Proteoma profonda profilatura di etichettatura isobarico, vasto cromatografia liquida, spettrometria di massa e quantificazione assistita da Software

Vi presentiamo un protocollo per quantificare con precisione le proteine con etichettatura isobarico, vasto frazionamento, strumenti di bioinformatica e procedura di controllo di qualità in combinazione con cromatografia liquida interfacciato ad uno spettrometro di massa ad alta risoluzione.

Sono stati compiuti molti progressi eccezionali in spettrometria di massa (MS)-base di proteomica, con il progresso tecnico particolare in cromatografia liquida (LC) accoppiata alla spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) e capacità di multiplexing etichettatura isobarica. Qui, presentiamo un protocollo di analisi profonda-proteomica che combina i tag massa tandem 10-plex (TMT) etichettatura con un'ampia piattaforma di LC/LC-MS/MS e correzione post-MS computazionale interferenze per quantificare con precisione i proteomi tutto. Questo protocollo comprende le seguenti fasi: estrazione di proteine e digestione, TMT etichettatura, 2-dimensionale (2D) LC, spettrometria di massa ad alta risoluzione e computazionale di elaborazione dei dati. Procedura di controllo qualità è inclusa per la risoluzione dei problemi e valutare la variazione sperimentale. Più di 10.000 proteine in campioni di mammiferi possono essere quantificati con fiducia con questo protocollo. Questo protocollo può essere applicato anche per la quantificazione delle modifiche post traduzionale con modifiche minori. Questo metodo multiplex, robusto fornisce un potente strumento per analisi di proteomica in una varietà di campioni complessi, tra cui la coltura delle cellule, tessuti animali e umani campioni clinici.

Gli avanzamenti nella tecnologia di sequenziamento di nuova generazione hanno portato ad un nuovo paesaggio per lo studio di sistemi biologici e malattia umana. Questo ha permesso un gran numero di misurazioni del genoma, trascrittoma, proteoma, metaboloma e altri sistemi molecolari a diventare tangibili. Spettrometria di massa (MS) è uno dei metodi più sensibili in chimica analitica, e la sua applicazione in proteomica ha rapidamente ampliato dopo il sequenziamento del genoma umano. Nel campo della proteomica, da alcuni anni hanno prodotto importanti progressi tecnici nella basata su MS-analisi quantitative, tra cui isobarica etichettatura e multiplexing capacità combinata con cromatografia liquida estesa, oltre alla strumentazione avanza, consentendo più veloce, più accurate misurazioni con meno materiale di campione richiesto. Proteomica quantitativa è diventati un approccio tradizionale per la profilatura di decine di migliaia di proteine e modifiche di posttranslational in campioni biologici altamente complessi^{1,2,3,4 , 5 , 6}.

Metodi d'etichettatura isobariche multiplex ad esempio tag Isobarico per quantificazione relativa e assoluta (cioè, iTRAQ) e tag di massa tandem (TMT) MS hanno notevolmente migliorato la produttività del campione e aumentato il numero di campioni che possono essere analizzati in un unico esperimento^1,6,7,8. Insieme con altri metodi di quantificazione basati su MS, come quantificazione privo di etichetta ed etichettatura con gli amminoacidi nella coltura delle cellule (cioè, SILAC), il potenziale di queste tecniche nella proteomica dell'isotopo stabile campo è notevole^{9 ,10,11}. Ad esempio, il metodo TMT permette 10 campioni di proteine da analizzare insieme in 1 esperimento utilizzando reagenti 10-plex. Questi tag TMT strutturalmente identici hanno la stessa massa complessiva, ma isotopi pesanti differenzialmente sono distribuiti su atomi di carbonio o azoto, risultante in un ione unico reporter durante frammentazione MS/MS di ogni tag, consentendo pertanto una quantificazione relativa tra i 10 campioni. La strategia TMT è ordinariamente applicata per studiare vie biologiche, progressione di malattia e di processi cellulari^12,13,14.

