammento clonato in un vettore di espressione, tutti descritti in dettaglio in una precedente pubblicazione7. I costrutti di espressione dei PRMT presentati in questo protocollo sono per la produzione delle proteine con tag poliistidina clonate nel vettore pFBOH-MHL, che è una derivata del vettore pFastBac1. Nella figura 4,presentiamo l'analisi SDS-PAGE dei costrutti solubili con tag His di PRMT1, 2, 4-9 purificati da pellet raccolti dopo 4 mL di produzione in celle Sf9 (fase 3.1.4). PRMT1 e PRMT9 a lunghezza intera (FL) non sono presentati in questo gel, poiché FL PRMT1 è stato prodotto da E. colie FL PRMT9 prodotto da BEVS è stato purificato da Flag-tag6. I costrutti troncati di PRMT1, FL PRMT4 e tutti i costrutti PRMT8 mostrano una resa relativamente elevata, ma gli eluati proteici contengono frazioni di contaminanti co-purificati. Questi costrutti richiedono un'ulteriore ottimizzazione dei protocolli di purificazione. Sono quindi necessari ulteriori approcci per migliorare la purezza di queste proteine da produzioni scale-up, come una riduzione della quantità di perline di nichel nella fase dell'incubazione con un lisato chiarificato; un aumento delle concentrazioni di imidazolo nei tamponi di lavaggio; scissione della His-tag con proteasi TEV, seguita da applicazione su una resina ni-affinità; e, ulteriori passaggi di purificazione come l'esclusione delle dimensioni e la cromatografia a scambio ionico. I costrutti di PRMT2 mostrano una resa significativamente inferiore rispetto ad altre proteine e proteine PRMT2 a figura intera accompagnate da una forte banda di contaminanti. La produzione scale-up e due fasi di purificazione come IMAC e l'esclusione delle dimensioni hanno confermato un basso livello di espressione per questo costrutto insieme alla presenza persistente del contaminante co-purificante per la proteina FL. Proteine pure sono state ottenute per il complesso PRMT5 prodotto e purificato con il suo partner legante obbligato, MEP50. Il costrutto troncato di PRMT9 ha un livello di espressione inferiore di quasi due o tre volte, vicino a 1,5 mg/L, rispetto ad altri PRMT. Tuttavia, le scorte virali ricombinanti di questo costrutto sono state utilizzate per la produzione in scala, sono stati ottenuti cristalli diffrazione e la struttura è stata risolta per questa proteina insieme a PRMT4, 6 e 7(Figura 5).
Per le produzioni scale-up, i corrispondenti virus P2 sono stati utilizzati per infettare la coltura di sospensione delle cellule di insetti Sf9. Questo passaggio genera 50/100/200 mL di cellule infettate da baculovirus contenenti cellule infette e virus P3 nel supernatante. Per la produzione di proteine su larga scala, 2 L di cellule Sf9 sono state coltivate in ciascuno dei flaconi di frullato Fernbach da 2,8 L a 150 giri/min, 27 °C(figura 6). Il giorno della produzione, 2 L di cellule Sf9 (vitalità cellulare > 97%) in flaconi di frullato 2.5 L Tunair o 4 L in bottiglie di reagente da 5 L sono stati diluiti ad una densità cellulare di 4 x 106/ml. Queste cellule sono state infettate direttamente con 10-12 mL/L di coltura di sospensione di cellule di insetti infettate da baculovirus e incubate a una temperatura abbassata di 25 °C, a 145 giri/min. L'infezione del lotto di produzione direttamente con una coltura di sospensione di cellule di insetti infettate da baculovirus ha ridotto significativamente le fasi laboriose e dispendiose in termini di tempo nell'amplificazione del volume del virus, escludendo la gestione extra delle cellule infette, ed ha evitato la riduzione della degradazione del formicolio e del virus. La manutenzione della coltura cellulare SF9 e la produzione in scala sono state fatte nei recipienti di coltura ad alto volume di riempimento per adottare una produzione proteica su larga scala in un unico lotto(figura 6).
Prmt 4, 5 (in complesso con MEP50), 6, 7 e 9 proteine prodotte dalla piattaforma di produzione mediata da Baculovirus sono state utilizzate per la caratterizzazione cinetica e lo screening del composto inibitore presso l'SGC6. Le strutture cristalline sono state risolte e depositate nella Protein Data Bank (PDB) per le forme a tutta lunghezza o troncate delle proteine PRMT 4, 6, 7 e 9 con varie sonde chimiche e inibitori. I plasmidi di espressione per questi PRMT sono stati depositati nel repository plasmide Addgene (Addgene è un partner di distribuzione dell'SGC, https://www.addgene.org/) e sono disponibili per la comunità di ricerca(Figura 5).
