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Presentato qui è un protocollo che utilizza uno stadio di microscopio a temperatura controllata che consente di montare un contenitore campione su un microscopio verticale.
I campioni sono di solito collocati su uno stadio al microscopio orizzontale per l'osservazione microscopica. Tuttavia, per osservare l'influenza della gravità su un campione o sul comportamento a galla, è necessario rendere verticale lo stadio del microscopio. Per raggiungere questo obiettivo, è stato ideato un microscopio invertito laterale inclinato di 90 gradi. Per osservare i campioni con questo microscopio, i contenitori campione come piatti Petri o vetrini di vetro devono essere fissati allo stadio verticalmente. È stato sviluppato ed è descritto qui un dispositivo in grado di proteggere i contenitori campione in posizione in uno stadio di microscopio verticale. L'attacco di questo dispositivo allo stadio consente l'osservazione della dinamica del campione nel piano verticale. La capacità di regolare la temperatura utilizzando un riscaldatore in gomma siliconica permette anche l'osservazione di comportamenti campione dipendenti dalla temperatura. Inoltre, i dati sulla temperatura vengono trasferiti a un server Internet. Le impostazioni di temperatura e il monitoraggio dei log possono essere controllati in remoto da un PC o uno smartphone.
La microscopia ottica è una tecnica utilizzata per aumentare i dettagli osservabili attraverso l'ingrandimento di un campione con lenti e luce visibile. Nella microscopia ottica, la luce viene diretta su un campione, quindi la luce trasmessa, riflessa o fluorescente viene catturata dalle lenti di ingrandimento per l'osservazione. Sono disponibili vari tipi di microscopio che differiscono nella progettazione per ospitare diversi usi e metodi di osservazione. I diversi disegni includono un microscopio verticale, che è strutturato per illuminare un campione dal basso per l'osservazione dall'alto, e un microscopio invertito, che illumina il campione dall'alto per l'osservazione dal basso. I microscopi in posizione verticale sono il design più comune e ampiamente utilizzato. I microscopi invertiti sono spesso usati per osservare campioni che non possono consentire a una lente vicina in lontananza dall'alto, come le cellule coltivate aderenti al fondo di un contenitore. Molti gruppi di ricerca hanno riportato osservazioni in una vasta gamma di campi utilizzando microscopi invertiti1,2,3,4,5,6,7. Sono stati sviluppati anche molti dispositivi aggiuntivi che sfruttano le caratteristiche dei microscopi invertiti8,9,10,11,12,13 .
Attualmente, in tutti i progetti di microscopio convenzionali, lo stadio del microscopio è orizzontale ed è quindi inadatto per l'osservazione di campioni che producono movimento nel piano verticale, (a causa della gravità, della galleggiabilità, del movimento, ecc.). Per rendere possibili queste osservazioni, lo stadio del microscopio e il percorso della luce devono essere ruotati in verticale. Lo stadio verticale è necessario per montare verticalmente vetrini di vetro o contenitori campione come un piatto Petri sul palco. Per risolvere questo problema, è già stato ideato un microscopio invertito laterale inclinato di 90 gradi. Tuttavia, l'attaccamento di campioni con nastro adesivo o altri adesivi non produce la necessaria immobilità a lungo termine. Descritto qui è un dispositivo che può raggiungere la stabilità necessaria. Questo dispositivo consente l'osservazione nel tempo di movimento del campione nel piano verticale. Il montaggio di un riscaldatore in gomma in silicio ha anche permesso di osservare l'influenza della variazione di temperatura sul comportamento del campione. I dati di temperatura vengono trasferiti a un server Internet tramite Wi-Fi e le impostazioni di temperatura e il monitoraggio dei log possono essere controllati in remoto da un PC o uno smartphone. A nostra conoscenza, lo stadio collegato a un microscopio inclinato lateralmente inclinato di 90 gradi non è ancora stato riportato in studi precedenti.
