Istituzione di un modello di occhio secco severo utilizzando la dacrigofectomia completa nei conigli

Viene presentato un nuovo approccio per indurre la malattia cronica dell'occhio secco nei conigli rimuovendo chirurgicamente tutte le ghiandole lacrimali orbitali. Questo metodo, distinto da quelli precedentemente riportati, produce un modello stabile e riproducibile di un occhio secco carente acquoso adatto allo studio della fisiologia lacrimale e della fifisiologia e terapia oculare.

La malattia dell'occhio secco (DED) è una malattia complessa con eziologie multiple e sintomi variabili, avendo l'infiammazione della superficie oculare come passo patofisiologico chiave. Nonostante i progressi nella nostra comprensione del DED, permangono notevoli lacune di conoscenza. I progressi sono limitati in parte a causa della mancanza di modelli animali informativi. Gli autori hanno recentemente riferito su un metodo di DED indotto iniettando tutti i tessuti della ghiandola lacrimale orbitale (LG) con la concagallo della lectina A. Qui, riportiamo un nuovo modello di DED abbondante-carente basato sulla resezione chirurgica di tutti i tessuti orbitali LG (dacryoadenectomy). Entrambi i metodi utilizzano conigli a causa della loro somiglianza con gli occhi umani in termini di dimensioni e struttura della superficie oculare. Una settimana dopo la rimozione della membrana nictiitating, l'Orbital superior LG è stato rimosso chirurgicamente in anestesia, seguito dalla rimozione dell'LG superiore palpebrale, e infine la rimozione dell'Inferiore LG. marcata riduzione del tempo di rottura della lacrima e del test lacrimale di Schirmer, e ha aumentato significativamente l'osmolarità lacrimale e la colorazione bengala della rosa. Il DED indotto dalla dacrigectomia è durato almeno otto settimane. Non ci sono state complicazioni e gli animali hanno tollerato bene la procedura. La tecnica può essere padroneggiata relativamente facilmente da coloro che hanno un'adeguata esperienza chirurgica e l'apprezzamento dell'anatomia del coniglio pertinente. Poiché questo modello riassume le caratteristiche del DED acquoso-carente umano, è adatto per studi di omeostasi superficiale oculare, DED e terapie candidate.

Le lacrime sono necessarie per la protezione della superficie oculare e per il mantenimento delle proprietà ottiche della cornea. Sono costituiti da tre strati: un rivestimento mucina interno, un componente acquoso medio e una sovrapposizione lipidica¹. Lo strato di mucina è prodotto prevalentemente nelle cellule di calice della congiuntiva, la componente acquosa prevalentemente nelle ghiandole lacrimali (LG), e lo strato lipidico prevalentemente nelle ghiandole meiboiche^1,2. Gli LG orbitali sono la fonte principale per la componente acquosa delle lacrime e per molte delle proteine che proteggono la superficie dall'attacco batterico³. Le malattie della superficie oculare si verificano quando la produzione di strappi acquosi diminuisce al di sotto di un livello critico, privando le superfici epiteliali dell'occhio della componente acquosa e costituenti lacrimali cruciali tra cui fattori di crescita, lisozyme e lactoferina. Nei casi di diminuzione della produzione di strappi da parte dei LG, i tessuti congiuntivi e corneali subiscono adattamenti per compensare l'ambiente alterato.

Comprendere il contributo della componente lacrimale derivato dagli LG orbitali e dai meccanismi compensativi della superficie oculare quando ciò manca influisce sul nostro apprezzamento della fisiologia e della fifisiologia del segmento anteriore dell'occhio e, più in generale, della salute e della malattia in tutto il globo. L'approccio sperimentale a questi temi richiede un modello animale informativo. Di conseguenza, diversi gruppi hanno tentato di sviluppare modelli animali in cui vengono rimossi gli LG orbitali, facilitando così la valutazione del ruolo delle lacrime nella salute oculare. Uno di questi modelli è stato recentemente segnalato per il mouse⁴. Il coniglio offre, tuttavia, molti vantaggi distinti rispetto ai modelli di roditori tra cui simili strutture anatomiche e istologiche dell'LG, e forse ancora più importante, dimensioni e superficie simili della cornea e dei tessuti congiuntivi rispetto alle loro controparti umane³.

La creazione di una malattia dell'occhio secco carente (DED) acquosa mediante resezione chirurgica del tessuto LG nei conigli non è nuova. Numerosi rapporti descrivono la resezione dei tessuti LG con scarso successo riflesso in cambiamenti variabili nella produzione di strappi misurati dal test lacrimale di Schirmer^5,6,7,8. Una comprensione approfondita dell'anatomia rilevante del coniglio e la chiarezza sulla terminologia anatomica sono molto utili per riprodurre questo metodo. Di seguito viene fornita una panoramica completa di entrambi.

Anatomia delle ghiandole lacrimali

Il coniglio ha due LG orbitali: il più grande LG inferiore (ILG) e il più piccolo Superiore LG (SLG; Figura 1). L'ILG si estende lungo l'aspetto inferiore e posteriore del bordo orbitale. Ad eccezione delle dimensioni variabili, la parte anteriore dell'ILG ha un aspetto bulboso abbastanza uniforme che può essere visto come una protuberanza nella pelle sotto il globo (Figura 2). A causa del suo aspetto caratteristico in relazione al resto della ghiandola, è indicato come la "testa" dell'ILG. Una parte della testa si avvolge e si trova sulla superficie esterna dell'osso zigomatico. Questo serve come un punto di riferimento utile sulla biomicroscopia ad ultrasuoni per guidare le iniezioni nell'ILG. Il resto della testa risiede più mediamente⁹ nell'orbita.

