Qui, presentiamo un protocollo per rilevare cluster di ossigeno metallico discreti, poliossimetalati (POM), al limite di singole molecole utilizzando una piattaforma elettronica biologica basata su nanopori. Il metodo fornisce un approccio complementare agli strumenti chimici analitici tradizionali utilizzati nello studio di queste molecole.

Le singole molecole possono essere rilevate e caratterizzate misurando il grado con cui riducono la corrente ionica che scorre attraverso un singolo poro su scala nanometrica. Il segnale è caratteristico delle proprietà fisico della molecola e delle sue interazioni con il poro. Dimostriamo che i nanopori formati dalla proteina batterica exotoxin Staphylococcus aureus alpha hemolysin (ZHL) sono in grado di rilevare i poliossimiti (POM, ammassi di ossigeno anionico), al limite della singola molecola. Inoltre, più prodotti di degradazione di 12-foshotungstic acid POM (PTA, H₃PW₁₂O₄₀) in soluzione sono misurati simultaneamente. La sensibilità a singola molecola del metodo nanoporo consente di caratterizzare i POM a concentrazioni significativamente inferiori a quelle richieste per la spettroscopia a risonanza magnetica nucleare (NMR). Questa tecnica potrebbe servire come nuovo strumento per i chimici per studiare le proprietà molecolari dei poliossimetalati o di altri cluster metallici, per comprendere meglio i processi sintetici POM e possibilmente migliorare la loro resa. Ipoteticamente, la posizione di un dato atomo, o la rotazione di un frammento nella molecola, e lo stato di ossidazione del metallo potrebbero essere studiati con questo metodo. Inoltre, questa nuova tecnica ha il vantaggio di consentire il monitoraggio in tempo reale delle molecole in soluzione.

Il rilevamento di analiti biomolecolari a livello di singola molecola può essere eseguito utilizzando nanopori e misurando modulazioni di corrente ionica. Tipicamente, i nanopori sono divisi in due categorie in base alla loro fabbricazione: biologica (auto-assemblata da proteine o origami di DNA)^1,2,3o stato solido (adesempio, prodotto con strumenti di elaborazione dei semiconduttori)^4,5. Mentre i nanopori allo stato solido sono stati suggeriti come potenzialmente più robusti fisicamente e possono essere utilizzati in un'ampia gamma di condizioni di soluzione, i nanopori proteici finora offrono una maggiore sensibilità, maggiore resistenza all'incrostazione, una maggiore larghezza di banda, una migliore chimica selettività e un maggiore rapporto segnale/rumore.

Una varietà di canali ionici proteici, come quello formato da Staphylococcus aureus -emolysina ( , può essere utilizzato per rilevaresingolemolecole, compresi gli ioni (ad es. e RNA)^6,7,8, DNA danneggiato⁹, polipeptidi¹⁰, proteine (piegate e spiegate)¹¹, polimeri (glicole di polietilene e altri)^{12,13 , 14}, nanoparticelle d'oro^{15,16,17,18,19}e altre molecole sintetiche²⁰.

Recentemente abbiamo dimostrato che il nanoporo di HL può anche facilmente rilevare e caratterizzare ammassi metallici, poliossimetalati (POM), a livello di singola molecola. I POM sono cluster di ossigeno metallici su scala nanometrica discreti che sono stati scoperti nel 1826²¹, e da allora, molti altri tipi sono stati sintetizzati. Le diverse dimensioni, strutture e composizioni elementali di poliossimetalati che sono ora disponibili hanno portato a una vasta gamma di proprietà e applicazioni tra cui chimica^22,23, catalisi²⁴, scienza dei materiali^{25 ,26}, e ricerca biomedica^27,28,29.