Lo stadio del microscopio è composto da tre piastre di alluminio. La piastra di alluminio centrale è montata sulla piastra di alluminio inferiore che si attacca allo stage. La gomma in silicone contenente il sensore di temperatura è attaccata tra le piastre di alluminio medio e superiore. I elastici vengono utilizzati per apporre il campione. Gli artigli sono attaccati nei quattro punti sinistro e destro della piastra di alluminio superiore per fissare gli elastici. Il circuito di controllo del regolatore di temperatura riceve un segnale dal sensore di temperatura incorporato in gomma siliconica e modula la potenza elettrica con il metodo di modulazione della larghezza dell'impulso (PWM). La temperatura può essere gradualmente aumentata a 50 gradi centigradi in incrementi di 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Questo dispositivo è utile per le applicazioni in cui i movimenti del campione verticale possono essere dipendenti dalla temperatura.
La presente relazione fornisce esempi di effetti di temperatura sul fenomeno fluttuante delle diatomee. Come esempi di studi di osservazione delle diatomee, sono state riportate misurazioni della velocità di sedimentazione degli ammassi cellulari, delle analisi del movimento, degli studi di struttura ultrafine, ecc. , 18 mi lato , 19 del 12 , 20 anni , 21 Mieto , 22 Milia , 23.La gravità specifica delle diatomee che galleggiano nell'acqua con organismi fotosintetici è leggermente superiore a quella dell'acqua, quindi tendono ad affondare; tuttavia, si alzeranno se si verifica anche una leggera convezione. Per studiare questo fenomeno, un vetrino viene apposto verticalmente a uno stadio al microscopio e si osservano gli effetti dell'aumento della temperatura sul movimento verticale della diatoma.
1. Progettazione
2. Contorni di progettazione hardware
3. Struttura di progettazione del software
4. Configurazione del sistema
5. Progettazione del microscopio invertito lateralmente
6. Metodo di funzionamento
NOTA: Qui, il campione utilizzato è una miscela di Bold Modified Basal Freshwater Nutrient Solution mezzo di coltura liquida, metasilicato di sodio, vitamine e acqua sterile. 800 l di questo campione è diluito in 10 mL di mezzo di acqua dolce.
7. Misurazione della distribuzione della temperatura superficiale del riscaldatore di gomma
8. Test di risposta alla temperatura
La figura 2 mostra la distribuzione della temperatura del riscaldatore di gomma. La temperatura superficiale del riscaldatore di gomma era uniforme ad ogni temperatura. La figura 3 mostra la reattività della temperatura misurata per impostare le variazioni di temperatura. La linea arancione indica la temperatura impostata e la linea blu indica il cambiamento della temperatura del campione. Il superamento del valore misurato per la modifica dell'impostazione è piccolo e il monitoraggio è rapido.
Le cellule diatomee sono state osservate per fornire un esempio specifico dell'uso di questo dispositivo. L'analisi della traiettoria delle cellule diatomee mobili è un approccio utile per valutare la motilità delle cellule diatomee. Tuttavia, anche se un normale microscopio invertito osserva il campione orizzontalmente, non è adatto per l'osservazione dell'influenza della gravità o del movimento fluttuante nella direzione verticale.
In questo esperimento, lo stadio del microscopio con il regolatore della temperatura è stato collegato a un microscopio invertito che era stato ruotato di 90 gradi. Il movimento verticale delle diatomee dipendente dalla temperatura è stato registrato con successo. Con questo metodo, il locus del movimento verticale delle diatomee è stato rilevato come illustrato nella Figura 4. Come risultato dell'osservazione con 100 individui di diatomee, la velocità media era di 7,01 m/s a temperatura ambiente e di 470,1 s/s a 40 gradi centigradi. Gli effetti della convezione termica sul fenomeno fluttuante verticale delle cellule diatomesono sono stati visualizzati mediante osservazione diretta.
