Method Article
Gli astrociti sono cellule morfologicamente complesse, esemplificate dai loro molteplici processi e territori cespugliosi. Per analizzare la loro morfologia elaborata, presentiamo un protocollo affidabile per eseguire iontoforesi gialla di Lucifero intracellulare in tessuto leggermente fissato.
Gli astrociti sono componenti essenziali dei circuiti neurali. Tile tutto il sistema nervoso centrale (CNS) e sono coinvolti in una varietà di funzioni, che includono l'autorizzazione del neurotrasmettitore, regolazione iosse, modulazione sinaptica, supporto metabolico ai neuroni, e regolazione del flusso sanguigno. Gli astrociti sono cellule complesse che hanno un soma, diversi rami principali e numerosi processi fini che contattano diversi elementi cellulari all'interno del neuropil. Per valutare la morfologia degli astrociti, è necessario disporre di un metodo affidabile e riproducibile per visualizzare la loro struttura. Riportiamo un protocollo affidabile per eseguire iontoresi intracellulare di astrociti utilizzando colorante giallo Lucifero fluorescente (LY) nel tessuto cerebrale leggermente fissato da topi adulti. Questo metodo ha diverse caratteristiche che sono utili per caratterizzare la morfologia degli astrociti. Permette la ricostruzione tridimensionale dei singoli astrociti, utile per eseguire analisi morfologiche su diversi aspetti della loro struttura. L'immunohistochimica insieme alla iontoforesi LY può anche essere utilizzata per comprendere l'interazione degli astrociti con diversi componenti del sistema nervoso e per valutare l'espressione delle proteine all'interno degli astrociti etichettati. Questo protocollo può essere implementato in una varietà di modelli murini di disturbi del SNC per esaminare rigorosamente la morfologia degli astrociti con microscopia leggera. LY iontohoresis fornisce un approccio sperimentale per valutare la struttura degli astrociti, soprattutto nel contesto di lesioni o malattie in cui queste cellule sono proposte per subire cambiamenti morfologici significativi.
Gli astrociti sono le cellule gliali più abbondanti nel sistema nervoso centrale (SNC). Essi svolgono ruoli in omeostasi iogeno, regolazione del flusso sanguigno, formazione di sinapsi così come l'eliminazione, e l'assorbimento del neurotrasmettitore1. L'ampia gamma di funzioni astrocite si riflette nella loro complessa struttura morfologica2,3. Gli astrociti contengono diversi rami primari e secondari che si dividono in migliaia di ramifici e volantini più sottili che interagiscono direttamente con sinapsi, dendriti, assoni, vasi sanguigni e altre cellule gliali. La morfologia degli astrociti varia tra diverse regioni del cervello, che possono suggerire la loro capacità di svolgere le loro funzioni in modo differenziale nei circuiti neuronali4. Inoltre, gli astrociti sono noti per alterare la loro morfologia durante lo sviluppo, durante le condizioni fisiologiche, e in più stati di malattia3,5,6.
È necessario un metodo coerente e riproducibile per risolvere con precisione la complessità della morfologia degli astrociti. Tradizionalmente, l'immunohistochimica è stata utilizzata per visualizzare gli astrociti con l'uso di marcatori proteici specifici o arricchiti di astrociti. Tuttavia, questi metodi rivelano il modello di espressione proteica piuttosto che la struttura dell'astrocito. I marcatori comunemente usati, come la proteina acida fibrillare gliale (GFAP) e la proteina legante del calcio S100 , non esprimono nell'intero volume cellulare e quindi non risolvono la morfologia completa7. Gli approcci genetici per esprimere onnipresenti proteine fluorescenti negli astrociti (iniezioni virali o linee di segnalazione di topi transgenici) possono identificare i rami più fini e il territorio generale. Tuttavia, è difficile distinguere gli astrociti individuali e le analisi possono essere di parte dalla popolazione di astrociti presa di mira dal promotore specifico8. La microscopia elettronica della sezione seriale è stata utilizzata per rivelare un quadro dettagliato delle interazioni dei processi astrociti con le sinapsi. A causa delle migliaia di processi astrociti che contattano le sinapsi, attualmente non è possibile ricostruire un'intera cella con questa tecnica9, anche se questo dovrebbe cambiare con l'uso di approcci di apprendimento automatico per l'analisi dei dati.