A causa dell'aspetto caratteristico della porzione rimanente dell'ILG, che è lunga e sottile, questo segmento è indicato come la "coda". La coda corre lungo il bordo orbitale inferiore, dalla testa dell'ILG al bordo orbitale dove termina con anatomia variabile al bordo orbitale inferiore e posteriore (Figura 3A). La coda si trova profonda (mediale) all'osso zigomatico separato dal contenuto orbitale da una banda fasciale per la maggior parte del suo corso fino a raggiungere il bordo posteriore dell'orbita dove si estende ancora una volta sulla superficie esterna dell'osso zigomatico. L'ILG riceve il suo apporto di sangue dai rami dell'arteria carotide.

Il SLG ha due componenti analoghi all'uomo. Uno è il palpebral superiore LG (PSLG), che risiede nella palpebra posteriore superiore mediale alla piastra tarsale. Appare bulboso in natura e ha numerose aperture forati che drenano liquido lacrimale acquoso che è più facilmente visibile quando coperto con 2% fluoresceina (Figura 3B).

Il secondo è il superiore orbitale LG (OSLG), che risieda in una posizione mediale nell'orbita superiore (Figura 3C). A causa della sua posizione vicino alla linea mediana del cranio, è stato impossibile identificarlo con successo utilizzando approcci chirurgici esterni dall'orbita temporale o inferiore. In campioni di necropsia freschi o casi chirurgici, questa ghiandola può essere prolassata attraverso l'incisure posteriore situata nella superficie dorsale del cranio quando viene applicata una leggera pressione mediale al globo. Prolapse di questo tessuto ghiandolare può essere documentato con biomicroscopia ecografica.

Il PSLG e OSLG sono strutture contigue. L'OSLG è una struttura tubuloalveolar la cui architettura duttale si fonde nel condotto escretore principale. Questo condotto passa sotto la cresta sovraorbitale e corre nei tessuti del coperchio superiore che terminano nel PSLG. Lungo il condotto escretore, tessuto ghiandolare coerente con le descrizioni originali di Davis è stato identificato¹⁰ (Figura 3D).

Una nota sulla terminologia

Descrizioni anatomiche eccellenti e complete utilizzano anche una terminologia variabile. La classica anatomia orbitale di Davis definisce solo un LG¹⁰superiore e inferiore. Tuttavia, la sua descrizione dell'LG superiore dettaglia chiaramente le porzioni più specificamente definite qui come PSLG e OSLG, mentre la sua descrizione dell'LG inferiore dettaglia le porzioni definite qui come la testa e la coda dell'ILG. Un atlante anatomico più recente e approfondito¹¹ definisce questi tessuti come la ghiandola zigomatica e l'accessorio LG. Il termine "ghiandola lacrimale" è usato qui per comprendere il suddetto PSLG e OSLG. Questa terminologia è più adatta per riprodurre questo metodo senza confusione indebita.

Tutti gli studi sugli animali vertebrati sono stati completati in conformità e nel rispetto di tutte le linee guida normative e istituzionali pertinenti. Tutti gli studi sono stati approvati dall'Institutional Review Board della Stony Brook University e sono stati eseguiti in conformità con la dichiarazione dell'Associazione per la ricerca in visione e oftalmologia (ARVO) per l'uso di animali nella ricerca oftalmica e visionaria.

1. Animali e alloggi

1. Usate i conigli bianchi neozelandesi del peso di 2/3 kg.
2. I conigli domestici singolarmente in un ambiente rigorosamente controllato: temperatura (65 x 5 gradi centigradi), umidità (45 x 5%) e illuminazione (12 h su/ fuori ciclo).
   NOTA: A causa di comportamenti aggressivi spesso esposti tra conigli ospitati in gruppo, tenere gli animali in gabbie individuali per prevenire lesioni oculari involontarie.
3. Concedi ai conigli un accesso illimitato al chow di coniglio standard e all'acqua.
4. Non fornire altri arricchimenti dietetici in modo da prevenire il completamento involontario di vitamina A che potrebbe influenzare l'occhio secco.
5. Conigli Acclimati almeno due settimane prima della registrazione dei parametri DED.

2. Rimozione della membrana nictitante

NOTA: Per semplicità, la tecnica per l'occhio destro è descritta di seguito. Completare questa procedura sull'occhio sinistro in modo identico.