Figura 1: Fotografia del dispositivo fissato allo stadio del microscopio. Aspetto del dispositivo fissato allo stadio del microscopio. Il dispositivo è fissato allo stadio del microscopio con quattro viti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Distribuzione della temperatura del riscaldatore di gomma. La distribuzione del riscaldatore di gomma misurata dalla termografia. La temperatura del riscaldatore è stata modificata passo dopo la temperatura ambiente a 35 gradi centigradi, 45 gradi centigradi, 55 gradi centigradi e 65 gradi centigradi. La temperatura è stata distribuita uniformemente sul riscaldatore ad ogni temperatura. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: reattività del segnale di temperatura. Questo mostra la risposta quando la temperatura impostata viene aumentata da 30 a 50 gradi centigradi e abbassata da 50 a 30 gradi centigradi. La temperatura impostata è stata modificata in incrementi di 5 gradi centigradi. Nello stato stabilità, la temperatura misurata si trova all'interno di 1,5 gradi centigradi del valore impostato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Il locus del movimento della diatoma. Sono state tracciate le traiettorie verticali del movimento delle diatomee a causa dei cambiamenti di temperatura. Le linee blu mostrano le traiettorie delle celle diatomea a 25 gradi centigradi per 27,06 s e a 40 gradi centigradi per 0,2 s. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura supplementare 1: Disegno di disegno di piastre in alluminio (con dimensioni). (A) La piastra è spessa 2 mm x 150 mm di larghezza x 200 mm di lunghezza, con un foro centrato di 101 mm di diametro per consentire l'inserimento del riscaldatore di gomma. Ogni bordo della piastra ha due artigli lavorati a cui gli elastici possono essere attaccati per fissare i campioni sul palco. Per collegare questo stadio verticale a un microscopio con viti da 4 mm, i fori a vite da 4,2 mm vengono forati in quattro posizioni simmetricamente che circondano il foro centrale. (B) La piastra è spessa 5 mm x 150 mm di larghezza x 200 mm di lunghezza, con un foro centrato di 130 mm di diametro. Posizioni di tacche di macchina per abbinare le posizioni degli artigli sulla piastra di prima linea per consentire l'attaccamento di elastici di fissaggio del campione attraverso il palco. Per l'attaccamento dello stadio a un microscopio, quattro fori a vite da 4,2 mm vengono praticati in posizioni corrispondenti a quelli nella piastra di prima linea. (C) La piastra è spessa 4 mm x 150 mm di larghezza x 200 mm di lunghezza, con un foro centrato di 130 mm di diametro. Una campata di 30 mm viene tagliata fuori dal centro della faccia destra di 200 mm della piastra, alla profondità del foro centrale. Questo scopo del cut-out è quello di consentire l'attacco del connettore riscaldatore sul lato destro. Nelle stesse posizioni della piastra di primalinea, quattro fori a vite da 4,2 mm vengono forati per l'attaccamento dello stadio a un microscopio. (D) La piastra è spessa 1,5 mm x 150 mm di larghezza x 200 mm di lunghezza, con un foro centrato di 30 mm di diametro. Nelle stesse posizioni della piastra di primalinea, quattro fori a vite da 4,2 mm vengono forati per l'attaccamento dello stadio a un microscopio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 2: Disegno di disegno di piastre in alluminio (senza dimensioni). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 3: Disegno di disegno di piedistalli in alluminio. (A) Da installare sul lato superiore: il diametro è di 100 mm, lo spessore è di 3 mm. Un foro di 30 mm viene forato al centro e un ritaglio di 42 mm di larghezza x 30 mm di profondità viene realizzato su un lato. (B) Da installare sul lato inferiore: il diametro è di 100 mm, lo spessore è di 4 mm. Un foro di 30 mm di diametro viene forato al centro e tre fori da 3 mm sono stati posizionati a 120 gradi l'uno dall'altro ad una distanza di 25 mm dal centro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 4: Disegno di disegno di dischi di sughero premuti. (A) Da installare sul lato superiore tra il riscaldatore in gomma di silicio e il piedistallo superiore in alluminio: il diametro è di 100 mm, lo spessore è di 2 mm. Un foro di 20 mm viene forato al centro e due tagli (42 mm di larghezza x 30 mm