Prospezione ceppi microbici per biorimediazione e lo sviluppo di probiotici per la ricerca e la conservazione dei metaorganismi

L'inquinamento colpisce tutti i biomi. Gli ambienti marini sono stati particolarmente colpiti, in particolare le barriere coralline, uno degli ecosistemi più sensibili sulla Terra. La biorisanamento è la capacità degli organismi di degradare i contaminanti. Qui, descriviamo le metodologie per isolare e testare i microbi che presentano capacità di biorimediazione e potenziali caratteristiche probiotiche per i coralli.

L'inquinamento colpisce tutti i biomi. Gli ambienti marini sono stati particolarmente colpiti, in particolare le barriere coralline, uno degli ecosistemi più sensibili sulla Terra. A livello globale, 4,5 miliardi di persone dipendono economicamente dal mare, dove la maggior parte del loro sostentamento è fornito dalle barriere coralline. I coralli sono di grande importanza e quindi la loro estinzione porta a conseguenze catastrofiche. Esistono diverse soluzioni possibili per rimediare agli inquinanti marini e alla contaminazione locale, tra cui la biorisanamento. La biorisanamento è la capacità degli organismi di degradare i contaminanti. L'approccio presenta diversi vantaggi, come la sostenibilità, il costo relativamente basso e il fatto che può essere applicato in diversi ecosistemi, causando impatti minimi sull'ambiente. Come ulteriore vantaggio, la manipolazione di microbiomi endogeni, compresi i microrganismi benefici putativi per i coralli (pBMC), può avere effetti probiotici per gli animali marini. In questo contesto, l'uso dei due approcci, la biorisanamento e l'inoculazione del pBMC combinati, potrebbe essere promettente. Questa strategia favorirebbe il degrado di specifici inquinanti che possono essere dannosi per i coralli e altri metaorganismi, aumentando al contempo la resistenza all'ospite e la resilienza per affrontare l'inquinamento e altre minacce. Questo metodo si concentra sulla selezione di pBMC per degradare due contaminanti: l'estrogeno sintetico 17a-ethinylestradiol (EE2) e petrolio greggio. Entrambi sono stati segnalati per avere un impatto negativo sugli animali marini, compresi i coralli, e gli esseri umani. Il protocollo descrive come isolare e testare i batteri in grado di degradare i contaminanti specifici, seguito da una descrizione di come rilevare alcune caratteristiche benefiche putative di questi microbi associati al loro ospite corallo. Le metodologie qui descritte sono relativamente economiche, facili da eseguire e altamente adattabili. Quasi qualsiasi tipo di composto bersaglio solubile può essere utilizzato al posto di EE2 e olio.

L'inquinamento è una questione importante che colpisce la salute umana, animale e vegetale in tutto il mondo. Anche se l'inquinamento può essere naturale, come le ceneri vulcaniche¹, le attività umane sono la causa principale della maggior parte dell'inquinamento. Le attività antropiche stanno contaminando il suolo, l'acqua e l'aria, che portano direttamente o indirettamente a quasi 20 milioni di morti premature umane² e decimano miliardi di altre forme di vita ogni anno. Gli inquinanti sono presenti anche nelle zone più remote del pianeta. Ad esempio, sono stati rilevati metalli pesanti e composti organici persistenti in invertebrati marini profondi e mammiferi polari, rispettivamente^3,4.

Gli ambienti marini sono stati particolarmente influenzati dall'inquinamento. Per molto tempo, si è ipotizzato che l'oceano sarebbe rimasto inalterato e fornire una fonte infinita di beni a causa del suo massiccio volume di acqua⁵. Per questo motivo, tutti i tipi di industria e istituzioni liberato liberamente rifiuti nei corpi idrici per secoli^6,7. Diversi contaminanti di tutti i tipi, come plastica⁸, ormoni sintetici⁹, pesticidi¹⁰, petrolio¹¹, sostanze nutritive¹², metalli pesanti³, e rifiuti radioattivi¹³ sono stati segnalati come impatto ecosistemi oceanici. In questo contesto, le barriere coralline sono tra gli ecosistemi più importanti e sensibili negli ambienti marini¹⁴. Le barriere coralline sono protezioni costiere, fondamentali per lo sviluppo di migliaia di specie marine svolgendo ruoli essenziali nel ciclismo e nel controllo del clima delle sostanze nutritive. Reefs contribuiscono anche all'economia fornendo pesce, beni, e il turismo, tra gli altri¹⁵. Per esempio, 4,5 miliardi di persone dipendono dai pesci dell'oceano come fonte di cibo principale¹⁶, che sono fortemente supportati dalle barriere coralline.

Indipendentemente dalla loro importanza ecologica, sociale ed economica, le barriere coralline vengono decimate^17,18. Le attività antropiche sono principalmente responsabili di contribuire alle tre principali cause della morte dei coralli: il cambiamento climatico, la pesca eccessiva e l'inquinamento idrico¹⁹. Anche se è importante lavorare sulla mitigazione del riscaldamento globale, è anche importante lavorare per ridurre al minimo la contaminazione locale, compreso l'inquinamento idrico, che può contribuire criticamente al declino del corallo²⁰. Pertanto, vi è un urgente bisogno di sviluppare strategie per aumentare la vita dei coralli, che potrebbero fornire loro più tempo per adattarsi e sopravvivere.