La sintesi POM è un processo di auto-assemblaggio tipicamente eseguito in acqua mescolando le quantità stoichiometricamente richieste di sali metallici monomerici. Una volta formati, i POM mostrano una grande diversità di dimensioni e forme. Ad esempio, la struttura in polianione di Keggin, XM₁₂O₄₀^q- è composta da un eteroatoma (X) circondato da quattro ossigeno per formare un tetraedro (q è la carica). L'eteroatomo si trova in posizione centrale all'interno di una gabbia formata da 12 ottaedriMO MO₆ unità (dove M - metalli di transizione nel loro stato di alta ossidazione), che sono collegati tra loro da atomi di ossigeno condivisi vicini. Mentre la struttura dei tungsteno poliossimetalati è stabile in condizioni acide, gli ioni idrossidi portano alla scissione idrolitica dei legami metallo-ossigeno (M-O)³⁰. Questo complesso processo comporta la perdita di una o più sottounità ottahedrali MO_6, che porta alla formazione di specie monovacanti e trivacanti e alla fine alla completa decomposizione dei POM. La nostra discussione qui sarà limitata ai prodotti di decomposizione parziale dell'acido 12-foshotungstic a pH 5.5 e 7.5.

L'obiettivo di questo protocollo è quello di rilevare cluster di ossigeno metallico discreti al limite di singola molecola utilizzando una piattaforma elettronica biologica basata su nanopori. Questo metodo consente il rilevamento di cluster metallici nella soluzione. Più specie in soluzione possono essere discriminate con maggiore sensibilità rispetto ai metodi analitici convenzionali³³. Con esso, sottili differenze nella struttura POM possono essere chiarite, e a concentrazioni nettamente inferiori a quelle richieste per la spettroscopia NMR. È importante sottolineare che questo approccio consente anche la discriminazione delle forme isomeriche di Na₈HPW₉O₃₄¹.

Nota:< Il protocollo riportato di seguito è specifico per il sistema Nanopatch DC di Electronic BioSciences (EBS). Tuttavia, può essere facilmente adattato ad altri apparecchi di elettrofisiologia utilizzati per misurare la corrente attraverso le membrane pianologiche planari (camera standard del bistrato lipidico, geometria U-tube, microcapillari tirati, ecc.). L'identificazione dei materiali commerciali e delle loro fonti è data per descrivere i risultati sperimentali. In nessun caso questa identificazione implica una raccomandazione del National Institute of Standards and Technology, né implica che i materiali siano i migliori disponibili.

1. Preparazione della soluzione e dell'analita

1. Preparare tutte le soluzioni elettrolitiche con 18 M-cm di acqua da un sistema di purificazione dell'acqua Type-1 per rimuovere le specie organiche traccia e quindi filtrare tutte le soluzioni elettrolitiche attraverso un filtro a vuoto di 0,22 m immediatamente prima delle registrazioni del canale ionico.
   Nota:< La qualità dell'acqua è un fattore critico per la stabilità e la longevità del sistema nanoporo a membrana.
2. Tipo selvaggio: HL.
   1. Seguire le precauzioni MSDS durante la manipolazione della proteina tossina .
   2. Mescolare la polvere di tipo monomerico lofilfato-selvaggio S. aureus -Hemolysin ()con 18 M-cm di acqua a 1 mg/mL. Distribuire da 10 a 30 gradi del campione in tubi di centrifuga crio-sicuri, congelare rapidamente in azoto liquido e quindi conservare a -80 gradi centigradi. In alternativa, utilizzare purificato eferoerica preformato :HL³¹.
3. Sciogliere il lipido 1,2-Diphytanoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (DPhyPC) a 0,2 mg/mL in n-decane in una fiala di vetro da 4 mL con un cappuccio rivestito in politetrafluoroetileneflon. Conservare la soluzione a 4 gradi centigradi per un uso ripetuto per un massimo di un mese.
4. Preparare soluzioni di acido fosfofongtico.
   1. Seguire le precauzioni MSDS durante la manipolazione della polvere di acido fosfotungtico e preparare una soluzione di 2 mm di stock di acido fosfotungstico sciogliendo 57,6 mg di H₃PW₁₂O₄₀ in 10 mL di 1 M NaCl e 10 mM NaH₂PO₄ soluzione, che costituisce la soluzione di stock.
   2. Prendi 5 mL di questa soluzione e regola il pH a 5,5 con 3 M NaOH. Regolare il pH degli altri 5 mL della soluzione di riserva a 7,5 con 3 M NaOH.
      Nota:< A pH 5.5, l'acido 12-phosphotungstic (PTA, H₃PW₁₂O₄₀) si decompone principalmente nell'anione monovuoto [PW₁₁O₃₉]^7-.