di profondità, 4 mm di larghezza x 40 mm) sono realizzati ad angolo retto l'uno rispetto all'altro nei lati del disco. (B) Da installare sul lato inferiore tra il riscaldatore in gomma di silicio e il piedistallo inferiore in alluminio: il diametro è 100 mm, lo spessore è 1 mm. Un foro di 20 mm di diametro viene forato al centro. (C) Questo supporto è largo 42 mm e profondo 30 mm e tagliato dalla circonferenza di un disco di 100 mm di diametro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 5: Specifica del riscaldatore in gomma siliconica. Il diametro è di 100 mm e lo spessore è 2,5 mm. Un foro di 20 mm di diametro viene forato al centro. L'alimentatore è 12 V, con capacità di carico di 18 W. Il riscaldatore è costituito da filo Nichrome, con un filo di piombo collegato all'elettrodo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 6: Sezione trasversale dello stadio del microscopio. Questa è una vista sezionale dello stadio del microscopio. Il piedistallo in alluminio è collegato alla piastra di alluminio posteriore e il riscaldatore di gomma è installato sulla superficie più esterna. Il tappo spremuto è installato per l'isolamento tra il riscaldatore di gomma e piedistallo in alluminio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 7: Dettagli del diagramma del circuito. Ciò indica il circuito costruito nel controller. Il diagramma del circuito è diviso in nove parti in base alle singole funzioni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 8: Disegno di progettazione della custodia del controller in plastica. Le dimensioni sono 143,9 mm di lunghezza x 85,3 mm di profondità x 25 mm di larghezza. La manopola di impostazione della temperatura, la lampada di funzionamento/surriscaldamento e l'indicatore si trovano sulla custodia del controller di plastica. La temperatura può essere impostata mentre si guarda l'indicatore ruotando la manopola impostata. Spingendo questa manopola si avvia il controller di temperatura. La temperatura misurata viene visualizzata in tempo reale e il riscaldatore viene controllato in modo che raggiunga e mantenga la temperatura impostata. Quando il controller di temperatura è acceso, il LED blu si illumina e rimane illuminato mentre il riscaldatore è in funzione. Quando il riscaldatore si surriscalda, il LED rosso si accende e il riscaldatore si arresta automaticamente. Premendo di nuovo la manopola del controller di temperatura, la si fermerà. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 9: Configurazione del sistema. Lo stadio del microscopio con un controller incorporato è collegato al riscaldatore in gomma con un cavo dedicato. Vengono ricevuti segnali di temperatura del campione misurati e la corrente al riscaldatore di gomma viene trasmessa dal controller. I segnali misurati dal controller vengono inviati in modalità wireless al server tramite il router Internet. Il server compila i dati di misurazione per l'analisi e la creazione di grafici. Il monitoraggio del registro della temperatura e le impostazioni della temperatura possono essere controllate in remoto tramite PC o smartphone. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 10: Misurazione della distribuzione della temperatura per termografia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
L'analisi della traiettoria delle cellule diatomea mobili è un approccio utile per valutare la motilità delle diatomee. Tuttavia, mentre un normale microscopio invertito osserva i campioni orizzontalmente, non è adatto per osservazioni dell'influenza della gravità o del movimento fluttuante nella direzione verticale. Sviluppato e descritto qui è uno stadio di microscopio verticale con controllo della temperatura e collegato a un microscopio invertito, che è stato ruotato di 90 gradi. Questa fase del microscopio con controllo della temperatura consente l'osservazione del movimento verticale dipendente dalla temperatura delle cellule diatomiche.
Un passaggio critico all'interno del protocollo è la progettazione del circuito del controller. È stato implementato un circuito di demolizione per garantire la sicurezza. Quando il sensore viene scollegato dal campione o il microcontrollore non funziona correttamente, la corrente del riscaldatore viene interrotta da un circuito diverso dal microcontrollore.