1. Rimuovere la membrana nictitante bilateralmente durante il periodo di acclimatazione (di solito la prima settimana).
2. Mettere il coniglio in un sacchetto di contenimento di dimensioni appropriate.
3. Somministrare un'iniezione sottocutanea di acepromazina (1 mg/kg) sulle spalle utilizzando una siringa da 1 cc e un ago da 26 G per sedare il coniglio. Il punto finale per questa sedazione lieve è quando l'animale mantiene una posizione rilassata della testa senza normali movimenti di scansione e le sue orecchie non sono più completamente in posizione verticale.
4. Utilizzando una micropipetta, applicare 25 - L di lidocaina senza conservanti (1%) all'occhio. Inserire uno speculum del coperchio del filo tra le palpebre.
5. Afferrare la membrana nictitante al suo apice con 0,3 pinze (o equivalenti) e tirarla sulla superficie corneale. Iniettare l'1% lidocaina con 1:100,000 epinefrina nello spazio subcongiuntivale della membrana nictitante utilizzando un ago da 26 G. Iniettare circa 0,3 mL per formare un bleb di dimensioni modeste sulla membrana nictitante. I volumi di iniezione superiori a 1 mL sono ben all'interno di una gamma di dosi sicure per i conigli (2-4 mg/kg).
6. Rimuovere lo speculum del filo. Attendere circa 5 min per la lidocaina e l'epinefrina per avere effetto. Durante questo periodo, eseguire la stessa procedura nell'occhio.
7. Sostituire lo spettro del coperchio del filo. Afferrare ed estendere la membrana nictitante sulla superficie corneale utilizzando 0,3 pinze. Tagliare la membrana alla sua base con forbici tenotomiche o equivalenti.
   NOTA: Il sanguinamento è solitamente minimo, ma mantieni un'unità di cautario della batteria ad alta temperatura nelle vicinanze e usala in base alle esigenze per ridurre al minimo il sanguinamento. La pressione diretta sulla base di taglio della membrana nictitante può essere utilizzata anche per fermare un piccolo sanguinamento se si verifica.
8. Rimuovere lo spettro del coperchio del filo. Posizionare unguento antibiotico topico (neomicina, polimyssina, bacbactracin e idrocortisone) sulla superficie corneale.
9. Eseguire una procedura identica all'occhio come indicato dal protocollo.
10. Riporre gli animali in gabbie individuali e lasciare guarire per almeno una settimana, o fino a quando la superficie congiuntivale non è guarita completamente dal punto di vista clinico, prima di eseguire ulteriori analisi o interventi.
    NOTA: la completa guarigione clinica è indicata dalla mancanza di gonfiore, iniezione o scarico dalle superfici congiuntivali. Gli animali dovrebbero tenere gli occhi aperti normalmente, senza la presenza di ptosi protettiva.

3. Misurazione dei parametri dell'occhio secco e raccolta di campioni di strappo

1. Misurare i seguenti parametri DED, a seconda del protocollo sperimentale: osmolarità lacrimale, tempo di rottura della lacrima, test lacrimale di Schirmer e colorazione bengala rosa. Eseguili come descritto in precedenza¹², con un team di almeno due investigatori.
   NOTA: Un team di almeno due ricercatori consente la misurazione efficiente di gruppi più grandi di animali (6 o più) con lo stesso orologio, impedendo così possibili variazioni circadiane dai risultati impattanti.

4. Preparazione chirurgica e anestesia

1. Animali leggermente sedati messi in un sacchetto di contenimento con acepromazina sottocutanea come sopra (1 mg/kg).
2. Rimuovere tutta la pelliccia sul viso e sulla superficie dorsale del cranio per visualizzare i punti di riferimento chirurgici.
   1. Tagliare la pelliccia con le cesoie di taglio lasciando una pelliccia fine residua di circa 1 mm di lunghezza (Figura 4A, sinistra).
   2. Rimuovere tutta la pelliccia residua con crema depilatoria leggera seguendo le istruzioni del produttore (Figura 4A, a destra).
3. Contrassegnare i siti di incisione chirurgica con una penna chirurgica.
   1. Identificare il sito di incisione sopra l'incisure posteriore applicando una pressione mediale al globo causando un piccolo rigonfiamento a svilupparsi nella pelle sopra l'incisure posteriore dal prolasso dell'OSLG.
   2. Fai un segno lineare di 2 cm nella direzione anteriore/posteriore sulla pelle sulla superficie dorsale del cranio direttamente su questo sito con una penna di marcatura chirurgica.
   3. Durante la pianificazione dell'incisione per la rimozione dell'ILG, segnare una lunga linea curvilinea intorno all'occhio (1 cm dal margine inferiore e temporale del coperchio) che si estende dall'orbita posteriore (temporale) al canto anteriore (mediale). Rendere la marcatura estendere lungo l'orbita posteriore al livello del canto mediale o semplicemente superiore a questo (Figura 4B). In alcune dissezioni, le incisioni per rimuovere l'OSLG e il ILG saranno collegati.
      NOTA: quando si esegue un intervento chirurgico bilaterale, contrassegnare entrambe le orbite in questo momento.
4. Tagliare una macchia di pelliccia larga da 2 a 3 cm con cesoie sulla superficie laterale di ogni coscia per consentire il posizionamento di una piastra di cautery monopolare.
   1. Applicare il gel ad ultrasuoni per garantire un buon contatto elettrico con la piastra monopolare.
5. Mettere un catetere intravenoso (IV) da 25 G in una delle vene marginali dell'orecchio per somministrare farmaci o liquidi, se necessario.
6. Dare ketamina sottocutanea (1 mg/kg) e chetamina IV (15 mg/kg) per l'induzione iniziale dell'anestesia (attraverso l'accesso IV).
   NOTA: Se il coniglio è sedato in anticipo con acepromazine sufficiente a mantenere l'endpoint descritto al passaggio 2.3, utilizzare la sedazione della maschera antigas con isoflurane come alternativa.
7. Posizionare una maschera di laringea che si tiene in posizione utilizzando una fascia elastica o una corda per fissare e mantenere le vie respiratorie.
   1. Collegare la maschera alla macchina per l'anestesia con il flusso di ossigeno impostato a 1 L/min.
   2. Impostare inizialmente l'isoflurane al 5% e quindi ridurre come tollerato in base al livello di sedazione animale.
   3. Mantenere l'isoflurane a o sopra il 2% fino alla chiusura finale della ferita.
      NOTA: Valutare il livello di sedazione monitorando la frequenza respiratoria e i movimenti in risposta a stimoli chirurgici o dolorosi. Aumentare la profondità dell'anestesia se la frequenza respiratoria aumenta sopra 10 respiri al minuto, se il coniglio inizia a masticare il manutentore delle vie aeree, o se si osservano movimenti in risposta a stimoli dolorosi.
8. Monitorare l'ossimetria dell'impulso, la capnografia, la pressione sanguigna, la temperatura corporea rettale e la frequenza cardiaca utilizzando un dispositivo di monitoraggio multi-parametro o altri dispositivi appropriati.
   1. Monitorare i vitali in modo continuo durante la procedura e registrare ogni 10 a 15 min.
9. Posizionare il coniglio sul tavolo della sala operatoria (OR) su una piastra di riscaldamento per evitare l'ipotermia. Inclinare il tavolo in una posizione inversa di Trendelenburg a circa 30 gradi per ridurre al minimo il sanguinamento.
10. Preparare l'area chirurgica con una soluzione povidone-iodio diluita a metà forza con acqua sterile e drappo in modo da mantenere un campo sterile.

