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Questo protocollo dimostra il nostro modello di formazione basato su attività locomotrice tapis roulant per i ratti con lesioni del midollo spinale (SCI). È incluso sia quadrupede che sola zampa anteriore gruppi, oltre a due distinti tipi di gruppi di controllo non addestrato. Gli investigatori sono in grado di valutare gli effetti di formazione sui ratti SCI utilizzando questo protocollo.
Ferita del midollo spinale (SCI) si traduce in durata di deficit che includono sia la mobilità e una moltitudine di disfunzioni autonomiche correlate. Formazione dell'apparato locomotore (LT) su un tapis roulant è ampiamente usato come uno strumento di riabilitazione nella popolazione SCI con numerosi vantaggi e miglioramenti alla vita quotidiana. Utilizziamo questo metodo basato sulle attività di formazione di attività specifiche (ABT) in roditori dopo SCI ad entrambi delucidare i meccanismi dietro tali miglioramenti e per valorizzare e migliorare su protocolli di riabilitazione clinica esistenti. Il nostro obiettivo attuale è quello di determinare i meccanismi alla base di ABT-indotto miglioramenti in urinario, intestinale e la funzione sessuale in SCI ratti dopo un moderato livello di contusioni gravi. Dopo essersi assicurato ogni singolo animale in una maglia regolabile su misura, essi sono fissati ad un meccanismo di supporto peso corpo versatile, abbassata al tapis roulant di tre corsie modificate e assistito in fase di formazione per 58 minuti, una volta al giorno per 10 settimane. Questa configurazione consente l'addestramento di animali sia quadrupede e sola zampa anteriore, insieme a due gruppi diversi non addestrato. Animali addestrati quadrupede con supporto di peso del corpo sono aiutati da un tecnico presente per assistere a un passo con posizionamento corretto dell'arto come necessario, mentre animali addestrati sola zampa anteriore vengono generati verso l'estremità caudale affinché nessun contatto dell'arto con il nessun peso-cuscinetto e tapis roulant. Un gruppo SCI non addestrato di animali è collocato in un'imbracatura e si riposa accanto al tapis roulant, mentre l'altro gruppo SCI di controllo rimane nella sua gabbia a casa nella training room è vicino a. Questo paradigma consente la formazione di più animali SCI in una sola volta, rendendo così più efficienti in termini di tempo oltre a garantire che il nostro modello animale pre-clinico imita la rappresentazione clinica come vicino possibile, specialmente per quanto riguarda il corpo Peso supporto con assistenza manuale.
A livello globale, tra 250.000-500.000 nuove lesioni del midollo spinale (SCI) casi sorgono a causa di degenerazione, malattie o più comunemente (fino al 90%) trauma1. Dopo SCI traumatico, una serie di eventi fisiologici hanno luogo che provocano deficit neurologici che interessano una moltitudine di funzioni corporee. Dovuto il deficit cronico che seguono SCI, lo sviluppo e la sperimentazione di efficaci modalità di trattamento è fondamentale. Fino a poco tempo, strategie riabilitative più comunemente sono concentrati sul recupero di mobilità2,3. Dopo SCI, i pazienti rango urinario/vescica, intestino e le funzioni sessuali fra le complicazioni più alte qualità della vita che hanno bisogno di migliore gestione1,4,5. Di conseguenza, targeting della vescica, intestino e la funzione sessuale è della massima importanza da un punto di vista di riabilitazione1,4,5.
Esercizio e la formazione dell'apparato locomotore (LT) sono comunemente utilizzate terapie riabilitative nella popolazione di pazienti di SCI con molti vantaggi come ad esempio la funzione cardiovascolare, funzione della vescica/urinaria e mobilità6,7,8 ,9,10. È per questo motivo che utilizziamo una modalità simile nel nostro modello SCI di ratto pre-clinica. È il nostro obiettivo per determinare quali effetti LT ha sui ratti Wistar di SCI, in particolare per quanto riguarda sia superiore (rene) e funzione del tratto urinario inferiore (vescica, sfintere uretra esterno), funzione intestinale e la funzione sessuale. Ulteriormente, LT ha dimostrato di essere sufficiente nell'attivazione neuromuscolare sistemi sotto il livello della lesione che può influenzare la quantità di plasticità all'interno del sistema nervoso centrale (SNC)11,12.