Figura 1: Panoramica schematica dei passaggi del processo di espressione del baculovirus Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.
Figura 2: Baculovirus Cellule Sf9 infette e non infette. I segni di infezione sono cambiamenti strutturali nelle cellule degli insetti, come un aumento del 25-50% del diametro della cellula, nuclei cellulari ingrossati, forma uniformemente arrotondata, perdita di proliferazione e aderenza alla superficie del piatto di coltura, nonché una diminuzione della vitalità cellulare. Barra in scala bianca 200 μm. I segni di infezione presentati qui sono gli stessi per le cellule trasfette utilizzando sia reagenti di trasfezione, JetPrime e X-tremeGene 9. L'esempio specifico mostrato è per il reagente di trasfezione JetPrime. (A) Celle Sf9 non infette come controllo. (B) Cellule Sf9 infettate da Baculovirus. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Assemblaggio di piastre leganti per una rapida purificazione delle proteine di espressione di prova. Si prega di vedere il testo per i dettagli, passaggi 3.2.1-2 Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 :Risultati dello screening dell'espressione proteica. Risultati dello screening dell'espressione proteica della produzione di proteine mediate da baculovirus in 4 mL di coltura di sospensione Sf9 infettati da corrispondenti virus ricombinanti P1 per diversi PRMT e il complesso PRMT5-MEP50. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Riepilogo dei costrutti di espressione per PRMT4, 6, 7 e 9 utilizzati per gli studi sulla struttura cristallina presso il Structural Genomics Consortium di Toronto (SGC). Le strutture cristalline sono state risolte e depositate nella Protein Data Bank (PDB) per l'intera lunghezza o forme troncate di proteine PRMT 4, 6, 7 e 9 con varie sonde chimiche e inibitori. I plasmidi di espressione per questi PRMT sono stati depositati nel repository plasmide Addgene e sono disponibili per la comunità di ricerca (Addgene è un partner di distribuzione dell'SGC, https://www.addgene.org/). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Mantenimento delle cellule di insetti Sf9 e produzione di proteine nei diversi recipienti di coltura: (A) 2.8 L Fernbach flask per il mantenimento delle cellule e la produzione di proteine. L'uso del 72% fill-volume aumenta la velocità di produzione di 2,5 volte in una piattaforma di scuotimento. (B)Le fiasche di frullato Tunair (in questa immagine sono presentati solo 9 mastri su 10) e le bottiglie di reagente con un volume di riempimento dell'80% aumentano drasticamente la capacità produttiva della piattaforma di scuotimento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Uno dei vantaggi del BEVS nelle cellule di insetti si concentra sulla capacità dei macchinari di modifica post-traslazionale di consentire modifiche più complesse come fosforilazione, miristoilazione e glicosilazione. Insieme al ripiegamento altamente efficiente delle proteine dei mammiferi, queste modifiche facilitano elevate quantità di proteine modificate e piegate adatte a esperimenti a valle fisiologicamente rilevanti16.
Qui, abbiamo descritto protocolli dettagliati del BEVS che enfatizzano elementi critici per lo screening di espressioni di successo di costrutti multipli di proteine PRMT e produzione di proteine PRMT su larga scala nella piattaforma di espressione baculovirus: 1) L'uso di pipette multicanale regolari, regolabili e programmabili per trasferire i materiali biologici tra 24 e 96 - piastre e blocchi di coltura cellulare del pozzo nelle fasi della generazione di DNA bacmid e virus; una raccolta dei virus ricombinanti, l'amplificazione dei volumi virali dei virus ricombinanti e la preparazione dei blocchi di screening dell'espressione proteica. 2) Reagenti di trasfezione ad alte prestazioni ed economici per la generazione di virus ricombinanti. 3) Coltura di sospensione delle cellule di insetti infettate da baculovirus (SCBIIC) per la produzione di proteine su larga scala. 4) Utilizzo di fusti a frullato Ad alto volume 2.8 L Fernbach per mantenere la coltura di sospensione Sf9 e flaconi di frullato 2.5 L Tunair e bottiglie reagenti da 5 L per la produzione di proteine su larga scala.