Notevoli miglioramenti tecnici sono migliorati sistemi di cromatografia liquida (LC)-MS/MS, sia in termini di LC separazioni e parametri di MS, per massimizzare l'identificazione della proteina senza sacrificare la precisione di quantificazione. Prima dimensione separazione dei peptidi mediante una tecnica di separazione con alta ortogonalità per la seconda dimensione è fondamentale in questo tipo di metodo di proteomica di fucile da caccia per ottenere i massimi risultati²⁰. Cromatografia liquida a fase inversa ad alta pH (RPLC) offre prestazioni migliori rispetto a convenzionali scambio cationico forte cromatografia²⁰. Quando alto pH RPLC è combinata con una seconda dimensione di basso pH RPLC, sia analitico gamma dinamica e la copertura della proteina sono migliorate, conseguente la capacità di identificare la maggior parte delle proteine espresse durante l'esecuzione di analisi intero proteoma^{15 ,16,17,18}. Altri progressi tecnici includono piccole particelle C18 (1,9 µm) ed esteso lungo colonna (~ 1 m)¹⁹. Inoltre, altri miglioramenti importanti sono nuove versioni di spettrometri di massa con velocità di scansione rapida, una migliore sensibilità e risoluzione²⁰e bioinformatica sofisticata pipeline per MS dati mining²¹.

Qui, descriviamo un protocollo dettagliato che incorpora le più recenti metodologie con modifiche per migliorare la sensibilità e la velocità effettiva, mentre ci si concentra sui meccanismi di controllo di qualità in tutto l'esperimento. Il protocollo comprende estrazione di proteine e digestione, TMT 10-plex etichettatura, pH di base e frazionamento RPLC pH acido, ad alta risoluzione MS rilevamento ed elaborazione di dati di MS (Figura 1). Inoltre, realizziamo diversi passaggi di controllo di qualità per la risoluzione dei problemi e valutare la variazione sperimentale. Questo protocollo dettagliato è destinato ad aiutare i ricercatori nuovi al campo ordinariamente identificare e quantificare con precisione migliaia di proteine da un lisato o tessuto.

Attenzione: si prega di consultare tutte le schede di dati di sicurezza pertinenti (cioè, MSDS) prima dell'uso. Si prega di utilizzare tutte le pratiche di sicurezza appropriato durante l'esecuzione di questo protocollo.

Nota: viene utilizzato un set di reagente TMT 10-plex isobarica etichetta in questo protocollo per la quantificazione del proteoma di 10 campioni.

1. preparazione di tessuti o cellule

Nota: è fondamentale per raccogliere campioni in tempi brevi a bassa temperatura per mantenere le proteine nel loro stato originale biologica.

1. Lavare le cellule aderenti (ad es., cellule HEK 293) su una zolla di 10cm due volte con 10 mL di ghiaccio freddo tampone fosfato salino (PBS). Raschiare e raccogliere le cellule (~ 2 x 10 ⁶ cellule) in 1 mL di PBS. Trasferire in provette da 1,5 mL ed eliminare PBS dopo centrifugazione a 600 x g per 5 min a 4 ° pellets di cella C. Conservare a-80 ° C fino a lisi.
   Nota: Un esperimento pilota è spesso eseguito per esaminare il rendimento di proteina. Circa 1 mg di proteine possono essere estratti da 10 x 10 ⁶ cellule di mammifero o da una piastra di 15cm con 80% confluenza.
2. In alternativa, lisare le cellule aderenti sul loro piatto aggiungendo il tampone di Lisi direttamente alla piastra dopo lavaggio. Raccogliere i lisati in provette da 1,5 mL e utilizzare la descrizione del protocollo nel passaggio 2.5.
3. Raccogliere cellule in sospensione in provette da 15 mL, lavare due volte con 10 mL di PBS freddo ghiaccio, trasferire in provette da 1,5 mL e centrifugare a 600 x g per rimuovere PBS. Togliere le fasi di lavaggio completamente per mantenere la concentrazione di ingredienti di buffer di lisi di PBS. Memorizzare le palline delle cellule a-80 ° C fino a lisi.
4. Raccogliere e pesare tessuti rapidamente. Mantenere i tessuti in azoto liquido subito dopo dissezione e store a -80 ° C.
   Nota: La resa di proteine dei tessuti è circa il 5-10% del peso del tessuto
5. utilizzare dimensioni tessuto omogeneo e regioni anatomiche per 10 campioni per ridurre l'eterogeneità del campione. Rimuovere la contaminazione del sangue risciacquando campioni due volte con 1 mL di PBS freddo ghiaccio per evitare le proteine del sangue molto abbondante che interessano la quantificazione della proteina e l'analisi dei dati a valle.