5. Dacricinaectomia chirurgica completa

NOTA: La dacrioadenectomia chirurgica completa, come descritto qui, è stata fatta usando 0,3 pinze tissutali, forbici da notomia, pinze di tessuto non dente e forbici. Questi strumenti possono essere scambiati con strumenti simili che svolgono la stessa funzione in base alle preferenze del chirurgo.

1. Rimuovere prima l'OSLG.
   1. Infiltrare i siti di incisione (linee di penna di marcatura chirurgica e coperchio posteriore superiore) con una miscela 50:50 di 2% lidocaina con 1:100,000 epinefrina e 0.5% bupivacaine utilizzando una siringa 5 cc con un ago da 30 G (Figura 5A).
      NOTA: le dimensioni della siringa e dell'ago non sono critiche.
   2. Utilizzare un ago Colorado collegato a un'unità elettrochirurgica per fare le incisioni cutanee lungo le marcature chirurgiche. Le impostazioni possono variare in base alla risposta clinica e in genere sono comprese tra 10 e 15 unità sia per il taglio che per la coagulazione (Figura 5B).
   3. Applicare la tensione opposta attraverso l'incisione della pelle per separare i tessuti ed esporre le fibre muscolari frontoscutularis sottostanti.
   4. Applicare la pressione mediale sul globo per aiutare la visualizzazione dell'OSLG, visto come tessuto sporgente situato appena mediale o profondo alle fibre muscolari frontoscutularis. Se necessario, spostare queste fibre muscolari di lato al fine di esporre l'incisure sottostante.
   5. Con pinze dentate (0,3) e forbici capsulotomia, ritrarre delicatamente e tagliare la capsula fibrosa sovrastante l'OSLG. L'OSLG ha in genere un colore di abbronzarsi pallido (Figura 5C).
   6. Utilizzando pinze dentate o non dentellate, afferrare il tessuto della ghiandola OSLG e tirarlo delicatamente fuori attraverso l'incisure superiore utilizzando una tecnica "mano su mano". Tagliare piccole bande fibrose con forbici capsulotomia per liberare la ghiandola dalla sua posizione nell'orbita (Figura 5D).
      NOTA: Quando il tessuto della ghiandola OSLG viene rimosso, inizierà a fondersi in una grande struttura simile a un tubo (condotto escretore principale).
   7. Quando la ghiandola è stata rimossa nel modo più completo possibile, utilizzare generoso cauzio con l'ago del Colorado per creare il char tissutale, troncando la ghiandola all'interno dell'incenerimento il più profondamente possibile. Questo servirà in seguito come punto di riferimento confermativo durante la rimozione del PSLG.
2. Rimuovere il PSLG.
   1. Evert la palpebra superiore utilizzando un applicatore con punta di cotone. L'estremità bulbosa del PSLG è di solito facilmente visibile.
      NOTA: In alcune dissezioni anatomiche, potrebbe essere possibile visualizzare il condotto escretore principale come una struttura lineare pallida larga circa 1 o 2 mm.
   2. Impegnare il PSLG con pinze dentate (0,3) e ritrarla dalla superficie delle palpebre mentre si utilizzano le forbici capsulotomia per tagliarlo intorno alla sua base separandolo dal tarso sottostante (Figura 6A).
   3. Controllare sanguinamento moderato con il cavolo monopolare.
   4. Applicare la trazione continua sul tessuto separato per mantenere un piano di tessuto per la dissezione. Ciò consentirà di rimuovere anche il condotto escretore principale del SLG(Figura 6B).
      NOTA: Man mano che viene effettuata la dissezione, in genere avanzerà al bordo orbitale superiore dove è possibile vedere i segni di cautery lasciati dalla rimozione dell'OSLG più superiore e medialmente situato.
3. Resect il ILG.
   1. Lasciare agire almeno 5 min per l'anestetico locale.
   2. Incise la pelle, il muscolo depressore della palpebra inferiore, la parte zigomaticadela del muscolo zigomatico, e il muscolo orbicularis con l'ago di microdisezione del Colorado e separati come per l'OSLG nella sezione 5.1.
   3. Mantenere l'emostasi con l'cauterio monopolare.
   4. Mentre l'incisione viene portata più in profondità attraverso la marcatura della pelle, cercare la risassuala di un piano fasciale sopra l'osso zigomatico o parte superficiale del muscolo masseter. A questo punto, mantenere il piano tissutale e portarlo in superiorità verso il bordo orbitale utilizzando l'ago del Colorado per il taglio (Figura 7A).