A questo proposito, è estremamente importante trovare soluzioni per ridurre al minimo la contaminazione e sviluppare strategie per aumentare la forma fisica dei coralli. Le strategie per correggere gli inquinanti marini sono molto diverse e possono essere raggruppate in approcci fisici, chimici e biologici. Gli approcci fisici sono utili. Tuttavia, non sono sempre efficienti. Ad esempio, i rifiuti di plastica possono essere ridotti al minimo mediante la rimozione fisica, mentre i composti solubili in acqua richiedono l'eliminazione di altre metodologie. Esempi di tali composti sono il petrolio greggio, rilasciato dalle attività e dalle fuoriuscite dell'industria petrolifera, così come altri microinquinanti, come gli ormoni sintetici, normalmente utilizzati come componente estrogenica nei contraccettivi orali e presenti nelle acque reflue^{21, 22}. L'uso di sostanze chimiche per ridurre la contaminazione può risolvere un problema specifico, ma può anche rappresentare una fonte extra di inquinamento. Questo è il caso dei disperdenti chimici per mitigare la contaminazione da olio, che sono stati descritti come ancora più tossici per gli ecosistemi marini rispetto alla contaminazione dell'olio stesso²³. Per questi motivi, gli approcci biologici presentano diversi vantaggi rispetto agli altri metodi. La biorisanamento è la capacità degli organismi viventi, o dei loro prodotti metabolici, di trasformare i contaminanti in forme meno tossiche o non tossiche²⁴. I principali vantaggi dell'utilizzo di metodi biologici sono la sostenibilità, relativo a basso costo, il fatto che siano ecologicamente amichevoli e che possano essere applicati in diversi ecosistemi, causando impatti minimi o minori per l'ambiente^{21, 25,26,27}.

Inoltre, la manipolazione della comunità microbica presente in un ambiente consente un potenziale vantaggio aggiuntivo. Ci sono microbiomi che sono associati con gli ospiti e sono essenziali per la loro salute. È ben noto che questi microbiomi simbiotici associati sono necessari per mantenere l'omeostasi dell'ospite¹⁹. La manipolazione di questi microrganismi associati è stata ben esplorata per gli ospiti come piante e mammiferi^28,29, ma l'uso di probiotici corallo è ancora nuovo¹⁵. I coralli ospitano, interagiscono e dipendono da grandi e specifiche popolazioni di microrganismi per sopravvivere¹⁹. Il ruolo di queste comunità microbiche nella salute e nella disbiosi dei coralli è in fase di studio attivo, ma è ancora ben lungi dall'essere pienamente compreso³⁰. Una delle ipotesi più popolari è chiamata l'ipotesi probiotico corallo. Suggerisce l'esistenza di una relazione dinamica tra microrganismi simbiotici e condizioni ambientali che porta alla selezione dei più vantaggiosi metaorganismi corallini³¹. Sulla base di queste informazioni, i principali meccanismi probiotici potenziali, così come le strategie per l'isolamento, manipolazione, e la consegna di microrganismi benefici per i coralli (BMC) per diversi scopi, sono stati proposti³² e testati³³. Queste potenziali caratteristiche benefiche includono la resistenza all'aumento della temperatura, la protezione dalle specie reattive dell'ossigeno (ROS), la fissazione dell'azoto, la resistenza ai contaminanti e il controllo biologico contro i patogeni, tra gli altri³².

Questo studio si concentra sulla selezione di BMC e microrganismi liberi che presentano la capacità di degradare due contaminanti comunemente presenti in ambienti marini: l'estrogeno sintetico 17a-ethinylestradiol (EE2) e petrolio greggio. Gli inquinanti contenenti ormoni attivi sono spesso presenti nei corpi idrici^{34,35,36,37,38,39,40, 41,42}. Tra questi, composti endocrini-interrotti estrogeni sintetici (EDC) imitano l'azione degli estrogeni sulle cellule bersaglio, causando diversi impatti sugli animali, tra cui il cancro al seno, l'infertilità e l'ermafrodite⁹. L'EE2 viene espulso dagli esseri umani a causa dell'uso di contraccettivi orali. Non viene rimosso dalle acque reflue dagli impianti tradizionali di trattamento delle acque reflue e ha effetti negativi anche a concentrazioni molto basse (ad es., ng/L o g/L)^43,44,45. Poco si sa sugli effetti degli estrogeni sulla fisiologia del corallo^46,47. Tuttavia, su altri invertebrati marini, come spugne, crostacei e molluschi, gli estrogeni sono stati segnalati per causare diversi effetti negativi principalmente legati alla riproduzione, come lo sviluppo e/o la stimolazione di gameti, alterazione azioni proteiche, problemi nei processi embrionali e altri^{48,49,50,51,52}. Le conseguenze negative causate dalla contaminazione da EE2 evidenziano la necessità di sviluppare approcci sostenibili per rimuovere questo composto dall'ambiente senza influire sulla vita marina.