2. Assemblaggio delle celle di prova

1. Assemblare la cella di prova in base alle istruzioni del produttore.
2. Immergere un filo Ag/AgCl in candeggina (ipoclorito di sodio) per 10 minuti dopo abraderlo con 600 carta vetrata a grana. Posizionare l'elettrodo all'interno della membrana nanoporo al quarzo (QNM).
3. Posizionare un elettrodo a pellet AgCl cilindrico incorporato in un filo d'argento all'esterno del QNM.
4. Una volta configurata la cella di test, attivare l'alimentatore e il programma di acquisizione dati. Assicurarsi che la lettura corrente del controller di dominio sia 0 pA in assenza di soluzione nella cella di test.
5. Utilizzare una siringa collegata alla cella di prova tramite una linea fluida per aggiungere una soluzione elettrolitica tamponata sopra la faccia del QNM e per garantire che la corrente ionica saturi l'amplificatore. In caso contrario, il QNM potrebbe essere intasato. Applicare una tensione pop (1 V) e/o una pressione superiore a 300 mm Hg per cancellarla. Se funziona, ridurre la tensione e la pressione.

3. Formazione Bistrato Lipidico

1. Compilare la soluzione nella cella di test in modo che il livello della soluzione sia ben al di sopra della faccia del QNM. Quindi abbassare il livello della soluzione tramite siringa al di sotto della faccia, in modo che la corrente diminuisca a zero.
2. Immergi una punta di pipetta da 10 l'l nella fiala lipida. Spingere sul retro della punta della pipetta e toccarlo sul lato della fiala per rimuovere tutti i lipidi visibili.
3. Toccare la punta pipetta sull'interfaccia aria-acqua della soluzione nella cella di prova quando il livello della soluzione è al di sopra del volto del QNM e attendere da due a cinque minuti affinché il lipido si diffonda uniformemente.
4. Abbassare lentamente il livello di soluzione al di sotto della faccia del QNM fino a quando l'attuale si satura, e quindi lentamente alzare il livello della soluzione oltre la faccia del QNM per formare una membrana lipidia-bistrato.
   1. Una volta che un biostrato sembra formarsi (cioèquando la corrente va a zero), provare a popping più volte aumentando la pressione e assicurarsi che il QNM non è intasato. Per riformare la membrana lipidica bistrato, abbassare il livello di soluzione sotto la faccia del QNM e lentamente sollevarlo.
5. Se la membrana lipidiana bistrato non si forma la prima volta, abbassare la soluzione sotto il viso e sollevarlo di nuovo. Se non si forma dopo 3 prove, aggiungere altri lipidi come descritto in 3.2 e 3.3.
6. Dopo aver formato una membrana, impostare l'offset corrente su zero quando il potenziale applicato è zero.

4. -Formazione dei Pori HL

1. Aggiungere 2,5 ng di un campione di proteine eferare purificato diHL (o 250 ng di monomerico ) alla cella di prova (volume n. 200) per consentire la formazione del canale.
2. Aumentare la pressione sul bistrato con una siringa a tenuta di gas (Figura 1) dopo la formazione di un bistrato, per espandere la membrana dal QNM, e facilitare l'inserimento di nanopori. Aumentare la pressione posteriore applicata in genere tra 40 a 200 mmHg, a seconda di ogni QNM.
   Nota:< Il software EBS ha una funzione di inserimento automatico che applica una distorsione superiore (in genere da 200 a 400 mV) per indurre la formazione di pori e quindi riduce automaticamente la tensione desiderata alla distorsione di misurazione una volta che un singolo canale si forma.
3. Dopo la forma di un nanoporo, ridurre la pressione posteriore a circa 1/2 della pressione di inserimento. Se si osservano più canali, rimuoverli riducendo significativamente la pressione.