      NOTA: Allo scopo di identificare l'ILG, è più facile eseguire questa parte della dissezione sulla testa dell'ILG che è tipicamente inferiore al limbo anteriore dell'occhio.
   5. Dopo aver identificato e inciso la capsula che circonda l'ILG, identificare il tessuto l'angucio dell'ILG. Solo la parte anteriore della testa ILG sarà visibile (Figura 7B). Tuttavia, la testa può essere seguita mediamente mentre passa sotto l'arco zigomatico e passa nella coda (Figura 7C).
   6. Utilizzare forbici tenotomiche per tagliare il setto orbitale lungo il bordo inferiore esponendo la porzione più posteriore della coda ILG. Una volta identificato il piano tissutale, estendere la dissezione posteriormente lungo l'intera linea diincisione( Figura 7D).
      NOTA: Il condotto dell'ILG passa attraverso i tessuti connettivi fibrosi inferiori per entrare nello spazio congiuntivale inferiore nell'aspetto temporale del coperchio. Sul bordo posteriore, la coda dell'ILG può avere diverse configurazioni anatomiche. A volte termina inferiore al canthus posteriore (laterale), mentre in altre dissezioni si estende in modo più superiore intorno all'orbita temporale.
   7. Utilizzare estrema cura per prevenire danni involontari all'afflusso di sangue, che l'ILG riceve dai rami dell'arteria carotidea. L'afflusso di sangue può essere visto durante questa parte della dissezione (Figura 7E).
   8. Nei casi in cui la coda termina sotto il canto posteriore (laterale), potrebbe essere necessario sezionare la parte temporale del muscolo frontoscutore per esporre la coda dell'ILG, che si trova lungo l'osso zigomatico.
   9. Dopo che l'intero ILG è stato isolato ed esposto, rimuoverlo. A causa delle sue grandi dimensioni, è spesso preferibile tagliare la ghiandola a metà con le forbici e rimuovere la testa separatamente dalla coda.
   10. Procedere con molta cautela quando si rimuove la testa dell'ILG in quanto si trova immediatamente adiacente a un grande seno venoso nell'orbita. Anche se il sanguinamento da questa struttura durante le resezioni chirurgiche non si è verificato, hanno ampi aiuti emostatici presenti per mitigare questo rischio.
   11. Dopo la rimozione di tutto il tessuto della ghiandola, chiudere il piano del tessuto connettivo profondo con più suture terephthalate di etilene a 0-0 interrotte. Chiudere i muscoli superficiali e la pelle con una sutura 2-0 polyglactin 910 (Figura 7F) utilizzando 0,3 pinze tissutali e un driver di ago.

6. Cura postprocedurale

1. Undrape gli animali e pulire i siti chirurgici con acqua sterile.
2. Applicare antibiotico oftalmico topico e unguento steroide (neomicina, polimysina, bacbactracin, e idrocortisone) alle incisioni. Continuare questa applicazione due volte al giorno per 2 giorni.
3. Dare un'iniezione sottocutanea di 20 mL salina normale sopra le scapole utilizzando un ago da 26 G.
4. Dare buprenorfina sottocutanea 0.01 mg/kg o ketoprofene 3 mg/kg per il controllo del dolore utilizzando una siringa da 1 cc e un ago da 30 G.
   NOTA: Gli animali devono tornare alla loro normale assunzione e attività dietetiche entro 1/2 giorni. I conigli devono essere valutati almeno settimanalmente per i segni clinici di infezione come evidenziato da gonfiore progressivo, dolore, erendo, calor o scarico purulento sui siti di incisione. Gli animali devono anche essere osservati per assicurarsi che non inizino a graffiare i siti di incisione / linee di sutura. Tagliare tutti gli artigli prima della dacrigectomia può essere utile a questo proposito. Se si osservano graffi le linee di incisione, i collari protettivi standard possono essere utilizzati per prevenire lesioni personali.
5. Invertire l'anestesia.
   1. Rimuovere il manutentore delle vie aeree dopo che l'animale risponde agli stimoli e inizia a mostrare masticazione spontanea, ma prima che il manutentore delle vie aeree possa essere danneggiato.
   2. Monitora gli animali per circa 1/2 h o fino a quando non si sono completamente ripresi dall'anestesia come evidenziato dal movimento spontaneo nelle loro gabbie.
   3. Valutare gli animali per il dolore e trattare in modo appropriato.
6. Consentire agli animali di recuperare per almeno 1 settimana dopo l'intervento chirurgico prima di effettuare qualsiasi misura clinica di DED.