Parallelamente, con l'olio che attualmente rappresenta quasi il 40% delle fonti energetiche consumate a livello mondiale⁵³, la contaminazione cronica e le fuoriuscite di petrolio si verificano spesso vicino alle aree di barriera¹¹. La contaminazione da olio è stata segnalata per causare effetti negativi in diverse specie di animali marini, uccelli, piante e esseri umani^54,55,56,57. Sui coralli, provoca sbiancamento, riduce la resistenza delle larve allo stress termico⁵⁸, interrompe le comunità associate al microgrado²¹e provoca necrosi tissutale. Inoltre, le disperdenti chimici, una tecnica di bonifica dell'olio comunemente utilizzata dalle compagnie petrolifere per bonificare le fuoriuscite, sono ancora più tossici per i coralli rispetto all'olio stesso²³. I microrganismi benefici isolati dai coralli, al contrario, sono noti per svolgere ruoli cruciali sulla salute dell'ospite. Tuttavia, la manipolazione di questi potenziali probiotici deve essere meglio esplorata al fine di studiare i possibili effetti collaterali negativi e le capacità metaboliche che possono essere esaminati per migliorare la forma fisica del metaorganismo. In questo contesto, caratteristiche come l'attività antimicrobica contro i patogeni dei coralli, la produzione di catalasi per combattere lo stress ossidativo, la capacità di degradare l'urea (che può avere ruoli importanti nel processo di calcificazione) e la presenza di geni che conferiscono potenziali caratteristiche benefiche, tra le altre, deve essere al centro dell'indagine. Qui, mostriamo come biorisanamento e probiotici possono essere utilizzati per mitigare concomitante gli impatti dell'inquinamento e migliorare la salute dei coralli. Lo sviluppo di approcci innovativi che possono essere utilizzati come interventi per aumentare la persistenza delle specie marine rappresentano un passo verso un pianeta più sostenibile e più sano.

1. Raccolta e stoccaggio di acqua e coralli per l'isolamento microbico

NOTA: È essenziale prendere le coordinate e la temperatura dei siti di campionamento. Se possibile, metadati come salinità, pH, profondità e intensità della luce possono anche aiutare a trovare approcci di coltivazione affinati e interpretazione futura dei dati. Per ottenere risultati affidabili, conservare i campioni per il periodo di tempo minimo possibile. I microbiomi acqua/corallo possono cambiare considerevolmente se i campioni non sono tenuti alla giusta temperatura e/o vengono conservati per lunghi periodi. Se la fase di isolamento non viene eseguita immediatamente dopo la raccolta, è fondamentale mantenere i campioni a 4 gradi centigradi fino all'elaborazione. Più a lungo i campioni vengono conservati, anche a 4 gradi centigradi, più la comunità microbica cambierà.

1. Campionare e conservare l'acqua di mare.
   1. Raccogli 500 mL di campioni d'acqua in almeno triplicati da ogni sito di campionamento mirato. Preferibilmente utilizzare bottiglie sterili con tappi a vite.
   2. Se si elabora l'acqua istantaneamente dopo la raccolta, tenere le bottiglie a RT per un breve intervallo. Se l'elaborazione del campione avviene più tardi, tenere le bottiglie a 4 gradi centigradi.
2. Assaggia e conserva il corallo.
   1. Utilizzare un paio sterile di pinze per tagliare frammenti di corallo dallo stesso sito di campionamento dei campioni d'acqua. Per evitare la contaminazione, toccare i coralli solo con guanti sterili.
   2. Risciacquare il frammento di corallo campionato utilizzando una soluzione salina sterile da 20 mL (3% NaCl in acqua distillata) o acqua di mare artificiale per sbarazzarsi dei batteri liberi dell'acqua di mare, poco attaccati.
   3. Usando le pinze, collocate ogni frammento di corallo in uno sterile contenitore da 250-500 mL con un tappo a vite contenente una soluzione salina sterile.
   4. In laboratorio, utilizzando pinze e pinze sterili, pesare 5 g di frammenti di corallo utilizzando piatti sterili 100 mm x 20 mm Petri su una bilancia di pesatura.
   5. Trasferire 5 g di campione di corallo in un mortaio sterile e macerarlo con un pestello sterile.
   6. Utilizzando una spatola sterile, trasferire il campione macerato in un pallone di coltura sterile contenente 45 mL di soluzione sterile NaCl 3% e 10-15 perline di vetro di 5 mm. Utilizzare alcuni dei 45 mL sterile soluzione salina sterile per lavare la malta e recuperare la quantità massima del macerato.
   7. Tenere i flaconi in costante agitazione (150 x g) per 16 h alla temperatura dell'acqua del sito di campionamento.
      NOTA: Per i coralli d'acqua poco profonda la temperatura ottimale varia da 24 a 28 gradi centigradi. Questo passo staccherà i microrganismi da diversi compartimenti di corallo, come quelli attaccati alle cellule ospiti, o quelli che vivono all'interno del tessuto e lo scheletro. Dopo questo passaggio, i macerati del corallo non devono essere memorizzati e la fase di isolamento deve essere eseguita immediatamente.