5. Partizionamento del cluster metallico nel Nanopore

1. Per tenere conto degli squilibri degli elettrodi, impostare la tensione di offset DC in modo che quando il potenziale applicato sia impostato su zero non vi è corrente misurata.
2. Prima di aggiungere il campione POM, eseguire un esperimento dicontrollo per assicurarsi che non vi siano contaminanti (ad esempio, traccia di POM da un esperimento precedente) nel serbatoio. In particolare, acquisire una traccia di corrente ionica sotto un potenziale applicato di 120 mV a -120 mV in assenza di QUALSIASI POM per verificare che non siano presenti blocchi di corrente spontanei.
   Nota:< A causa della struttura asimmetrica del canale di hL (Figura 1), la grandezza della corrente ionica differirà per i potenziali applicati positivi e negativi. Il rapporto tra la corrente misurata al di sopra di questa tensione applicata è indicativo dell'orientamento del nanoporo HL nella membrana.
3. Aggiungere il campione di POM scaricando il serbatoio con una soluzione a grappolo metallico a concentrazione da 1 a 5 mM. In alternativa, caricare il campione nel capillare prima dell'assemblaggio cellulare per studiare il partizionamento dei POM nell'altra estremità del canale .
4. Registrare la corrente ionica utilizzando il software del produttore per rilevare i blocchi di corrente transitori causati dal partizionamento di singoli POP nel nanoporo. Stimare le proprietà fisiche e chimiche della molecola dalla profondità del blocco della corrente ionica, dalla frequenza degli eventi e dalla distribuzione del tempo di residenza dei blocchi.

6. Registrazioni e analisi dei dati del canale Ion

1. Acquisisci le misurazioni delle serie temporali correnti ioniche utilizzando un amplificatore ad alta impedizione, a basso rumore e un sistema di acquisizione dei dati. Eseguire le misurazioni a una tensione applicata di -120 mV (relativa al lato del canale) per ogni pH.
2. Applicare un filtro Bessel a 8 poli a 8 poli a passate basso al segnale, che viene successivamente digitalizzato a 500 kHz (cioè 2 ms/punto). Estrarre gli eventi dalla serie temporale e analizzare gli eventi utilizzando l'algoritmo ADEPT nel pacchetto software MOSAIC ^32,33.

Negli ultimi due decenni, i pori su scala nanometrica delle proteine legate alla membrana sono stati dimostrati come sensori versatili a singola molecola. Le misurazioni basate su nanopori sono relativamente semplici da eseguire.  Due camere piene di soluzione elettrolitica sono separate da un nanoporo incorporato in una membrana lipidica isolante elettricamente. Un amplificatore patch-clamp o un alimentatore esterno fornisce un potenziale elettrostatico attraverso i nanopori tramite elettrodi Ag/AgCl immersi nei serbatoi di elettroliti. Il campo elettrico spinge singole particelle cariche nel poro, che produce riduzioni transitorie della corrente ionica che dipendono dalle dimensioni, dalla forma e dalla carica delle particelle. Un programma per computer controlla la tensione applicata e monitora, in tempo reale, i blocchi di corrente ionica causati da molecole che si partizionano in modo reversibilmente nel poro. La corrente viene amplificata e convertita in tensione con un transistor a basso rumore e forte effetto di campo e digitalizzato utilizzando una scheda di acquisizione dati.

Qui, forniamo una procedura generale per rilevare i poliossimetalati con un nanoporo biologico. Come si è visto nella Figura 2, prima dell'aggiunta di POM il canale senza ostacoli ha una corrente media di canale aperto di 100 dollari pA con un potenziale applicato di -120 mV. L'aggiunta di POM produce blocchi transitori e diminuisce la corrente ionica di circa l'80%. Come previsto, poiché queste particelle sono caricate negativamente, i blocchi non vengono osservati quando la polarità del potenziale applicato viene invertita. Si noti che se i POM non interagissero con la parete dei pori, si diffonderebbero attraverso i pori in circa 100 ns, che è troppo breve per essere rilevato con un amplificatore di morsetto patch convenzionale. Pertanto, la maggior parte del tempo che una determinata particella trascorre nel poro è una conseguenza diretta dell'interazione tra la particella e il poro. La durata di un evento di blocco corrente ionico è definita come il tempo di residenza, tau (sezione).