Considerazioni speciali e motivazioni per le fasi di trasformazione e trasfezione.
Sebbene un protocollo commerciale raccomandi l'utilizzo di 100 μL di cellule competenti per unatrasformazione 14, l'efficienza di trasformazione delle cellule commerciali competenti DH10Bac E. coli è fino a 1 x 108 cfu / μg di DNA, quindi usiamo solo 4 μL. Questo è sufficiente per ogni trasformatore per ottenere colonie ricombinanti bianche isolate per l'isolamento del DNA bacmidi. Le cellule Sf9 aderenti nella piastra di trasfezione a 24 pompenti sono state sementi ad una densità cellulare di 2 x10 5 / mL in 0,5 mL di supporti per insetti senza siero. Questo volume è sufficiente per garantire una copertura uniforme della superficie di lavoro del pozzo. Allo stesso tempo, non diluizza troppo il mix di trasfezione, il che migliora l'efficienza di trasfezione. I reagenti di trasfezione non sono tossici per le cellule Sf9 e lo scambio di media non è necessario. Invece di un cambiamento dei supporti, altri 1,5 mL di supporti contenenti 10% (v/v) FBS vengono aggiunti nella piastra di trasfezione a 4-5 ore dopo il trasfezione per facilitare la crescita cellulare. L'efficienza di trasfezione di entrambi i reagenti di trasfezione è elevata. Tuttavia, con X-tremeGene 9, i segni di infezione nelle cellule trasfette (Figura 2) appaiono 10-12 ore prima rispetto al reagente JetPrime, quindi scegliamo tra questi reagenti a seconda del programma di lavoro dei passaggi successivi nei protocolli, che fornisce una certa flessibilità nel processo complessivo.
Lo screening dell'espressione del test proteico può essere impostato con virus P2 se la quantità dei virus ricombinanti iniziali, raccolti dalla piastra di trasfezione ed etichettati come P1, è un fattore limitante da utilizzare per lo screening dell'espressione proteica.
Considerazioni quando si sposta da volumi di cultura di piccole e grandi dimensioni.
Storicamente, si credeva che una crescita ottimale delle cellule richiedesse un elevato spazio aereo nella coltura delle sospensioni della manutenzione cellulare sf9 e delle produzioni in scala. Tuttavia, nel 2014, è stato riferito che l'alto spazio aereo nelle navi da coltura è meno critico di quanto si pensassein precedenza 17. Un contenitore di coltura impostato utilizzando una velocità di scuotimento opportunamente regolata al lancio orbitale della piattaforma di scuotimento fornirà un trasferimento di ossigeno sufficiente anche nella coltura di sospensioni ad alto volume di riempimento creando e mantenendo piccole bolle d'aria per un tempo più lungo. Con questo approccio, le cellule di insetti disponibili in commercio possono essere coltivate a una velocità di scuotimento più elevata entro un intervallo normale del tempo di raddoppio delle cellule senza sacrificare l'elevata vitalità cellulare.
Così, 6 anni fa, abbiamo iniziato ad aumentare il volume della coltura delle sospensioni in un pallone tremante durante il mantenimento delle cellule e abbiamo introdotto un diverso tipo di recipiente di coltura per la produzione di proteine regolando e monitorando le condizioni discuotimento (Figura 6). Per stabilire condizioni ottimali in questi vasi di coltura, abbiamo monitorato i parametri di coltura cellulare Sf9 come il tempo di raddoppio delle cellule insieme alla vitalità, alle dimensioni e alla forma delle cellule, allo stato di aggregazione e all'infettibilità delle cellule.