2. Isolamento dei batteri degradanti EE2 dall'acqua di mare e/o dai coralli

1. Selezionare i batteri.
   NOTA: Dopo i passaggi 1.1.2 e 1.2.7, la concentrazione di microrganismi nell'acqua di mare che si sono staccati dai diversi macerati corallo sarà sconosciuta e variabile. Al fine di garantire l'isolamento delle singole colonie microbiche nei piatti Petri contenenti supporti agar, sono necessarie diluizioni seriali.
   1. Eseguire diluizioni seriali fino a 10^-9 in soluzione salina sterile per campioni di corallo e fino a 10^-6 per campioni d'acqua. Pipette diluizioni su e giù 5x prima di scartare la punta. Campioni vortice per 5 s ogni volta prima di eseguire la successiva diluizione seriale.
   2. Pipetta 100 - L di ogni diluizione su piatti Petri contenenti 3% NaCl lysogeny brodo (LB) agar medium, e piastrarli.
      NOTA: Utilizzare marine agar (MA) come mezzo alternativo. Per ottenere risultati affidabili sono necessari triplicati di ogni diluizione.
   3. Incubare le piastre per 1/3 giorni alla temperatura di destinazione (ad es. Controlla i piatti una volta al giorno.
   4. Selezionare e isolare le colonie che presentano morfologie di crescita distinte su nuove piastre utilizzando la tecnica della piastra di striature. Ripetere questo passaggio tutte le volte che è necessario per avere colonie pure che crescono sulle piastre.
   5. Se la procedura non ha immediatamente continuato a fare il passo 2.3.1, conservare gli isolati a 4 gradi centigradi o in glicerolo come descritto nella sezione 2.2.
2. Preparare le scorte di glicerolo.
   NOTA: questo passaggio è facoltativo e può essere utilizzato per lo stoccaggio di scorte batteriche a lungo termine.
   1. Raccogliere colonie singole dalla piastra fresca o dalle piastre immagazzinate a 4 gradi centigradi e inocularle in modo indipendente in 2 mL di terreno sterile LB.
   2. Posizionare i tubi sotto agitazione costante (150 x g)a 24-28 gradi durante la notte (ON).
   3. Aggiungere 1 mL delle colture batteriche dal passo 2.2.2 e glicerolo sterile ad una concentrazione finale del 20% ai crioviali da 2 mL.
   4. Lasciare i crioviali ON a 4 gradi centigradi.
   5. Collocare gli stock batterici gliceroli a -80 gradi centigradi fino a quando necessario.
3. Eseguire il test di capacità di degradazione EE2.
   1. Attivare gli isolati nel brodo LB o nei supporti alternativi. Per questo, scegliere una singola colonia dalle piastre fresche o la piastra immagazzinata a 4 gradi centigradi, e inoculare 2 mL di mezzo Sterile LB. Nel caso in cui si tratti di uno stock di glicerolo, prima striscia su lande l'agar e incubare a 24,28 gradi centigradi ON per avere colonie singole in crescita. Posizionare il tubo contenente il grado LB inclinato sotto agitazione costante (150 x g)a 24-28 gradi centigradi ON.
   2. Dopo la crescita batterica, pellet le cellule centrifugandole a 8.000 x g per 8 min a temperatura ambiente (RT). Scartare il supernatante e, colate delicatamente su e giù, risospendere le cellule in un volume uguale (2 mL) di acqua salina per lavare il brodo LB rimanente.
   3. Ripetere il passaggio 2.3.2 due volte per garantire che non vi siano tracce di fonte di carbonio, rassicurando le celle in un volume uguale di soluzione salina. Ad esempio, se è stato avviato con una coltura di 2 mL, risospendere le celle in un volume finale di soluzione salina da 2 mL.
   4. Inoculare le cellule lavate e risospese nel mezzo di coltura minimo Bushnell Haas (BH Broth) contenente EE2 come unica fonte di carbonio⁵⁹.
      NOTA: EE2 viene sciolto in etanolo ad una concentrazione finale di 5 mg/L nel mezzo di coltura. Apportare modifiche al tipo di inquinante e/o alla concentrazione, se necessario.
   5. Valutare la crescita batterica per densità ottica a 600 nm e/o colonie che formano unità (CFU) su LB agar medio³³, per 16-72 h di incubazione.
      NOTA: In alternativa, i microrganismi possono essere isolati direttamente su supporti minimi contenenti EE2 o altri composti, come unica fonte di carbonio. Questo passaggio dirigerebbe la selezione ed eviterebbe una crescita indesiderabile.