Il metodo completo di dacriadenectomia descritto qui è stato eseguito su 8 animali. Richiede un grado moderato di abilità chirurgica. Il tempo chirurgico era in media di circa 2,2 h per la chirurgia bilaterale, escludendo la rimozione della membrana nictiitating, che è stata fatta separatamente e necessaria <10 minuti. Non ci sono stati decessi o complicazioni intraoperatorie e nessun coniglio ha richiesto alcun aiuto emostatico diverso dal cavolo modesto.

Il nostro approccio chirurgico ha indotto con successo l'occhio secco in tutti gli occhi. Ciò è stato confermato da un gruppo di marcatori clinici e di laboratorio di DED(Tabella 1). Durante le 8 settimane di osservazione, il TBUT medio è stato soppresso da oltre il 75% dei livelli preoperatori (p < 0,0001 per tutti i punti temporali). Allo stesso modo, il test di lacrima dello Schirmer è diminuito di circa il 50%, rimanendo così per le 8 settimane di osservazione; non ha mostrato alcuna tendenza alla ripresa durante il periodo di follow-up. Postoperatorio, osmolarità lacrima ha mostrato un aumento del 10% coerente con DED, sostenuto per almeno 8 settimane postoperatorie. Rose colorazione bengala della cornea anche aumentato e non ha mostrato segni di recupero durante le 8 settimane di follow-up (Figura 8). Tutti gli occhi sottoposti a dacrioadenectomia completa hanno mostrato una notevole riduzione dei numeri di cellule del calice e dei cambiamenti epiteliali coerenti con la citologia dell'impressione congiuntivale).

Figura 1: Anatomia della ghiandola lacrimale del coniglio (occhio destro). La ghiandola lacrimale superiore orbitale (OSLG) è costituita da una parte orbitale più grande e da una componente palpebrale più piccola. La più grande ghiandola lacrimale inferiore (ILG) è costituita dalle porzioni anteriori/testa e posteriore/coda. Gli assi delle coordinate mostrano la terminologia utilizzata per tutte le descrizioni dell'orientamento utilizzate all'interno del testo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Posizione della testa del ILG. La vista laterale della faccia destra dopo la rimozione della pelliccia. Un rigonfiamento nel contorno della pelle (indicato da frecce spesse) inferiore all'orbita anteriore indica la posizione della testa dell'ILG che si trova sulla superficie esterna dell'osso zigomatico in questa posizione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Le ghiandole lacrimali orbitali. (A) La ghiandola lacrimale inferiore destra (ILG) dopo la colorazione blu di Evans che mostra la vicinanza della coda dell'ILG (freccia rossa) appena mediale all'osso zigomatico (freccia nera) e inferiore al globo. (B) Produzione di strappi dalla ghiandola lacrimale superiore palpebrale (PSLG). Foto time-lapse scattate dopo l'applicazione topica del 2% di fluoresceina. Il liquido aqueoso emanato dal PSLG diluisce il colorante fluoresceina inizialmente blu scuro o nero trasformandolo di verde giallo brillante (simile al test Seidel). (C) Posizione dell'Orbital SLG (OSLG) nel cranio del coniglio, sdraiato vicino alla linea mediana del cranio (linea tratteggiata) all'interno dell'incisure posteriore (freccia). Il colorante blu Evans è stato iniettato nella ghiandola lacrimale superiore di OSLG e palpebrale. (D) Sezione istologia attraverso il principale condotto escretorio dell'OSLG circondato da una piccola quantità di tessuto ghiandolare (freccia) è visto in questa sezione trasversale istopatologica macchiata con coloranti ematossia e esosina presi attraverso l'aspetto posteriore (temporale) della palpebra superiore destra. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Preparazione chirurgica del sito. (A)Pannello in alto a sinistra: Rimozione della pelliccia lunga con cesoie. Tutta la pelliccia fine residua viene successivamente rimossa con una crema depilatoria lieve. Pannello in alto a destra: aspetto finale dopo la rimozione completa della pelliccia che consente di marcatura chirurgica e ultrasuoni di alta qualità dell'ILG da eseguire. (B) Sono indicate marcature chirurgiche appropriate della regione periorbitale destra; in questo esempio, le incisioni per rimuovere l'OSLG e ILG sono state collegate per creare una lunga incisione curvilineo. La posizione dell'incisure posteriore è indicata da un piccolo segno di hash sulla marcatura del sito di incisione curvilineo (freccia). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Rimozione dell'OSLG. (A) I siti chirurgici sono infiltrati con anestetico utilizzando una combinazione 50:50 di 2% lidocaina con 1:100,000 epinefrina e 0,5% bupivacaina, che viene iniettata nel coperchio superiore e lungo le linee di incisione per ridurre al minimo durante la procedura. (B) Un ago di microdisezione del Colorado viene utilizzato per incise la pelle e gli strati muscolari superficiali lungo i siti di incisione chirurgica pre-marcati. La trazione delicata attraverso la ferita viene applicata per aiutare a creare il piano di dissezione. Le piccole ustioni (freccia) sono state fatte con l'ago del Colorado in punti equidistanti lungo la linea di incisione per aiutare a riallineare in modo ottimale i tessuti durante la chiusura della ferita. (C) L'OSLG è esposto dopo che i tessuti sovrastanti l'incisure posteriore sono stati mobilitati (freccia). La capsula della ghiandola è stata incisa. L'OSLG può essere prolassato applicando una pressione mediale al globo facilitandone la rimozione. (D) Le pinze sono utilizzate per attaccare l'OSLG e rimuoverlo delicatamente dalla sua posizione più profonda all'interno dell'orbita attraverso l'incenerimento posteriore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Rimozione della ghiandola lacrimale superiore palpebrale (PSLG) e del condotto escretorio. (A) A seguito dell'eversione della palpebra superiore, la parte bulbosa del PSLG è impegnata con pinze e sezionata dal tarso con le forbici. La trazione applicata al PSLG con pinze è fondamentale per mantenere il piano chirurgico. (B) La dissezione del PSLG e del condotto lacrimale principale viene trasportata in modo superiore verso il bordo orbitale utilizzando una dissezione tagliente e una trazione continua sui tessuti della ghiandola e del condotto per mantenere il piano chirurgico appropriato. La dissezione dovrebbe procedere al punto in cui l'OSLG è stato rimosso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Rimozione del GRUPPO. (A) La pelle e il muscolo superficiale vengono incisi fino a raggiungere il piano fasciale sovrastante l'osso zigomatico o parte superficiale del muscolo massetore. La testa dell'ILG di solito è chiaramente evidente come un piccolo rigonfiamento situato sotto il limbo anteriore. (B) La capsula fibrosa dell'ILG è incisa con le forbici che espongono l'ILG. Una volta che la capsula è incisa, le parti più profonde della ghiandola possono essere facilmente rimosse. (C) La parte più esterna della testa di ILG che si trova sull'osso zigomatico è stata esposta e riflessa anteriormente mostrando l'osso zigomatico sottostante. (D) Incisione del setto orbitale lungo il bordo inferiore espone la coda dell'ILG. (E) Un ramo dell'arteria carotide esterna alimenta la coda dell'ILG (freccia). (F) Aspetto dopo la chiusura delle incisioni cutanee dopo la completa dacrigectomia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Colorazione del Bengala Rosa della superficie corneale. Fotografia esterna che mostra una colorazione prominente, più notevole sul quadrante nasale. Tutti gli occhi sottoposti a dacrigofectomia completa hanno sviluppato cambiamenti simili che erano evidenti da 1 settimana dopo l'intervento chirurgico e persistevano per almeno 6 settimane. Da notare che il riflesso luminoso del flash dell'anello mostra una distorsione da una superficie oculare secca che dimostra come l'occhio secco può influire negativamente sulla visione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Parametri dell'occhio secco sulla settimana 2 postoperatoria.