2. Estrazione della proteina, controllo di qualità Western Blotting, digestione In soluzione e Peptide desalificazione

Nota: utilizzo ciascuno dei 10 campioni allo stesso modo durante qualsiasi passaggio prima che il pool di campioni con etichetta TMT è essenziale per ridurre variazione.

1. make (50 mM HEPES [pH 8.5], urea 8 M e 0,5% sodio desossicolato) il giorno dell'esperimento.
   Nota: Denaturazione proteica parziale durante la lisi del campione influenza l'efficienza di digestione di proteine.
2. Aggiungi lysis buffer affinché il rapporto di buffer per volume di campione è 10:1 e ~ 20% del volume finale di perle di vetro (diametro 0,5 mm) per palline delle cellule o tessuti (ad es., volume 10: 1 rapporto tra buffer e campioni) per ottenere una concentrazione finale di proteine della 5 a 10 mg/mL. Tenere tutti i 10 campioni la stessa concentrazione considerando il numero di celle utilizzate o peso del tessuto di ogni campione.
3. Concentrazione nell'urea Maintain a 8 M con l'aggiunta di urea solida al campione. Ricordatevi di prendere in considerazione il volume del pellet cellulare o tessuto nel calcolare la quantità di urea solida per aggiungere al campione per ottenere la concentrazione di 8 M.
   Nota: ONU-fresco urea buffer può introdurre modificazione chimica artificiale (cioè, la carbamilazione) e influire negativamente sul numero di peptidi identificati. Urea occupa un volume considerevole (100 mg di urea occupa ~ 73 µ l di soluzione).
4. Mantenere i detriti insolubili in lisato per permettere la digestione delle proteine insolubili ²³.
5. Lyse i campioni in un frullatore a 4 ° C a velocità 8 per 30 s, resto per 5 s e ripetere per 5 volte o fino a quando i campioni sono omogeneizzati. I campioni possono anche essere lisati nel Vortex per 30 s a temperatura ambiente (TA) con un 30 s periodo sul ghiaccio per ~ 10 cicli di raffreddamento. Adeguare le condizioni di lisi come necessario, a seconda del tipo di campione.
6. Mescolare il lisato bene senza centrifugazione e fare 2 piccole aliquote (~ 15 µ l ciascuna). Utilizzare 1 aliquota a misura di concentrazione di proteine e 1 aliquota per eseguire la convalida del controllo positivo eseguendo analisi western blot. Mantenere la restante aliquota Grande per l'analisi proteomica.
7. Concentrazione di proteina di misura da un'analisi di quantificazione della proteina standard o da un macchiato di Coomassie breve sodio dodecil solfato del gel di poliacrilammide (10%) ²² con albumina di siero bovino (BSA) come standard. Utilizzare uno standard di BSA con un alto grado di precisione di concentrazione nota. Per raggiungere il massimo livello di precisione, eseguire analisi dell'amminoacido dello standard BSA.
   Nota: Altri precisi standard potrebbe essere disponibile. Le concentrazioni di proteina possono essere stimate anche dai numeri delle cellule o del tessuto pesi. Sebbene sia consigliabile 1 mg di proteina (100 µ g/campione), l'analisi può essere eseguito con meno di 100 µ g di proteina (10 µ g/campione).
8. Aggiungi 100% acetonitrile (ACN) per ottenere una concentrazione finale di 10% della proteasi ACN e LysC ad un rapporto di enzima-substrato di 1: 100 (w/w) per digerire le proteine sotto altamente denaturare le condizioni a temperatura ambiente per 2 h ¹. Aggiungere ditiotreitolo (DTT) a una concentrazione finale di 1 mM per ridurre i legami disolfuro nelle proteine e incubare per 1 h. eseguire LysC digestione ad una concentrazione finale di urea 7,2 M.