3. Isolamento dei batteri che degradano l'olio dall'acqua di mare e/o dai coralli

1. Preparare i supporti minimi contenenti una frazione solubile in acqua di olio (oWSF) e una frazione insolubile (oWIF) come unica fonte di carbonio²¹.
   1. Aggiungete l'1/2% di petrolio greggio a 500 mL di acqua distillata sterile. Utilizzare un flacone di filtro aperto sul fondo per estrarre la frazione solubile senza disturbare lo strato superiore della frazione insolubile.
   2. Mantenere la miscela in costante agitazione a 24,28 gradi centigradi a 150 x g per 48 h.
   3. Posizionare il flacone del filtro contenente le frazioni di petrolio greggio su una superficie stabile e attendere 10-20 min per consentire la separazione delle frazioni solubili e insolubili.
   4. Trasferire l'oWSF in un nuovo flacone sterile, salvando l'oWIF aprendo il flacone del filtro inferiore ed eliminando la frazione solubile.
   5. Utilizzando tutti gli oWSF recuperati nel passaggio precedente (400 mL), preparare 1 L di BH agar medio minimo contenente oWSF come unica fonte di carbonio.
   6. Utilizzando l'oWIF rimanente nel pallone dal punto 3.1.4, preparare 1 L di BH agar medio minimo contenente oWIF come unica fonte di carbonio.
2. Isolare i batteri degradanti oWSF- e oWIF.
   1. Utilizzando acqua e corallo macerato dai passi 1.1.2 e 1.2.7, rispettivamente, diluire i campioni fino a 10^-6 nella soluzione salina sterile come descritto nel passaggio 2.1.1.
   2. Pipetta 100 -L di ogni diluizione su piatti Petri contenenti supporti di agar BH-oWSF e BH-oWIF e piastrarli.
   3. Ripetere le procedure descritte dal passaggio 2.1.3 al passaggio 2.1.5.

4. Selezione dei membri del consorzio

1. Estrarre e sequenziare il DNA per l'identificazione tassonomica.
   1. Attivare gli isolati stoccati in glicerolo come descritto al punto 2.3.1.
   2. Estrarre il DNA utilizzando un kit di estrazione del DNA (vedere Tabella dei materiali).
   3. Utilizzare i primer 27f (5o-AGA GTT TGA TGA TGA CTC AG-3) e 1492r (5'-GTT TAC CTT GTT ACG ACT T-3') per l'amplificazione del gene rRNA 16S.
   4. Eseguire 50 reazioni PCR l secondo il seguente protocollo: 5 L di 10x buffer di polimerasi, 2 mM MgCl₂, 0,2 mM dNTP, 5 mM di ogni primer, 10 ng di DNA genomico e 2,5 U di polimerasi del DNA Taq. Aggiungere controlli negativi (ad esempio, estrazioni di DNA vuoto e reazioni PCR senza DNA modello) per garantire che non vi sia alcuna contaminazione.
   5. Impostare le seguenti fasi di ciclo termico: un primo ciclo di denaturazione a 94 gradi centigradi per 4 min; 35 cicli a 94 gradi centigradi per 1 min, seguiti da 50 gradi centigradi per 1 min e 72 gradi centigradi per 2,5 min; un ciclo di estensione finale per 10 min a 72 .
   6. Controllare l'integrità dell'anguillo in gel di agarose 1.2% utilizzando 80 V.
   7. Gel purifica i campioni utilizzando un kit di purificazione del gel (vedi Tabella dei materiali).
   8. Quantificare i prodotti PCR utilizzando un fluorometro.
   9. Inviare il prodotto per il sequenziamento.
      NOTA: per migliorare le classificazioni tassonomiche, il metodo Sanger è consigliato⁶⁰, perché fornisce sequenze lunghe. I primer universali 27f e 1492r possono essere utilizzati per amplificare quasi l'intera lunghezza del gene rRNA 16S⁶¹. Se i contig non possono essere assemblati utilizzando una coppia di primer, è necessario considerare una coppia aggiuntiva al centro della sequenza.
2. Determinare la curva di crescita.
   1. Attivare gli isolati nelle scorte di glicerolo dal passo 2.2.5 come descritto nel passaggio 2.3.1 ma utilizzando 5 mL invece di 2 mL.
   2. Aggiungere l'1% (v/v) della coltura cresciuta da 5 mL dal passaggio 4.2.1 in triplicati, a un flacone da 250 mL contenente 100 mL di supporto LB 3%. Assicurarsi di preparare triplicati di un controllo negativo (nessun inoculo) pure.
   3. Posizionare i flaconi in un'incubatrice in costante agitazione (150 x g)a 24-28 gradi centigradi.
   4. Prendere 1 mL aliquote ogni 4 h per 48 h. Se i ceppi presentano un alto tasso di crescita, diminuire l'intervallo di 4 h.
   5. Misurare la stima della densità ottica (OD) a 600 nm lunghezza d'onda e unità formanti colonia (CFU) conteggiata da diluizioni seriali placcate su piastre di media ricchi (100 - L dovrebbe essere inoculato in ogni piastra e normalizzato al volume di 1 mL).
   6. Tracciare le curve OD e CFU e analizzare la correlazione tra OD/CFU di ogni singola deformazione. D'ora in equi, calcola il numero di celle in base ai valori OD.
3. Eseguire il test di antagonismo.
   1. Attivare gli isolati come descritto nel passaggio 2.3.1.
   2. Inoculare una ceppo alla volta lungo il centro delle piastre contenenti supporti di agar e le altre perpendicolari a quella centrale. Ripetere l'operazione fino a quando ogni ceppo microbico selezionato viene testato rispetto a tutti gli altri.
   3. Incubare le piastre a 24,28 gradi centigradi e monitorarle quotidianamente per osservare potenziali aloni che indicano un'attività antagonista. Se si osservano aloni che indicano un'attività antagonista tra due ceppi, uno di essi dovrebbe essere escluso.
4. Eseguire l'assemblaggio del consorzio.
   1. Attivare gli isolati come descritto nel passaggio 2.3.1.
   2. Spingere le cellule a 3.500 x g e lavarle delicatamente 2x in un volume uguale di soluzione salina. Risospendere le cellule in un volume uguale (cioè, se il volume finale era di 2 mL di cellule, lavarle utilizzando 2 mL di soluzione salina e sospenderle in un volume finale di 2 mL).
   3. Inoculare 1 coltura mL in 100 mL 3% NaCl LB medio e incubare ON a 150 x g.
   4. Ripetere il passaggio 4.5.2, inoculare le colture coltivate, lavate e risospese di 100 mL nelle colture 10 L. Incubare ON in bioreattori sterili di sollevamento dell'aria, ricevendo aria filtrata da una pompa. Se è necessaria una maggiore cultura, inoculare sempre l'1% della cultura cresciuta nei media freschi.
   5. Centrifuga colture coltivate a 8.000 x g per 8 min a 4 gradi centigradi. Scartare supernatante dopo la centrifugazione.
   6. Lavare il pellet, risusciando delicatamente le cellule in 500 mL di soluzione salina sterile.
   7. Ripetere i passaggi 4.5.5 e 4.5.6.
   8. Risospendere ogni singola coltura in 100 mL di soluzione salina e misurare l'OD per stimare il numero di cellule.
   9. Calcolare il volume di ogni coltura necessaria per raggiungere una concentrazione finale di 10⁷ celle mL^-1.
   10. Eseguire i conteggi CFU sui rich media per una conferma finale della vitalità e della concentrazione cellulare.
   11. Mescolare un volume uguale di ogni singola coltura in flaconi sterili e trasformare il consorzio in tubi sterili da 50 mL.
   12. Tenere a 4 gradi centigradi fino all'inoculazione.
       NOTA: Preparare l'assemblaggio del consorzio il più fresco possibile per garantire che le cellule siano ancora vitali. In alternativa, i conteggi CFU possono essere eseguiti prima dell'inoculazione. Per assemblare un consorzio ideale, è necessario utilizzare isolati che presentano capacità metaboliche diverse e complementari. Di solito, gli isolati di 6-10 sono usati per formare consorzi, ma questo numero varierà a seconda delle caratteristiche e degli scopi dei membri.