Il DED è classificato in due gruppi principali in base all'effetto sulla stabilità della pellicola lacrimale: acquoso carente (diminuzione della produzione della componente acquosa della pellicola lacrimale; ,20% del DED) ed evaporativo (aumento dell'evaporazione della pellicola lacrimale; 50% del DED). Circa il 30% dei pazienti affetti da DED mostra la prova di entrambi (DED misto). L'infiammazione è il meccanismo centrale del DED a cui le sue diverse eziologie convergono^13,14. I nostri modelli di metodo Dicient-carente.

Come accennato in precedenza, importanti primi passi nella riproduzione del nostro metodo sono l'apprezzamento dei punti fini dell'anatomia delle ghiandole lacrimali orbitali (LG) del coniglio ed evitare confusione attraverso una terminologia anatomica varia e talvolta contrastante. L'atlante anatomico di Popesko et al.¹¹ è estremamente approfondito. Per coloro che sono meno a loro agio con l'anatomia del coniglio, la dissezione degli esemplari di necropsia fornisce una facile familiarità con queste strutture e aiuta la loro rimozione chirurgica in esemplari viventi.

Consigli critici sull'alloggiamento e l'acclimatamento degli animali sono stati forniti nella nostra pubblicazione complementare¹². Lo stesso articolo presenta anche commenti utili per annotare i parametri del DED utilizzati in entrambi i metodi.

A differenza del metodo precedente¹², questo richiede un più alto livello di abilità chirurgica a causa della portata e della natura più invasiva delle tecniche necessarie per rimuovere gli LG. Il rischio maggiore durante queste resezioni è il sanguinamento catastrofico causato dal ferimento di vasi principali che si trovano in prossimità degli LG come i rami dell'arteria carotide. Questo è evitato da una visualizzazione adeguata di ogni LG e dei suoi margini all'interno del campo chirurgico. Infine, la rimozione eccessiva della membrana nictitante potrebbe portare al prolasso della ghiandola ospediana, che può interrompere la valutazione della pellicola lacrimale.