Per illustrare l'utilità di questo metodo, discutiamo l'uso di un nanoporo di ZHL per monitorare la decomposizione dell'acido 12-foshotungstic (PTA, H₃PW₁₂O₄₀) a pH 5.5 e pH 7.5. Questa decomposizione può essere osservata con misurazioni ³¹P NMR, ma la concentrazione necessaria è di 2 mM mentre le misurazioni dei nanopori hanno bisogno di meno di 30 m, a causa della sensibilità alla misurazione dei nanopori. A pH 5.5, [PW₁₁O₃₉]^7- è la specie predominante³⁰.

L'analisi dei dati viene eseguita calcolando un istogramma del rapporto di profondità di blocco relativo (cioè,<i>/<i_o>, dove <i> è la corrente media con il POM nel poro e <i_o > è la corrente media del canale aperto). L'istogramma dei rapporti di profondità del blocco corrente medio a -120 mV e pH 5,5 presenta un picco minore a <i>/< i _o> , verde). Si presuppone che questi picchi corrispondano rispettivamente a [P₂W₅O₂₃]^6- e [PW₁₁O₃₉]^7-7- , basati su ³¹P NMR. ^{31 Milia} Gli studi P NMR suggeriscono che l'aumento del pH modifica la concentrazione relativa di queste due specie, e ciò è confermato dalla variazione dell'area dei due picchi mostrata nella Figura 3.

Quando la soluzione POM viene titolata a pH 7,5 ex situ, la concentrazione totale di POM diminuisce a causa della degradazione parziale delle due specie principali verso sali inorganici (cioè fosfato libero, H_xPO₄ e tungstate, WO₄^2- ioni). L'istogramma del rapporto di profondità del blocco relativo mostra anche due picchi principali (Figura 3, arancione),ma con 20 volte meno eventi (il che suggerisce che la concentrazione totale di POM a pH 7,5 è di circa 20 volte inferiore a quella a pH 5,5, se il L'efficienza di cattura di nanoporo per i POM è la stessa a due valori di pH). È interessante notare che a pH 7.5 e superiori, le specie POM osservate qui non sono state rilevate nello spettro NMR ³¹a causa della loro bassa concentrazione causata dalla loro dissociazione in ioni fosfati e tungstate.

Il tempo di residenza di ogni evento nel poro è definito dalla durata dei singoli blocchi di corrente ionica. La distribuzione dei tempi di residenza fornisce informazioni sulle diverse specie presenti. È stato dimostrato in precedenza che per i blocchi causati da polimeri di dimensioni diverse di poli(etilene glicole), la distribuzione del tempo di residenza per ogni dimensione di quel polimero è ben descritta da un singolo esponenziale. Questo risultato suggerisce che l'interazione di quel polimero è una semplice reazione chimica reversibile^12,13,20.

La figura 4 mostra che le distribuzioni del tempo di residenza per i due picchi erano ben differenziate a pH 5.5 e 7.5. Due caratteristiche sono chiare. In primo luogo, in tutte le condizioni, sono necessari più esponenziali per adattarsi a ciascuna delle distribuzioni, il che suggerisce che ci sono variazioni dei POM all'interno di ogni specie. In secondo luogo, i tempi di permane dei POM nel poro sono molto più brevi a pH 7,5 rispetto a quelli a pH 5,5, il che suggerisce un indebolimento dell'interazione tra il poro e i POM. È stato dimostrato in precedenza che una variazione del pH altera il numero relativo di cariche fisse all'interno o nei pressi del lume del canale HL. Queste modifiche altereranno direttamente le interazioni con i POM di partizionamento all'interno del poro e quindi modificheranno i loro tempi di residenza^34,35.