5. Rilevamento delle caratteristiche benefiche putative per i coralli

1. Attiva gli isolati dalle riserve di glicerolo striandoli su piastre di agar LB e incubanoli a 24-28 gradi centigradi per far crescere colonie singole. Scegli una singola colonia dalle piastre e inocularla in 2 mL di mezzo Sterile LB. Posizionare il tubo che contiene il mezzo LB inclinato sotto agitazione costante (150 x g)a 24-28 gradi centigradi ON.
2. Eseguire l'estrazione del DNA come descritto nella sezione 4.1 per il rilevamento di geni potenzialmente benefici da parte della PCR.
   NOTA: le condizioni di reazione pcR e i primer dipenderanno dal gene bersaglio. Le metodologie per testare le caratteristiche BMC dei singoli ceppi e il rilevamento della PCR per geni potenzialmente benefici sono descritti nella Tabella 1.

Sulla base dei metodi qui descritti, è stato possibile isolare i microrganismi da diverse fonti d'acqua e nubbini corallini che presentano caratteristiche Putative BMC e in grado di degradare diverse classi di contaminanti (Figura 1). Utilizzando campioni d'acqua raccolti in un impianto di depurazione, ottenuto dal CESA-UFRJ (Centro sperimentale di igiene ambientale dell'Università Federale di Rio de Janeiro), e sulla base della procedura qui presentata, 33 ceppi batterici in grado di degradare EE2 a una concentrazione finale di 5mg/L sono stati isolati(Figura 2A). Inoltre, utilizzando la tecnica per la selezione di batteri che degradano l'olio, sono stati isolati 20 ceppi in grado di degradare sia oWSF (Figura 2B) che oWIF (Figura 2C).

Le caratteristiche putative del BMC sono state sottoposte a screening in microrganismi isolati da diverse specie di corallo in condizioni diverse. Tra questi, un ceppo che presenta una forte attività antagonista contro il patogeno del corallo Vibrio corallililyticus (Figura 3A), ceppi in grado di degradare l'urea (Figura 3B), un buon produttore catalase (Figura 3 C), e sono stati trovati microrganismi che presentano geni potenzialmente benefici (Figura 3D).

Impiegando i due approcci combinati (ad esempio, la biorimediazione e l'inoculazione del BMC), è stato possibile proteggere i coralli dagli impatti dell'esposizione al petrolio. Per questo, un consorzio di bioremediator di olio pBMC, isolato dal corallo Mussismilia harttii, è stato inoculato sulle nubbine coralline esposte all'1% di olio in triplicati²¹. I trattamenti esposti all'olio hanno presentato una progressiva diminuzione di Fv/Fm dal quarto giorno in poi, raggiungendo valori vicini allo zero entro il decimo giorno. La fluorescenza variabile/fluorescenza massima (Fv/Fm) ha fornito una misura dell'efficienza fotochimica massima del fotosistema II (PSII) delle zooxantelle, che rappresenta una misurazione indiretta della salute dei coralli. D'altra parte, i nubbin i coralli presenti negli acquari inoculati con il consorzio hanno mostrato una capacità fotochimica meglio conservata (Figura 4).