Il successo di LT in studi pre-clinici è ben documentato sia grande13,14 e piccolo15,16,,modelli animali per il SCI19 18,17,. La prova suggerisce che input sensoriali afferenti fornito da LT è sufficiente per stimolare spinale vie riflesse che si traducono in plasticità e miglioramenti al sensitivo-motore funzionano9,20. Benefici LT per quanto riguarda funzioni autonome non sono stati caratterizzati bene. Per questo motivo, implementiamo il nostro paradigma di formazione con un focus su misure di risultato autonomica, utilizzando quattro gruppi distinti che includono due controlli non addestrato e un gruppo di cuscinetto non-peso metabolico/esercizio insieme a un gruppo LT che imita la tempistica, la durata della sessione, assistenza manuale e supporto di peso che sono utilizzati in studi clinici19,21,22,23,24.
Tutti i metodi descritti sono stati approvati dall'Università di Louisville istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC).
1. pre-infortunio movimentazione e test (una settimana prima di SCI)
2. midollo spinale contusione25,26,27,28
3. formazione fase
4. l'eutanasia e tessuto collezione
A seguito di questo protocollo di allenamento, è stato documentato che solo gli animali QT dimostrano la funzione locomotoria superiore quando rispetto agli altri gruppi di18. Tuttavia, a causa della natura del nostro laboratorio, il nostro obiettivo primario è di indagare non-locomotore benefici di formazione basata su attività di attività specifiche (ABT), compreso la vescica, intestino e funzione sessuale. Per esempio, in precedenza abbiamo pubblicato dati che mostrano risultati LT una riduzione indotta dall'esercizio del polyuria in gruppi sia QT che FT SCI ratti (Figura 4)17. Inoltre, una diminuzione indotta da lesione nella espressione di fattore di crescita-β (TGF-β) nel rene, indicativo di un'alterata risposta immunitaria, di trasformazione non è stato visto in gruppi QT e FT, che ha avuto livelli di TGF-β simili agli animali di sham (nessuna ferita). In stesso studio17, cistometria sveglio è stato effettuato prima dell'accumulazione dell'eutanasia e del tessuto. L'ampiezza massima delle contrazioni della vescica durante i cicli di sub non era significativamente differente tra farsa, QT e FT gruppi, mentre i gruppi NT è rimasto significativamente alterati. Insieme, questi dati indicano un risultato di esercizio positivo sulla funzione della vescica e di salute del rene, migliorando così la funzione urinaria dopo SCI.
I meccanismi sottostante poliuria all'interno della popolazione di SCI sono attualmente non chiaro ma sono probabilmente multifattoriale32. Alcuni hanno ipotizzato, ad esempio, che il pool di fluido nelle membra più basse mentre SCI gli individui sono in sedia a rotelle può portare a sovraccarico di liquidi ed eliminazione aumentata fluido durante turni posturale (ad esempio lo spostamento da seduto a sdraiato)33. Una tale spiegazione non vale per il modello pre-clinico, che ci ha portato a concentrarsi inizialmente su arginina vasopressina (AVP), l'ormone che controlla l'omeostasi fluido nel corpo e può essere modulata con l'esercizio. AVP controlli fluido omeostasi attraverso l'attivazione del recettore V2 nei reni che facilita il riassorbimento di acqua dalla raccolta renale condotti34. Prova preliminare da un esperimento pilota (tempo-punto cronica con livello di gravità di una lesione - forza di impatto kdyn 210) indicano un effetto benefico dell'esercizio (LT e FT) sui livelli del ricevitore V2 nel rene del ratto (Figura 5).