Figura 1: Diagramma schematico dell'installazione sperimentale. Metodo per la caratterizzazione basata sui nanopori di singole molecole poliossidanti. Un nanoporo proteico che si auto-assembla in una membrana lipidica lipidica spessa 4 nm è bagnato da soluzioni elettrolitiche acquose in un serbatoio capillare e più grande del vetro. Viene applicata una pressione al vetro capillare con una siringa a tenuta di gas per aiutare l'incorporazione dei nanopori. Una potenziale V viene applicata attraverso la membrana con una coppia abbinata di elettrodi Ag/AgCl e guida una corrente ionica (ad esempio,Na e Cl ^-) attraverso il poro. La corrente viene convertita in tensione con un amplificatore ad alta impotenza, digitalizzata con un convertitore da analogico a digitale (ADC) e memorizzata su un computer. Il software del computer controlla il potenziale applicato attraverso un convertitore da digitale a analogico (DAC) e monitora, in tempo reale, i blocchi di corrente transitoria causati da singole molecole che si dividono nel poro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Rilevamento basato su nanopori di singole particelle di metallo-nanoparticelle. Un'illustrazione delle tracce di serie temporali di corrente ionica che si verificano prima e dopo l'aggiunta di una soluzione POM all'apparato nanoporo. Il partizionamento dei singoli POR anionici nel poro provoca riduzioni transitorie della corrente media dei pori aperti, <i_o>.  (A destra) Un evento tipico, che illustra la corrente media del blocco (<i>) e il tempo di residenza (z) della particella nel poro. Il potenziale applicato era di -120 mV, e le soluzioni contenevano 1 M NaCl, 10 mM NaH₂PO₄ a pH 5.5. Il compartimento della cis conteneva anche 30 M di acido fosfofongtico da 12 forofoghi. L'attuale rapporto di profondità del blocco (<i>/<i_o>) e i tempi di residenza (z) forniscono informazioni sulle specie POM presenti in soluzione. Nelle condizioni che abbiamo usato qui, il canale di HL non si chiude (si chiude spontaneamente) quando i POP non sono presenti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Istogrammi del rapporto di profondità del blocco corrente a pH 5,5 e 7,5. Istogrammi del rapporto di profondità del blocco di corrente ionica indotta da POM a pH 5,5 (verde) e 7,5 (arancione) con un potenziale applicato V -120 mV. I due picchi presenti ad ogni valore di pH corrispondono alle specie POM predominanti conosciute in soluzione in tali condizioni. I rapporti di profondità di blocco corrente di 0 e 1 corrispondono rispettivamente a un poro completamente bloccato e aperto. Gli istogrammi sono stati creati con una larghezza del contenitore pari a 0,001 e normalizzati in conteggi/s dividendo per il tempo di acquisizione dei dati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Distribuzione del tempo di residenza e adattamento con diversi esponenziali. La distribuzione dei tempi di residenza per i blocchi di corrente indotta da POM causati dalle due specie principali (picchi 1 e 2 nella figura 4) osservata al pH 5.5 e 7.5 in un terreno semi-log. Per entrambe le specie, i tempi di permane sono nettamente più brevi al valore di pH più alto, il che suggerisce che l'interazione tra il poro e i POM sia cambiata. Le linee continue sono attacchi di un modello di miscela esponenziale ai dati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

A causa della loro carica anionica, i POM probabilmente si associano alle contro-zioni organiche attraverso interazioni elettrostatiche. Pertanto, è importante identificare le condizioni di soluzione appropriate e gli ambienti elettrolitici corretti (in particolare le cazioni nella soluzione) per evitare la formazione complessa con i POM. Particolare attenzione è necessaria nella scelta del buffer. Ad esempio, la velocità di acquisizione dei POM con soluzioni tris(idrossimetile) aminomethane e citrico-buffered è significativamente inferiore a quella della soluzione buffer fosfata, probabilmente perché uno dei primi due buffer forma un complesso con il POM che non fortemente interagiscono con il nanoporo. Inoltre, l'elettroll NaCl è stato volutamente utilizzato al posto di KCl (così come gli altri metalli alcali) perevitare la precipitazione di [PW₁₁O₃₉]^7- da K .