Figura 1: Riepilogo dei passaggi principali della selezione e dell'assemblaggio di un consorzio bioremediator-pBMC. Schema di passaggi di selezione dei microrganismi che degradano gli inquinanti (in grigio) e final procedure utilizzate per la selezione microbica del consorzio (sequenziamento del DNA, curva di crescita, test di antagonismo e assemblaggio del consorzio in rosso). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Selezione di batteri che degradano gli inquinanti. (A) Ibatteri batterici che crescono su piastre medie minime contenenti EE2 come unica fonte di carbonio. (B) Colonie di batteri che crescono su lastre medie minime contenenti oWSF come unica fonte di carbonio. (C) Colonie di batteri che crescono su lastre medie minime contenenti oWIF come unica fonte di carbonio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Rilevamento delle caratteristiche di pBMC. (A) Macchie in triplicati di ceppo che presentano attività antagonistica contro il patogeno del corallo Vibrio corallilyticus (in nero) e un ceppo di controllo (in verde). (B) La crescita su supporti contenenti urea come unica fonte di carbonio. (C) Ceppo che produce catalasi (-) e un cattivo ceppo di produttore di catalasi (-). (D) Esempio di rilevamento PCR del gene nirK (lane 1k; scala 2 kb; corsia 2 - controllo negativo dell'estrazione del DNA vuoto; corsia 3 - rilevamento nirK; corsia 4 - reazioni PCR senza DNA modello). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Misurazioni Fv/Fm di nubbini M. harttii dark adattati alle 17:00, utilizzando un fluorometro clorofillia tra le immersioni e PAM. Le misurazioni Fv/Fm del consorzio di controllo dei trattamenti, dell'olio e dell'olio con il consorzio sono state eseguite in triplicati ogni giorno per 10 giorni. Viene visualizzata la deviazione standard. Le caratteristiche del grafico sono state modificate con il permesso dei risultati precedenti²¹, disponibili presso https://www.nature.com/articles/srep18268 in base a Creative Commons Attribution 4.0. Termini completi a http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Rilevamento delle caratteristiche putative del BMC, del meccanismo d'azione (MOA), dei microrganismi segnalati che presentano il potenziale e la tecnica utilizzata per rilevare la caratteristica.

Negli ultimi 50 anni gli approcci di biorisanamento sono stati massicciamente esplorati. Ad esempio, oltre 200 microbi tra batteri, cianobatteri, microalghe e funghi in diversi habitat, sono stati designati come in grado di indicare la presenza e/o degradare gli idrocarburi^62,63,64 . Inoltre, altre classi di composti che causano impatti sull'ambiente e sugli esseri umani, come plastica, bisfenolo A, interferviai endocrini e metalli pesanti, sono obiettivi per lo sviluppo della tecnica di biorimediazione^{65,66, 67}. D'altra parte, lo sviluppo di probiotici marini è stato limitato ai campi che hanno un impatto evidente sull'economia, come i probiotici del pesce in acquacoltura^68,69. Tuttavia, l'isolamento e la caratterizzazione di microrganismi benefici per proteggere le barriere coralline, gli ecosistemi marini che sostengono la pesca, il turismo e altre attività redditizie, stanno iniziando ad essere valutati¹⁵. Qui, un protocollo economico, facile e accessibile per selezionare microrganismi inquinanti che possono anche presentare caratteristiche potenzialmente benefiche agli ecosistemi marini locali, in particolare i microrganismi benefici putativi ai coralli (pBC), è Descritto.

Inoltre, il metodo qui dimostrato è altamente adattabile a diversi composti e diversi tipi di fonti microbiche. È possibile indirizzare diversi inquinanti sostituendo l'unica fonte di carbonio aggiunta al supporto minimo. Per questo, invece di olio o EE2, altri composti dovrebbero essere aggiunti alla concentrazione desiderata. Questa sarebbe la pressione selettiva per isolare i degradanti per gli inquinanti mirati. Ad esempio, microrganismi in grado di degradare altre classi di disgregatori endocrini sono già stati selezionati e testati utilizzando la stessa metodologia⁷⁰. Inoltre, altri organismi marini e terrestri, come spugne e piante^71,72, così come diversi tipi di campioni ambientali, come il suolo, il carburante e le rocce possono essere utilizzati come fonti degradanti-microbiche^{25, 73,74}. Ad esempio, è stato possibile rilevare e isolare i batteri che degradano gli idrocarburi da diversi campioni di suolo e sedimenti^{25,54,63,64,75}. Infine, eseguendo lievi modifiche nei media, i microrganismi diversi dai batteri possono essere facilmente selezionati come microbi degradanti. Per esempio, un ceppo di microalghe con la capacità di degradare in modo efficiente i composti dell'estrogeno è stato segnalato⁷⁶.