In questo rapporto, ci concentriamo su una procedura per caratterizzare gli astrociti del topo utilizzando la iontoresi intracellulare con colorante giallo Lucifero (LY), usando il radiato strato CA1 come esempio. Il metodo si basa sul lavoro passato pionieristico di Eric Bushong e Mark Ellisman10,11. Gli astrociti da fette di cervello leggermente fissate sono identificati dalla loro caratteristica forma di soma e riempiti con LY. Le cellule vengono poi immagini con microscopia confocale. Dimostriamo come la iontoresi LY possa essere usata per ricostruire singoli astrociti ed eseguire analisi morfologiche dettagliate dei loro processi e territori. Inoltre, questo metodo può essere applicato in combinazione con l'immunostochimica per identificare le relazioni spaziali e le interazioni tra astrociti e neuroni, altre cellule gliali e vascolatura cerebrale. Consideriamo LY iontoresis uno strumento molto adatto per analizzare la morfologia in diverse regioni del cervello e modelli murini di condizioni sane o malattie7,12,13.
Gli esperimenti sugli animali in questo studio sono stati eseguiti in conformità con il National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals e sono stati approvati dal Chancellor's Animal Research Committee presso l'Università della California, Los Angeles. In tutti gli esperimenti sono stati usati topi adulti (6-8 settimane) di genere misto.
1. Preparazione della soluzione
2. Perfusione transcardiale del topo e dissezione cerebrale
3. Preparazione delle fette
4. Preparazione dell'elettrodo
5. Riempimento astrociti con iontoforesi
6. Colorazione con Immunoistochimica (Facoltativo)
I dati riportati in questo studio provengono da cellule 7/12 da 4 topi in ogni esperimento. I dati medi sono riportati nei pannelli figura, se del caso.
Per valutare la morfologia degli astrociti, abbiamo eseguito la iontoresi intracellulare usando il tinrito LY per riempire gli astrociti nel radiato dello strato CA1, che è riassunto nella Figura 1. Figura 2 raffigura un astrocito rappresentativo e la sua struttura morfologica elaborata. La cella è stata fotoggiata post-fissaggio con l'obiettivo di immersione ad olio 60x su un microscopio a scansione laser confocale utilizzando la linea laser da 488 nm (dimensione del passo di 0,3 m e zoom digitale 3,0 x 3,5 volte). Le funzioni del tubo fotomoltiplicatore (PMT), dell'offset e del guadagno del microscopio confocale sono state regolate per creare un rapporto segnale/sfondo elevato nell'immagine finale. Nella Figura 2A, le immagini di un singolo piano ottico da diversi passaggi z (mostrate ogni 10 m, etichettate in ordine da 1/6) rivelano il soma centrale e diversi rami principali che si dividono in una fitta rete di processi. Generando una proiezione di intensità massima (dimensione dello stack di 85 m) abbiamo osservato una visione dettagliata della struttura dell'astrocito e del suo dominio (Figura 2B). Sono stati notati anche i componenti principali della struttura dell'astrocito. Figura 2 C mostra una proiezione di intensità massima di zoom (x4) di un ramo principale, diversi rami secondari e la distribuzione dei rami e dei volantini circostanti.
Le analisi morfologiche e le ricostruzioni degli astrociti sono state eseguite con il software di analisi Imaris (Table of Materials) utilizzando le immagini di post-fissazione di astrociti riempiti con LY (potrebbero essere utilizzati anche altri software come ImageJ). Dopo che la ricostruzione di ogni astrocito fu completata, furono quantificati i volumi del soma, dei rami principali, dei processi e del territorio. Il soma è stato creato per primo con un arrotondamento della superficie impostato sul limite di risoluzione del piano x-y (0,25 m). Il diametro minimo dell'oggetto è stato impostato su 3,0 m per rimuovere altri oggetti non associati al corpo della cella. Per creare i rami principali, l'intensità del soma è stata mascherata, a causa della sua luminosità rispetto al resto della cellula. L'arrotondamento della superficie e il diametro minimo dell'oggetto dei rami principali sono stati impostati su 0,3 m (dimensione del piano z). Per creare i processi, è stata anche mascherata l'intensità dei rami principali. L'arrotondamento della superficie è stato impostato su 0,18 m e il diametro minimo dell'oggetto è stato impostato su 0,3 m. Il territorio dell'astrocito è stato creato utilizzando una soglia di intensità inferiore e l'arrotondamento della superficie impostato su 0,75 m. La figura 3A mostra l'immagine originale di un astrocito CA1. Il corpo cellulare, i rami principali, i processi e il volume del territorio racchiuso dall'astrocito sono ricostruiti nella Figura 3B-E. Dopo la creazione delle ricostruzioni delle cellule, i volumi del soma, dell'intera cellula e del territorio sono stati quantificati e il numero dei rami principali è stato contato(tabella 1). Gli astrociti CA1 dello strato radiato avevano un volume medio di soma di 488,91s3, medio di 7 rami primari, volume medio delle cellule di 5,58 x 103 m3e un volume medio del territorio di 2,94 x 104 m3.