Ad esempio, per la manutenzione delle cellule Sf9, nei flaconi a scossa di Fernbach da 2,8 L, coltiamo 2 L invece di 0,8 L delle cellule di sospensione Sf9 che tremano a 150 giri/min a 27 °C e la vitalità cellulare la maggior parte delle volte è vicina al 99%, con cellule divisorie sane di forma uniforme. Per la produzione in scala, infettiamo 4 L di celle in bottiglie di reagente da 5 L che tremano ad alta velocità come 145 giri/min ad una temperatura ridotta di 25 °C. Gli incubatori più comunemente utilizzati con una piattaforma di scuotimento integrata possono contenere flaconi di scuotimento da 6 x 2,8 L o bottiglie di reagente da 6 x 5 L o flaconi di frullato Tunair da 10 x 2,5 L. Pertanto, la capacità dell'unica piattaforma di scuotimento, se riempiamo le fiasche di scuotimento Fernbach e le bottiglie di reagente a 1/3 rispetto al volume ad alto riempimento dei vasi è di 4,8 L contro 12 L usando flaconi di frullato Fernbach da 2,8 L e 10 L contro 24 L usando bottiglie di reagente da 5 L(Figura 6). La manutenzione della coltura delle celle a sospensione e la produzione in scala mobile nei vasi da coltura ad alto volume di riempimento ci hanno aiutato a superare i limiti dei volumi di produzione e ad adottare una piattaforma su larga scala. Pertanto, questo è molto utile per i laboratori senza accesso ai bioreattori e / o spazio limitato nelle pipeline di produzione.
Questo protocollo potrebbe essere prontamente adattato per la produzione e la purificazione di costrutti proteici con diversi tag di affinità utilizzando resine appropriate e modificando i tamponi di purificazione come descritto nel documento pubblicato dall'SGC6 per le proteine a figura intera contrassegnate con bandiera di PRMT4, 7, 9 e il complesso PRMT5-MEP50 e PRMT6 contrassegnato con isto. Sebbene descriviamo un protocollo BEVS per la famiglia di proteine PRMT, lo stesso approccio può essere applicato a qualsiasi altra famiglia proteica.
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Gli autori desiderano ringraziare Dalia Barsyte-Lovejoy per aver preso il tempo necessario per fornire preziosi feedback e commenti critici sul manoscritto e tutti i nostri colleghi SGC che hanno lavorato con la famiglia di proteine PRMT espressa dal Baculovirus Expression Vector System.
L'SGC è un ente di beneficenza registrato (numero 1097737) che riceve fondi da AbbVie, Bayer AG, Boehringer Ingelheim, Genentech, Genome Canada attraverso l'Ontario Genomics Institute [OGI-196], l'UE e l'EFPIA attraverso l'Impresa Comune Innovative Medicines Initiative 2 [sovvenzione EUbOPEN 875510], Janssen, Merck KGaA (alias EMD in Canada e negli Stati Uniti), Pfizer, Takeda e wellcome trust [106169/ZZ14/Z].
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2.8L Nalgene Fernbach Culture Flask, Polycarbonate, | Nalgene | 29171-854 | For large scale maintenance of suspension culture of Sf9 cells |
24-Well Blocks RB | Qiagen | 19583 | For incubation of 4ml of suspension Sf9 cells for protein expression screening |
4-20 Criterion TGX Gel 26W 15 ul | Biorad | 5671095 | For SDS-PAGe analysis of the purified proteins |
50ml Reagent Reservoir | Celltreat Scientific Products | 229290 | Reservoir used for diluted transfection reagent and Sf9 cells suspension |
96-well cap mat, for use with square well, 2 mL | Greiner Bio-One | 381080 | Used to cover 96 well block |
96 well PCR plate | Eppendorf | 30129300 | |
Bacto agar | BD | 214010 | For LB-agar selection paltes |
Airpore Tape Sheets | Qiagen | 19571 | To cover 24 well blocks for protein expression screening |
Allega X-15R Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
Antibiotic Antimycotic (100x) | Gibco | 15240112 | |
Bacmid DNA | in-house | non-catalog item | Bacmid DNA for baculovirus production |
Bluo-Gal, 1g | Thermo Fisher | 15519028 | |
Beckman JLA 8.1000 | |||
Cell Culture Plates, 24-Well, with lid, flat bottom, sterile | Eppendorf | 30722116 | Tissue culture treated plate |
Cell Resuspension Solution 0.5 L | Millipore Sigma | LSKCRS500 | For Bacmid DNA extraction |
Cell Lysis Solution 0.5 L | Millipore Sigma | LSKCLS500 | For Bacmid DNA extraction |
CELLSTAR Tissue Culture Plates, 96 well | Greiner Bio-One | 655180 | For transfection mix |