Poiché il sistema di controllo ha adottato il sistema PID per controllare la corrente del riscaldatore, è necessaria una tecnica per trovare il parametro ottimale del PID. Rispetto al metodo esistente, il funzionamento e il monitoraggio a distanza sono possibili dalla funzione Wi-Fi, dalla raccolta dei dati su un server e dalla funzione di impostazione della temperatura. Poiché la struttura della parte dello stadio collegata al microscopio è complicata, la semplificazione di questa struttura garantisce uno studio futuro.
Questa apparecchiatura utilizza un riscaldatore per aumentare la temperatura, ma il raffreddamento non è alimentato; pertanto, la temperatura impostata non può essere al di sotto della temperatura ambiente. Il raffreddamento dei campioni a temperature inferiori a quella ambiente richiederà un complicato dispositivo di raffreddamento, che è in esame per il lavoro futuro.
Gli autori non hanno conflitti da divulgare.
Gli autori non hanno riconoscimenti.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
AC adapter 12V2A | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | AD-D120P200 | Tokyo, Japan |
ADS1015 Substrate | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | adafruit PRODUCT ID: 1083 | Tokyo, Japan |
Alminium Plate (Back Side Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200?×T 1.5mm | Gifu, Japan |
Alminium Plate (Forefront Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200?×T 2mm | Gifu, Japan |
Alminium Plate (Middle Lower Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200?×T 4mm | Gifu, Japan |
Alminium Plate (Middle Upper Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200?×T 5mm | Gifu, Japan |
Aluminum Pedestal (Lower Plate) | Inoval Co., Ltd. | D 100mm×T 3mm (30Φ) | Gifu, Japan |
Aluminum Pedestal (Upper Plate) | Inoval Co., Ltd. | D 100mm×T 3mm (30Φ) | Gifu, Japan |
Bold Modified Basal Freshwater Nutrient Solution | Sigma-Aldrich Co. LLC | B5282-500ML | St. Louis, USA |
Controller Case | Marutsu Elec Co., Ltd. | pff-13-3-9 | Tokyo, Japan |
CPU | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | ESP-WROOM-02D | Tokyo, Japan |
Inverted microscope | Olympus Corporation | CKX 53 | Tokyo, Japan |
Low temperature hardening epoxy resin adhesive | ThreeBond Co., Ltd. | TB2086M | Tokyo, Japan |
Multi-turn semi-fixed volume Vertical type 500 Ω | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | 3296W-1-501LF | Tokyo, Japan |
OLED module | Akihabara Inc. | M096P4W | Tokyo, Japan |
Pressed Cork (For supporting electrode ) | Tera Co., Ltd. | W 42mm×L 30? | Ishikawa, Japan |
Pressed Cork (Lower Disk) | Tera Co., Ltd. | D 100mm×T 0.5mm (20Φ) | Ishikawa, Japan |
Pressed Cork (Upper Disk) | Tera Co., Ltd. | D 100mm×T 2.5mm (20Φ) | Ishikawa, Japan |
Rotary encoder with switch with 2 color LED | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | P-05772 | Tokyo, Japan |
Silicone rubber heater | Three High Co., Ltd. | D 100mm×T 2.5mm (20Φ) | Kanagawa, Japan |
Substrate | Seeed Technology Co., Ltd. | mh5.0 | Shenzhen, China |
Temperature sensor | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | NXFT15XH103FA2B050 | Tokyo, Japan |
Three-terminal DC / DC regulator 3.3 V | Marutsu Elec Co., Ltd. | BR301 | Tokyo, Japan |
Universal Flexible Arm | Banggood Technology Co., Ltd. | YP-003-2 | Hong Kong, China |
USB cable USB-A - MicroUSB | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | USB CABLE A-MICROB | Tokyo, Japan |
Video Canera | Sony Corporation | HDR-CX590 | Tokyo, Japan |
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