Il marcatore di astrocito ben caratterizzato, GFAP, è una proteina citoscheletrica che etichetta i filamenti intermedi di un astrocito8. Dopo che gli astrociti sono stati riempiti di colore, abbiamo eseguito l'immunostaining per GFAP per visualizzare l'espressione in singoli astrociti (Figura 4). Abbiamo scoperto che GFAP è stato espresso nel soma cellulare, nei rami principali e in alcuni rami secondari degli astrociti, ma non nei rami e nei processi più fini (Figura 4A). Non è stata riscontrata alcuna differenza significativa nel numero di rami primari etichettati da GFAP e in quelli visualizzati da LY (p - 0,1573; Figura 4 B). L'area cellulare e il volume dell'astrocito etichettato da GFAP erano significativamente più piccoli dell'area e del volume visualizzati con LY (p < 0.0001; Figura 4 C,D). Ciò dimostra che GFAP è un marcatore affidabile per l'etichettatura dei rami principali, ma non è utile per determinare l'area o il volume complessivo della cella.
Una caratteristica importante degli astrociti è il loro piedi finali, che contattano i vasi sanguigni e sono proposti per aiutare a regolare il flusso sanguigno nel SNC. Per comprendere meglio la relazione spaziale tra astrociti e vascolarizzazione cerebrale, abbiamo macchiato con anticorpi contro l'acquaporina-4 dopo il riempimento della tintura. L'acquaporina-4 è una proteina del canale d'acqua che si trova su cellule astrociti e ependymal, ed è altamente espressa in aree vicine a ventricoli e vasi sanguigni15. Abbiamo scoperto che l'acquaporina-4 è espressa su piedi finali astrociti in prossimità della vascolatura cerebrale (Figura 5A). L'immagine raffigura tre piedi finali astrociti che contattano un vaso sanguigno in luoghi diversi (indicati dalle frecce bianche). Nel CA1 strato radiatum, il numero medio di piedi d'estremità per astrocito era di 2(Figura 5B). È interessante notare che i rami che contengono i piedi d'estremità erano significativamente più spessi rispetto agli altri rami primari dell'astrocito, utilizzando le ricostruzioni principali del ramo (p - 0,0038; Figura 5 C). Abbiamo anche misurato la lunghezza dei rami contenenti piedi d'estremità dal centro del soma al vaso sanguigno e confrontato che al più breve, percorso diretto al vaso sanguigno. La lunghezza effettiva dei rami al vaso sanguigno era significativamente maggiore rispetto al percorso più breve (p - 0,0333; Figura 5 D), il che suggerisce che questi rami tendono a prendere un percorso più lungo e tortuoso verso il vaso sanguigno. Il film 1 raffigura un filmato di una ricostruzione di una colorazione di un astrocite pieno di LY e di una colorazione aquaporina-4. Le diverse componenti strutturali dell'astrocito (soma, rami principali, processi e territorio) sono rappresentate in tre dimensioni. L'astrocite con pieno di LY insieme alla colorazione dell'acquaporina-4 raffigurano gli estremi dell'astrocita che circondano il vaso sanguigno. Dalla ricostruzione dei rami principali e del vaso sanguigno, i rami che contengono i piedi d'estremità possono essere visualizzati estendendosi dal soma al vaso.
Nelle sezioni precedenti, dove vengono riportati i valori di p abbiamo usato un test t di Student non accoppiato, con significato a p < 0.05.