Figura 1: cablaggi su misura dimensionate per ratti maschii di Wistar. Animali sia QT e NT sono collocati nello stesso tipo di giacca (A) consentendo l'utilizzo delle arti posteriori nel caso di animali QT. Ci sono cinghie supplementari cuciti sul fascio usato per animali FT (B) per sollevare gli arti posteriori, non assicurando nessun supporto di peso del corpo. Le grandi porzioni di materiale gancio-e-ciclo dell'imbracatura consentono facili regolazioni di diversi animali di dimensioni e di eventuali modifiche delle dimensioni di un singolo animale nel corso del tempo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: installazione di stazione di formazione. Meccanismo di sostegno del peso corpo che circonda il tapis roulant per NT (estrema sinistra), QT (medio) o gruppi (a destra) FT. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: stazione di allenamento con gli animali. Superiore (A) e una vista laterale (B) risultati peso corporeo supporto meccanismo e la posizione di fissaggio supporto clip per le imbracature. Si noti che le zampe dell'animale FT (B) viene generato e fuori il nastro. Inserto (C) ritrae una vista ingrandita del clip fissata all'imbracatura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: effetti ABT il polyuria ratto dopo SCI. Il volume totale della produzione di urina (A) è aumentato dopo SCI (*; p < 0,05) e restituito più vicino alla linea di base dopo 9 settimane di allenamento LT nei gruppi QT e di FT, ma è rimasto aumentate nel gruppo NT riguardante i gruppi addestrati (#; p < 0,05). Tutti i gruppi hanno dimostrato maggiore produzione di urina rispetto al basale a 9 settimane e aumentato volume vuoto (B). È importante notare che il numero di vuoti (C) e la quantità di assunzione di acqua (D) è rimasto lo stesso in tutti i gruppi. I valori sono mezzi ± errore standard. Questa figura è ripubblicata con autore autorizzazione17. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: effetti ABT il rene del ratto. Western blot risultati per livelli di rene di ratto dei recettori V2 in 5 gruppi di 4 ratti ogni (20 in totale), che mostrano i livelli di espressione per le bande proteiche fornito nel pannello A e nel gruppo dire densitometria i risultati dell'analisi delle bande (usando ImageJ; OD = densità ottica) nel pannello B, che indica una significativa (*; p < 0,05) diminuzione nei recettori presso un punto di tempo cronica (12 settimane) post-SCI e nessuna diminuzione rispetto ai valori basali (comandi finti chirurgico) per i gruppi che ricevono 10 settimane di ABT un'ora giornaliera. Barre di errore rappresentano errore standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Dose di chetamina/xilazina grafico | ||||
Dose efficace: | Utilizzo di 100 mg/mL di brodo di ketamina e 20 mg/mL xilazina stock * * * | |||
80 mg/kg ketamina | ||||
10 mg/kg xylazina | ||||
1,0 mL di miscela iniezione = 0,62 mL di brodo di ketamina (100 mg/mL) + 0,38 mL di brodo di xilazina (20 mg/mL) | ||||
Peso dell'animale | Iniezione di miscela | Peso dell'animale | Iniezione di miscela | |
(g) | (mL) | (g) | (mL) | |
100 | 0.13 | 275 | 0.36 | |
105 | 0,14 | 285 | 0,37 | |
110 | 0,14 | 290 | 0,38 | |
115 | 0.15 | 300 | 0.39 | |
120 | 0.16 | 305 | 0.4 | |
125 | 0.16 | 310 | 0.4 | |
130 | 0,17 | 315 | 0.41 | |
135 | 0.18 | 320 | 0,42 | |
140 | 0.18 | 325 | 0,42 | |
145 | 0,19 | 330 | 0.43 | |
150 | 0.2 | 335 | 0,44 | |
155 | 0.2 | 340 | 0,44 | |
160 | 0.21 | 345 | 0.45 | |
165 | 0.21 | 350 | 0.46 | |
170 | 0.22 | 355 | 0.46 | |
175 | 0.23 | 360 | 0,47 | |
180 | 0.23 | 365 | 0,47 | |
185 | 0,24 | 370 | 0,48 | |
190 | 0.25 | 375 | 0,49 | |
195 | 0.25 | 380 | 0,49 | |
200 | 0,26 | 385 | 0,5 | |
205 | 0,27 | 390 | 0.51 | |
210 | 0,27 | 395 | 0.51 | |
215 | 0.28 | 400 | 0,52 | |
220 | 0,29 | 410 | 0,53 | |
225 | 0,29 | 420 | 0.55 | |
230 | 0.3 | 430 | 0,56 | |
235 | 0,31 | 440 | 0.57 | |
240 | 0,31 | 450 | 0,59 | |
245 | 0,32 | 460 | 0.6 | |
250 | 0,33 | 470 | 0.61 | |
255 | 0,33 | 480 | 0,62 | |
260 | 0,34 | 490 | 0,64 | |
265 | 0,34 | 500 | 0.65 | |
270 | 0.35 | 510 | 0,66 |
Tabella 1: Tabella di dosaggio anestesia basato sul peso del singolo animale.