ClipTip 1250, filter reload, sterile | ThermoFisher Scientific | 94420818 | Tips for programmable and adjustable multichannel pipette |
dNTP Mix (25 mM each) | Thermo Fisher Scientific | R1121 | |
E1-ClipTip Electronic Adjustable Tip Spacing Multichannel Equalizer Pipette, 15 to 1250 μL | ThermoFisher Scientific | 4672090BT | Programmable and adjustable multichannel pipette |
E4 XLS adjustable spacer 6-channel pipette, 20-300 μL | Ranin | LTS EA6-300XLS | Ranin adjustable multichannel pipette |
Filter microplate, 96-well, polypropylene, with 25 µm ultra high molecular weight polyethylene membrane | Agilent | 201005-100 | For protein purification in expression screening |
Full-Baffle Flask Kit Tunair, 2.5L | IBI Scientific | SS-6003C | For large scale protein production in suspension culture of SF9 cells |
Gentamicin 10x10ml | BioShop | 15750078 | |
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Wisent Biocenter | 080-450 | |
I-Max Insect Media W/ L-Glutamine, 1 L | Wisent Biocenter | 301-045-LL | Serum free insect cells growth medium |
InstantBlue, Ultrafast Protein Stain | Expedeon Protein Solutions | ISB1L-1L | For protein gel (SDS-PAGE) staining |
Iptg, Ultra Pure, Dioxane Free, Min 99.5% | BioShop | IPT001.100 | |
JetPRIME Transfection Reagent Provided with jetPRIME buffer | POLYPLUS TRANSFECTION Inc | 114-01 | For Sf9 cells transfection to generate baculovirus |
Kanamycin Monosulfate | BioShop | KAN201.100 | |
Lb Broth (Lennox), Powder Microbial Gro& | Sigma | L3022-1KG | |
Masterblock 96 deep well 2.4mL | Greiner Bio-One | 780285-FD | Used in the transformation and expression screening procedures |
Max Efficiency DH10Bac Competent Cells , 0.5ml | Thermo Fisher | 10361012 | Competent cells for bacmid DNA generation |
mLINE 12-Channel Pipette, adjustable 30 - 300 uL | Sartorius | Sartorius 725240 | 12 channel pipette |
Neutralization Solution, 0.5 L | Millipore Sigma | LSKNS0500 | For bacmid DNA extraction |
New Brunswick Innova 44R, 120V, orbit 2.5 cm (1 in) | Eppendorf | M1282-0004 | Shaker incubator for incubaion of suspension of Sf9 cells |
Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30250 | For protein purification |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | LS15140122 | |
PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning 500ml | Pyrex | 4444-500 | For suspension culture of Sf9 cells |
PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning 125ml | Pyrex | 4444-125 | For suspension culture of Sf9 cells |
PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning 250ml | Pyrex | 4444-250 | For suspension culture of Sf9 cells |
RedSafe Nucleic Acid Staining Solution | Froggabio | 21141 | |
RNase A, 0.9 mL | Millipore Sigma | LSKPMRN30 | For suspension buffer for bacmid DNA extraction |
Roll & Grow Spherical Glass Plating Beads | MP Biomedicals | 115000550 | For spread of bacterial cells across the surface of an agar plate. |
RT-LTS-A-300μL-768/8 (tips) | Ranin | 30389253 | Tips for ranin multichannel pipette |
S.O.C. Medium | Thermo Fisher Scientific | 15544034 | |
Serum, Cell Culture, Fetal Bovine Serum (Fbs), Hyclone, Characterized Canadian | cytivalifesciences | SH3039602 | Addition to the serum free medim for the transfected cells |
Sf9 cells | Thermo Fisher | 12659017 | Insect cells |
Sfx-Insect Cell Culture Media | Cytiva (Formerly GE Healthcare Life Sciences) | SH3027802 | Serum free insect cells growth medium |
Tape Pad | Qiagen | 19570 | Tape Pad |
Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer - 2,000 units | New England Biolabs | M0267L | |
Tetracycline Hcl | BioShop | TET701.10 | |
Trypan Blue 0.4% Solution | Gibco | 15250061 | For assessment of cell viability |
VITLAB Reagent Bottles, PP with Screw Caps, PP, BrandTech, 5L | VITLAB | V100889 | For large scale protein production in suspension culture of Sf9 cells |
VWR Digital Mini Incubator | VWR | 10055-006 | Incubator for adherent Sf9 cells |
VWR Incubating Microplate Shaker | VWR | 97043-606 | Incubator for suspension culture of Sf9 cells in 24 well blocks |
VWR Petri Dishes | VWR | CA73370-037 | |
X-tremeGene 9 DNA Transfection Reagent 1.0 M | Roche | 6365787001 | For Sf9 cells transfection to generate recombinant baculovirus |
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