Figura 1: Diagramma del flusso di lavoro in LY iontoresis. Rappresentazione schematica del protocollo che evidenzia i passaggi critici. Dopo che il topo è stato perfuso con fissativo, il cervello è stato sezionato. Dopo un breve periodo di post-fissazione, le sezioni coronali furono tagliate con un vibratome. L'elettrodo è stato riempito con 1.5% LY dye. Gli astrociti sono stati identificati nel radiato a strati CA1 utilizzando IR-DIC su un microscopio luminoso. Il soma della cellula è stato impalato dall'elettrodo, e il tinriè è stato iniettato nella cellula applicando 0,5-1 V fino a quando i processi più fini non sono stati completamente riempiti. La fetta è stata immaginata con microscopia confocale utilizzando una lente ad immersione dell'acqua 40x e quindi elaborata per l'immunohistochimica. Ulteriore imaging è stato completato con una lente di immersione dell'olio 60x per eseguire la ricostruzione cellulare e l'analisi morfologica. Mostrato è un esempio di ricostruzione dei processi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: astrocito pieno di LY di radiatum allo strato CA1. (A) Immagini di un singolo piano ottico da un astrocita mostrato ogni 10 m (etichettato 1/6). (B) Proiezione massima dell'astrocito, raffigurante il soma cellulare, diversi rami principali, e numerosi processi che compongono il suo territorio cespuglioso. (C) Proiezione massima (zoom x4) di un ramo principale (dalla sezione delineata in giallo), due rami secondari, diverse ramieti e l'organizzazione dei processi circostanti. Barra di scala : 10 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Ricostruzione di un astrocito pieno di LY e dei suoi componenti. (A) Astrocito CA1 riempito con LY. (B-E) Ricostruzione tridimensionale del soma (B), soma e rami principali (C), processi (D) e territorio (E) con orientamento a 0 e 45 gradi. Barra di scala : 10 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: immunostaining GFAP in astrociti riempiti con LY. (A) Proiezione z rappresentativa delle colorazione LY (verde) e GFAP (magenta). Il GFAP è espresso principalmente nei rami primari e alcuni rami secondari dell'astrocito, ma non è stato trovato all'interno dell'intero territorio astrocite. Barra di scala - Grafico di 10 m. (B) del numero di rami primari etichettati da LY e GFAP. (C) Area cellulare indicata da colorazione LY e GFAP. (D) Volume cellulare indicato dalla colorazione LY e GFAP. I cerchi aperti sono dati grezzi con quadrati chiusi che indicano la media : SEM. I dati sono stati raccolti da 12 cellule da 4 mouse. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Immunostaining dell'acquaporina-4 negli astrociti riempiti di LY. (A) Rappresentativo z-proiezione di LY (verde) e acquaporina-4 colorazione (magenta). L'acquaporina-4 si esprime principalmente nei piedi finali dell'astrocite. Le frecce bianche indicano i tre piedi finali che contattano un vaso sanguigno nelle vicinanze. Barra della scala - 10 m. (B) Numero di rami con piedi d'estremità per astrocite. (C) Spessore dei rami con piedi d'estremità rispetto agli altri rami primari degli astrociti. (D) Lunghezza dei rami con piedi d'estremità rispetto al percorso più breve del vaso sanguigno. I cerchi aperti sono dati grezzi con quadrati chiusi che indicano la media : SEM. I dati sono stati raccolti da 7 cellule da 4 mouse. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Film 1: Ricostruzione di una colorazione di un astrocite pieno di LY e acquaporina-4. Film rappresentativo di un astrocito CA1 in prossimità di un vaso sanguigno. Il soma, i rami principali, i processi e il territorio sono stati ricostruiti per analizzare la morfologia della cellula. La ricostruzione dei rami principali insieme all'acquaporina-4 raffigura due piedi finali astrociti che contattano direttamente il vaso sanguigno. Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)
Caratteristiche morfologiche | Media : SEM |
Volume del Soma (m3) | 489 X 30 |
Numero di rami primari | 7,0 - 0,5 |
Volume delle cellule (m3) | 5580 X 425 |
Volume del territorio (m3) | 29391 - 8150 |
Numero di celle | 14 |
Tabella 1: Analisi morfologica della struttura degli astrociti. Vengono visualizzati il volume di soma astrocito, il numero di rami primari per astrocite, il volume delle cellule astrocite e il volume racchiuso dal territorio astrocito. Sono stati raccolti dati da 14 cellule da 7 topi.