Idealmente, bioremediation-probiotico consorzi devono essere assemblati per ogni composto o area specifica. I microbi che crescono in un ambiente specifico potrebbero non crescere anche in nuovi siti rispetto alle loro condizioni native. Poiché i ricercatori non hanno trovato un prodotto che possa essere applicato in modo efficiente in tutte le diverse condizioni ambientali, è necessario eseguire un nuovo assemblaggio di consorzi per ogni situazione specifica. Questo sarebbe simile alla medicina personalizzata per il recupero su misura per l'ambiente. Per questo motivo, la creazione di una banca centrale di ceppi microbici con potenziali caratteristiche probiotiche e capacità di degradazione è un passo cruciale per l'avanzamento di questo campo. Questa iniziativa farebbe risparmiare tempo e lavoro, contribuendo all'assemblaggio di nuovi consorzi specifici in tutto il mondo.

I microrganismi associati ai coralli (ad esempio, microalghe, batteri, archea, funghi e virus) hanno un ruolo complesso e intricato nel mantenimento dell'omeostasi ospite¹⁹. I fattori di stress ambientali, come l'inquinamento, possono anche destabilizzare il microbioma corallo, con conseguente disbiosi, che può causare malattie e mortalità³⁰. I meccanismi con cui il microbioma corallino può sostenere la salute dei coralli stanno iniziando a essere rivelati. Questi meccanismi sono la chiave per comprendere la resistenza e la resilienza dei coralli ai fattori di stress ambientali e, di conseguenza, per promuovere la persistenza e la conservazione della barriera corallina. Inoltre, i risultati nel campo aiuteranno a comprendere le interazioni generale host-microbioma, che possono contribuire allo sviluppo di migliori probiotici e strategie di promozione della salute in altre aree. È anche importante indagare meglio come queste vaccinazioni probiotici possono interferire sulla salute del metaorganismo durante gli eventi di stress. Per esempio, lavoro che mostra che l'aumento delle prestazioni del corallo è dovuto ai probiotici e non semplicemente il corallo utilizzando i batteri come fonte di cibo sono ancora necessari.

Parallelamente, lo sviluppo di nuovi approcci di consegna dei consorzi e il miglioramento di quelli esistenti sono di grande importanza. Metodi alternativi per l'immobilizzazione del consorzio e approcci innovativi, come l'inoculazione degli alimenti coralli (ad esempio, artemia e rotiferi) e il loro utilizzo come vettori. Questi sistemi di consegna possono anche essere modificati per indirizzare altri organismi marini e sarà essenziale per il successo del campo probiotici marini.

La mitigazione dell'inquinamento e la persistenza della barriera corallina sono attualmente due dei principali argomenti evidenziati regolarmente nelle conferenze ambientali. L'Agenda 2030, un documento pubblicato dalle Nazioni Unite che descrive gli obiettivi globali che la società dovrebbe raggiungere per consentire un futuro sostenibile, dedica obiettivi specifici per ogni numero. Mentre l'obiettivo 6 sottolinea l'importanza del miglioramento della qualità dell'acqua riducendo l'inquinamento, l'obiettivo 14 rafforza l'importanza della conservazione e dell'uso sostenibile degli oceani, dei mari e delle risorse marine⁷⁷. In questo contesto, la conservazione della barriera corallina dipende dai cambiamenti che dovrebbero essere raggiunti nel prossimo futuro, compresa la mitigazione dell'inquinamento. Questo è di grande importanza, perché la maggior parte delle massicce perdite di corallo si sono verificati quando altri fattori sono stati aggiunti agli eventi climatici, come la distruzione dell'habitat locale e la contaminazione^78,79. Questo documento ha dimostrato che è possibile combinare la biorisanamento e l'inoculazione di pBMC per degradare specifici inquinanti, mentre può aumentare la resistenza e la resilienza del corallo per affrontare gli inquinanti e altri problemi. L'ottimizzazione dei protocolli esistenti e/o lo sviluppo di metodi innovativi, combinati o applicati in modo indipendente, sarà cruciale per determinare il futuro degli ecosistemi marini.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questa ricerca è stata condotta in collaborazione con il progetto di R&S in corso registrato come ANP 21005-4, "PROBIO-DEEP - Indagine sui potenziali impatti causati dall'esplorazione di petrolio e gas sugli olobionti marini in acque profonde e sulla selezione di potenziali bioindicatori e processi di biorimediazione per questi ecosistemi" (UFRJ / Shell Brasil / ANP) – "PROBIO-DEEP - Levantamento de potenciais impactos causas pela biorremediadores para esses ecossistemas", sponsorizzato da Shell Brasil nell'ambito del prelievo ANP R&D come "Compromisso de Investimentos com Pesquisa e Desenvolvimento. Gli autori ringraziano anche Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient'fico e Tecnol'gico (CNPq) e Coordenao de Aperfeoàoabèo de Pessoal de N'vel Superiore (CAPES) per il sostegno finanziario, e a Camila Messias, Phillipe Rosado, e Henrique Fragoso dos Santos, per le immagini fornite.