Tempo di allenamento (min) | Velocità (cm/s) | Durata (min) |
0-1 | 6 | 1 |
1-2 | 8.4 | 1 |
2-3 | 10,8 | 1 |
3-8 | 13.2 | 5 |
8-13 | 10,8 | 5 |
13-28 | 13.2 | 15 |
28-33 | 10,8 | 5 |
33-38 | 6 | 5 |
38-43 | 8.4 | 5 |
43-58 | 13.2 | 15 |
Tabella 2: Regime di allenamento di impostazioni di velocità che il tapis roulant dovrebbe essere il corrispondente al tempo trascorso ad ogni velocità.
I nostri metodi di ABT sui ratti dopo SCI è un intervento terapeutico novello. Mentre altri metodi di allenamento e addestramento in modelli animali di passaggio possono esistere35,36,37, questo metodo imita effettuati clinicamente nella popolazione umana SCI, dove abbiamo visto promettenti risultati23LT. Con la combinazione del nostro programma di installazione, regime e uso degli animali di controllo, i risultati ottenuti utilizzando il nostro paradigma di formazione verranno aiuterà a capire i benefici di ABT dopo SCI. Future applicazioni del presente protocollo comprendono osservando i risultati descritti di ABT a tempi differenti di addestramento così come l'effetto che ABT ha il recupero da diversi livelli ed extent della ferita.
Una limitazione di questo disegno è la lunghezza del tempo per tali esperimenti. Dato che il nostro regime di allenamento per ogni animale richiede 1 ora al giorno, ogni giorno per 10 settimane, tempo notevole dei personali e una pianificazione organizzata è una necessità. Un aspetto importante che richiede un'attenzione speciale coinvolge il gruppo FT, che ha unici imbracature con gancio-e-loop cinghie materiale per proteggere le zampe sopra il tapis roulant per l'eliminazione del peso di supporto. È importante garantire che l'animale non riceve supporto peso, motivo per cui una piattaforma non è posizionata sotto le zampe posteriori del ratto. Inoltre, come gli studi precedenti hanno indicato che l'input sensoriale è un conducente principale della plasticità del sistema locomotore del midollo spinale38,39,40, c'è un costante bisogno di gestire il gruppo QT per assistere con un passo simile a fisioterapisti nella regolazione clinica.
Un'importante modifica apportata al sistema di tapis roulant disponibili in commercio utilizzato per gli animali era inversione della polarità. Dopo aver esposto il motore, i cavi positivo e negativi sono stati commutati che inverte la direzione che si muove il tapis roulant. Questo permette più spazio e più facile accesso per raggiungere e aiutare gli animali (il sistema è dotato di una griglia di scossa ad una estremità che è stata progettata per impedire che gli animali non sfruttato, livello spinale intatti stepping fuori il nastro).
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Gli autori riconoscono la d. ssa Patricia Ward, aprile Herrity e Susan Harkema per loro ingresso e guida, Christine Yarberry per assistenza chirurgica, Yangsheng Chen, Andrea Willhite e Johnny Morehouse per assistenza tecnica e Darlene Burke per assistenza con statistiche e valutazioni del comportamento. Finanziamento per questo lavoro è stato fornito dal dipartimento della difesa (W81XWH-11-1-0668 e W81XWH-15-1-0656) e midollo spinale Kentucky e testa ferita Research Trust (KSCHIRT 14-5).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Exer-3R treadmill | Columbus Instruments | reversed polarity of the motor | |
Body weight support system | N/A | N/A | modified spring scales with alligator clips |
Rat harness | N/A | N/A | Our harnesses are custom made; please refer to Figure 1 for visual. |
Infinite Horizon (IH) impactor device | Precision Systems and Instrumentation | Model 0400 | |
Ketamine HCl | Hospira | NDC 0409-2053-10 | |
Xylazine (AnaSed Injection) | Akorn Animal Health | NDC 59399-110-20 | |
Meloxicam (Eloxiject) | Henry Schein Animal Health | NDC 116695-6925-2 | |
Gentamicin Sulfate (GentaFuse) | Henry Schein Animal Health | NDC 11695-4146-1 | |
urethane, 97% | Argos Organics | CAS 51-79-6 | |
4-0 monofilament suture kit (4-0 Ethilon Nylon Suture) | Ethicon, LLC | 205016 | |
Michel suture clips (9mm Auto Clips) | MikRon Precision, Inc. | 1629 | |
Heating pad | Mastex Industries, Inc | Model 500 | |
Tootie Fruitys cereal | Malt O Meal | For training reward | |
Male Wistar rats | Envigo | ||
Size 10 surgical scalpel blades | Miltex | SKU: 4-110 |
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