Il metodo descritto in questo documento descrive un modo per visualizzare la morfologia degli astrociti utilizzando l'iontoresi intracellulare di LY dye in fette cerebrali leggermente fissate. Ci sono diversi fattori critici evidenziati in questo protocollo che contribuiscono al successo della iontoforesi LY e alla ricostruzione morfologica delle cellule. Un fattore è la qualità e la riproducibilità delle immagini, che è determinata in gran parte dall'età del topo e dal risultato della perfusione. In questo studio, abbiamo usato topi C57/BL6N di 6-8 settimane. Una perfusione di successo (altamente dipendente dalla corretta collocazione dell'ago perfuso e notato da un cervello di colore bianco e l'assenza di sangue nella vascolatura del cervello) è necessario per le cellule più dettagliate e chiaramente riempite. Dopo l'impalamento da parte di un elettrodo, la membrana cellulare deve mantenere una tenuta stretta intorno alla punta dell'elettrodo e impedire la fuoriuscita di tintura. Nonostante i migliori sforzi, occasionalmente altre strutture al di fuori della cellula saranno riempite come la pipetta viene avanzata attraverso il tessuto cerebrale: abbiamo escluso queste cellule dall'analisi. La resistenza degli elettrodi è un ulteriore fattore chiave. L'alta resistenza consente solo un'espulsione costante del tintura dalla punta dell'elettrodo dopo la stimolazione della tensione. Più tecnicamente, è importante mantenere movimenti delicati e lenti quando si impala il soma della cellula con l'elettrodo. La penetrazione degli elettrodi attraverso la cellula può portare a perdite di tintura dal soma. Un impalamento riuscito seguito dall'applicazione della tensione dovrebbe comportare il riempimento di tintura quasi immediato del corpo cellulare e dei processi (cioè entro pochi secondi). Il tempo necessario per riempire completamente un astrocito è legato al territorio che racchiude; tuttavia, attendere per assicurarsi che i processi più fini siano completamente riempiti (almeno 15 min).
Abbiamo trovato questo protocollo per essere un modo più fedele per studiare la morfologia degli astrociti in dettaglio, tuttavia, il metodo ha i suoi limiti. L'identificazione di una cella può richiedere molto tempo ed errori. Sotto IR-DIC, si dovrebbe identificare le caratteristiche distintive che contrassegnano il tipo di cella specifico (forma e dimensione soma). In alternativa, l'espressione di reporter fluorescenti rossi specificamente in astrociti, per iniezione virale o una linea di segnalazione di topi transgenici, consente una più facile identificazione di queste cellule prima del riempimento. Inoltre, LY è limitato come colorante citosolico perché non può essere utilizzato per etichettare la membrana astrocitica, in confronto all'etichettatura con una GFP legata alla membrana, come Lck-GFP16. Lck-GFP darebbe una rappresentazione più accurata dell'intera area territoriale, poiché LY iontomiresis rivela il volume interno di un astrocito. Tuttavia, a seconda del progetto sperimentale, LY iontomiresis è più adatto per risolvere l'intero volume interno degli astrociti, sviluppare ricostruzioni tridimensionali e quantificare i componenti anatomici che costituiscono la struttura di un astrocite6 . Infine, come per tutte le forme di microscopia confocale, la risoluzione spaziale è limitata dalla diffrazione, notata come funzione di diffusione dei punti dell'ottica al microscopio17. L'alterazione dei componenti del sistema di imaging, come la diminuzione del diametro del foro stenopeico, contribuirà a migliorare le immagini, ma la vera risoluzione è determinata dalla lunghezza d'onda della luce e dall'apertura numerica dell'obiettivo. Nel nostro caso, stimiamo che la migliore risoluzione possibile sia probabilmente di circa 300 nm, che probabilmente sarà peggiore nell'asse z.
LY iontohoresis offre diversi vantaggi rispetto ad altri metodi comunemente usati per etichettare gli astrociti. Il protocollo può essere applicato in qualsiasi modello di topo stabilito, popolazione cellulare o regione del cervello18,19,20 in quanto non è limitato da un promotore specifico astrocito o una linea di mouse transgenico. Gli approcci genetici per esprimere onnipresenti proteine fluorescenti negli astrociti mediante iniezioni virali o linee di topi reporter transgenici (ad esempio, td-Tomato) richiedono l'uso di un promotore di astrociti, che, in alcune regioni, possono essere espressi in altri tipi di cellule o meno includere tutti gli astrociti21. La iontoforesi LY è anche efficiente in termini di tempo, poiché le iniezioni virali di proteine fluorescenti richiedono un intervento chirurgico e tempo per esprimere il virus specifico, e le linee di topo transgenica richiedono l'allevamento. Infine, LY iontohoresis è un metodo utile per distinguere le singole cellule, mentre altre strategie dovrebbero anche essere combinate con un metodo per l'etichettatura sparse per visualizzare i territori dei singoli astrociti22,23, 24. Tuttavia, nessun metodo è una panacea e la cui scelta deve essere adattata alla questione specifica affrontata.