Occorre prestare attenzione a ridurre al minimo la quantità di interruzione congiuntivale con la rimozione del PSLG, un nuovo aspetto del nostro metodo che migliora la riproducibilità e migliora la gravità del DED. È sorprendentemente facile stabilire il piano di dissezione e riportarlo alla cresta orbitale superiore finché la trazione viene applicata ai tessuti. È rassicurante poter vedere i segni di cautery dal troncamento dell'OSLG; confermano la completa rimozione del condotto escretore principale della ghiandola.

La rimozione dell'ILG nella sua interezza presenta anche delle sfide. Isolare prima la testa della ghiandola, in quanto questa è la parte più facile da visualizzare. L'intera testa del tessuto della ghiandola si separa facilmente dai tessuti circostanti; tuttavia, è necessario prestare attenzione per prevenire danni al grande seno venoso, che si trova mediale alla testa dell'ILG. La coda dell'ILG può quindi essere seguita indietro mentre passa sotto l'osso zigomatico. La maggior parte della coda è facile da isolare. Tuttavia, l'aspetto più posteriore della coda può rivelarsi più impegnativo a causa dell'anatomia variabile e della sua vicinanza a un ramo di medie dimensioni della carotide. Un'attenta dissezione dovrebbe consentire di vedere chiaramente tutti i margini dell'ILG, facilitandone la rimozione completa. L'investigatore deve essere pronto a portare la dissezione in modo più superiore nei casi in cui la coda della ghiandola termina sotto il canto laterale, come spiegato nella precedente discussione dell'anatomia delle ghiandole lacrimali. Da notare, gli autori non sono mai stati in grado di identificare alcuna porzione dell'OSLG quando si seziona l'ILG attraverso un'incisione curvilinea lungo il globo temporale e inferiore. Anche se questo può essere tecnicamente possibile, che l'approccio chirurgico comporta un rischio troppo alto per grave sanguinamento. Avvicinarsi all'OSLG attraverso l'incisure posteriore si rivela molto più sicuro.

Il condotto escretore dell'ILG può essere visto penetrare attraverso il piano fasciale inferiore mentre passa nella fornix congiuntivale inferiore. Occasionalmente, piccoli lobuli di tessuto visualizzato ghiandolare sono visti anche qui e possono essere rimossi con attenzione.

È molto utile mantenere l'ordine di resezione LG come presentato qui. Se il ILG viene rimosso per primo, l'isolamento dell'OSLG diventa tecnicamente molto più difficile. La ragione principale è che, dopo la rimozione dell'ILG, l'OSLG non può essere facilmente prolassato e quindi identificato.

Un vantaggio significativo del nostro modello è che può essere "modulare". In altre parole, il grado di DED indotto dalla dacrigectomia può essere calibrato per soddisfare esigenze sperimentali. Ad esempio, la resezione di tutti gli LG causerebbe il DED massimo, ma la resezione solo del SLG causerebbe la forma più mite di DED e la resezione solo dell'ILG genererebbe malattie di gravità intermedia.

Il nostro approccio, che riassume l'evento patofisiologico distinto della riduzione della produzione lacrimale offre ulteriori vantaggi rispetto ai metodi già segnalati. In breve, nessun altro modello chirurgico ha eliminato la produzione di strappi da parte di tutti gli LG orbitali^5,6,7,15,16; tra cui la denervazione parasimpatica degli LG¹⁷, e la soppressione farmacologica della produzione lacrimale^18,19, con gli ultimi due che hanno i loro effetti off-target come importanti confondenti. Infine, questo modello riduce al minimo la principale distorsione dipendente dallo sperimentatore, vale a dire la resezione incompleta degli LG, poiché la tecnica chirurgica offre la loro visualizzazione completa; ciò è aiutato dal fatto che non è richiesta l'emostasi, a parte il cauterio.

Lo sperimentatore dovrebbe essere consapevole che la resezione completa di tutti gli LG orbitali non genera una completa assenza di lacrime e, ad esempio, non ci si deve aspettare i valori dei test lacrimali di Schirmer che si avvicinano allo zero. Ciò è dovuto al fatto che ci sono sempre altre fonti di liquido lacrimale come gli Accessori LG di Wolfring e Krause e la fuoriuscita di plasma da vasi congiuntivi^20,21,22. Da un punto di vista sperimentale, questo dovrebbe essere visto come un aspetto positivo del metodo in quanto mantiene la superficie oculare; la xerophthalmia completa distruggerebbe totalmente la cornea negando l'utilità del modello. Inoltre, nella sua attuale forma di realizzazione, questo modello offre un'ottima opportunità per studiare tali meccanismi compensativi e il trasporto di fluidi attraverso questi compartimenti più piccoli.

In conclusione, presentati qui sono le specifiche di un nuovo e versatile metodo di indurre DED acquoso-carente che si presta allo studio della fisiologia lacrimale, la patogenesi del DED e lo studio di agenti terapeutici sviluppati per questa indicazione.

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti ad eccezione di BR che ha una posizione di capitale in Medicon Pharmaceuticals, Inc. e LH, un dipendente di Medicon Pharmaceuticals, Inc.

Riconosciamo il sostegno finanziario di una sovvenzione Targeted Research Opportunities della Stony Brook University School of Medicine e di una borsa di ricerca di Medicon Pharmaceuticals, Inc., Setauket, NY. Ringraziamo Michele McTernan per il supporto editoriale.