Fondamentale per la misurazione accurata delle distribuzioni del tempo di residenza è la capacità di misurare la corrente ad una larghezza di banda sufficientemente elevata. Per esempio, con i tempi di residenza distribuiti in modo esponenziale ci sono molti più blocchi con tempi di residenza brevi che lunghi, e una stima accurata delle distribuzioni del tempo di residenza è meglio ottenere raccogliendo una grande quantità di dati(cioè, l'acquisizione fino a una larghezza di banda che la capacità elettrica del sistema consente). Per ottenere questa condizione nella spettroscopia nanopora, la capacità del sistema (membrana e capacità randagi) deve essere ridotta al minimo. La capacità randagi si riduce diminuendo la lunghezza di tutti i cavi di collegamento e utilizzando contatti elettrici di alta qualità. La capacità della membrana è ridotta al minimo diminuendo la superficie del bistrato, aumentando lo spessore dei materiali di supporto (adesempio, quarzo, politetrafluoroetilene, ecc.)e diminuendo l'area dei materiali di supporto esposti all'elettrolita. In pratica, la capacità randagi di uno strumento tipico (n. 2 pF) limiterà il rumore per le membrane da 1 micron a 5 micron di diametro. Ciò costituisce la limitazione del metodo. Ad esempio, la rilevazione di molecole singole piccole e altamente cariche può essere difficile a causa dei loro tempi di residenza relativamente brevi.

Il meccanismo con cui la pressione consente il controllo dell'inserimento del canale non è completamente compreso. I microcapillari al quarzo hanno un diametro molto piccolo su cui si forma la membrana. L'applicazione di pressione causerà il rigonfiamento della membrana (aumentando così la superficie della membrana) ed eventualmente assottiglia la membrana. Entrambi gli effetti aumenterebbero la velocità con cui i canali si formeranno nella membrana. Quando si forma spontaneamente un singolo canale, ridurre la pressione per impedire l'inserimento di canali aggiuntivi. La rimozione dell'HL non inserito dalla fase accomodante non è necessaria se la concentrazione di HL è sufficientemente bassa.

Le strutture e le cariche dei poliossimetalati sono attualmente studiate utilizzando tecniche di chimica analitica tradizionali, tra cui NMR, spettroscopia a infrarossi, infrarossi e raman, spettrometria di massa e diffrazione a raggi X. Ci aspettiamo che le misurazioni dei nanopori andranno a completare la caratterizzazione di queste e altre proprietà fisiche dei POM, nonché lo studio della loro speciazione a bassa concentrazione, che aiuterà a comprendere meglio il percorso sintetico dei poliossimetallati formazione. E 'stato anche dimostrato in precedenza che il poro hL può anche distinguere tra 2 isomeri del trivacant Keggin forma Na₈HPW₉O₃₄³⁰_.

In sintesi, abbiamo dimostrato che un nanoporo proteico legato alla membrana può essere utilizzato per rilevare e caratterizzare i cluster metallici di ossido di tungsteno (eteropolytungs) in soluzione utilizzando una semplice misurazione elettrica ad alta risoluzione. La sensibilità offerta da questo nuovo approccio permette di tracciare sottili differenze nella struttura POM che sorgono a diversi valori di pH a concentrazioni sostanzialmente inferiori (> 70 volte) rispetto a quanto richiesto per i metodi tradizionali come NMR Spettroscopia. Grazie alla capacità di rilevamento di una singola molecola dei nanopori, il limite effettivo di rilevazione nel metodo può essere reso molto più basso misurando la corrente per tempi più lunghi (il tasso di cattura si adatta alla concentrazione di POM).

nessuno.

Siamo grati per il sostegno finanziario dell'Organizzazione europea di biologia molecolare per una borsa di studio post-dottorato (a J.E.) e una sovvenzione del NIH NHGRI (a J.J.K.). Apprezziamo l'aiuto dei professori Jingyue Ju e Sergey Kalachikov (Columbia University) per aver fornito eptameric SRl, e per aver ispirato le discussioni con il professor Joseph Reiner (Virginia Commonwealth University).