Studi futuri possono impiegare specifiche manipolazioni sperimentali ed esaminare diverse componenti della struttura degli astrociti (soma, rami, processi, territorio, ecc.) per rispondere a domande morfologiche. Questo potrebbe fornire approfondimenti e direzione nella morfologia degli astrociti e nelle sue implicazioni funzionali, che potrebbero essere analizzate ulteriormente mediante microscopia luminosa super-risoluzione o microscopia elettronica4. Ad esempio, LY iontohoresis fornisce un mezzo per visualizzare processi astrociti fini, che contattano migliaia di sinapsi e sono coinvolti in funzioni sinaptiche. Lo studio di come la struttura di questi processi cambia in diverse condizioni patologiche potrebbe aiutare a chiarire i ruoli degli astrociti nella salute e nella malattia. LY iontohoresis è una tecnica importante per visualizzare la morfologia cellulare dettagliata e caratterizzare le proprietà degli astrociti per comprendere meglio le loro funzioni nel sistema nervoso centrale.
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Gli autori ringraziano la signora Soto, il dottor Yu e il dottor Octeau per la guida e i commenti sul testo. Questo lavoro è supportato da NS060677.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher | SF 100-20 | An identical alternative can be used |
Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane | Pall | 4692 | An identical alternative can be used |
Ag/AgCl ground pellet | WPI | EP2 | A similar alternative can be used |
Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L) | Thermo Scientific | A-11040 | A similar alternative can be used |
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Scientific | A27040 | A similar alternative can be used |
Anti Aquaporin-4 antibody | Novus Biologicals | NBP1-87679 | A similar alternative can be used |
Anti GFAP antibody | Abcam | ab4674 | A similar alternative can be used |
Borosilicate glass pipettes with filament | World precision instruments | 1B150F-4 | |
C57BL/6NTac mice | Taconic Stock | B6 | A similar alternative can be used |
Calcium Chloride | Sigma | 21108 | An identical alternative can be used |
Confocal laser-scanning microscope | Olympus | FV1000MPE | A similar alternative can be used |
D-glucose | Sigma | G7528 | An identical alternative can be used |
Disodium Phosphate | Sigma | 255793 | An identical alternative can be used |
Electrode puller- Model P-97 | Sutter | P-97 | A similar alternative can be used |
Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | An identical alternative can be used |
Heparin sodium injection (1,000 USP per mL) | Sagent Pharmaceuticals | 400-10 | An identical alternative can be used |
Imaris software (Version 7.6.5) | Bitplane Inc. | A similar alternative can be used | |
Isofluorane | Henry Schein Animal Health | 29404 | An identical alternative can be used |
Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%) | Clipper | 1050035 | An identical alternative can be used |
Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma | L0259 | |
Lucifer Yellow CH dipotassium salt | Sigma | L0144 | |
Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | An identical alternative can be used |
Microscope Cover Glass | Thermo Scientific | 24X60-1 | An identical alternative can be used |
Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | An identical alternative can be used |
Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | An identical alternative can be used |
Objective lens (40x) | Olympus | LUMPLFLN 40XW | A similar alternative can be used |
Objective lens (60x) | Olympus | PlanAPO 60X | A similar alternative can be used |
PBS tablets, 100 mL | VWR | VWRVE404 | An identical alternative can be used |
Pipette micromanipulator- Model ROE-200 | Sutter | MP-285 / ROE-200 / MPC-200 | A similar alternative can be used |
Potassium Chloride | Sigma | P3911 | An identical alternative can be used |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | An identical alternative can be used |
Sodium Chloride | Sigma | S5886 | An identical alternative can be used |
Stimulator- Model Omnical 2010 | World precision instruments | Omnical 2010 | A similar alternative can be used |
Triton X 100 | Sigma | T8787 | An identical alternative can be used |
Vibratome- Model #3000 | Pelco | 100-S | A similar alternative can be used |
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