9. Diluire ulteriormente il digest campioni con tripsina a RT per 3 h e all'urea 2 M con 50 mM HEPES (pH 8.5) o pernottamento in una tripsina rapporto proteina di 01:50 (w/w). Uso circa 2 µ g di tripsina per 100 µ g di proteine e una concentrazione di tripsina di circa 10 ng / µ l.
   Nota: I fattori che possono condurre alla digestione della tripsina inefficiente sono problemi di pH, tripsina inattiva o l'uso di un rapporto inappropriato dell'enzima al substrato.
10. Aggiungere DTT a cedere 1mm e ridurre ulteriormente i peptidi per 2 h a RT.
11. Aggiungi iodoacetamide (IAA) per raggiungere 10 mM. Incubare 30 min al buio per alchilare Cys-contenenti peptidi a RT.
12. Placare non reagito IAA aggiungendo DTT per raggiungere 30mm e incubare per 30 minuti a TA.
13. Controllare l'efficienza della digestione della tripsina esaminando una piccola aliquota di ciascun campione. Desalificare utilizzando una punta di pipetta 10 µ l con cromatografia media incorporati nello spazio morto, secondo il produttore ' protocollo s. Analizzare ogni campione di LC-MS/MS. LC-MS/MS parametri sono gli stessi come nel passaggio 5, con l'eccezione che il gradiente è 10 min ²³.
14. Eseguire una ricerca nel database per i dati grezzi di MS (vedere più in dettaglio nel passaggio 6) utilizzando 4 fenditure perse come parametro di ricerca.
    Nota: Se il numero di perso fenditure è > 10%, può indicare digestione della tripsina incompleta. Questo influenzerà negativamente i risultati a valle. Questo è un passo critico controllo qualità (QC).
15. Digerire campioni nuovamente se la mancata segmentazione è > 10% con l'aggiunta di un ulteriore 10 µ l di tripsina ai campioni.
16. Acidificare i campioni con l'aggiunta di acido trifluoroacetico (TFA) per raggiungere l'1% di concentrazione. Misurare il pH usando una striscia di pH. Verificare che il pH è scommessatra 2 e 3. Aggiungere più TFA goccia saggio (1 µ l) esigenze finché non si ottiene il corretto pH.
17. Centrifuga a 20.000 x g a RT per 10 minuti e raccogliere il surnatante.
18. Lavare 0,5 a 60 µ g capacità spin colonne contenente resina fase inversa C18 con 0,25 mL di metanolo, se viene utilizzato 100 µ g campioni. Lavare 0,03 a 30 µ g capacità spin colonne con 0,25 mL di 60% TFA ACN/0.1% se utilizzando campioni di 10 µ g. Centrifugare le colonne di spin a 500 x g per 30 s.
19. Equilibrare colonne con 0,5 mL di 0,1% TFA e rimuovere mediante centrifugazione a 500 x g per 30 s.
20. Caricare campioni su colonne e associare i campioni alle colonne mediante centrifugazione a 100 x g per 3 minuti o fino a quando tutto il campione è passato attraverso la colonna.
21. Aggiungere 0,5 mL di 0,1% TFA alle colonne e centrifugare a 500 g per 30 s.
22. Aggiungere 125 µ l di 60% TFA ACN/0.1% a ogni colonna ed eluire mediante centrifugazione a 100 x g per 3 min verificare tutta la soluzione è passato attraverso la colonna.
23. a secco gli eluenti a un concentratore a vuoto. Assicurarsi che i campioni siano resti completamente asciutti e non liquidi nei tubi. Conservare a-80 ° C fino a ulteriori analisi.

3. Etichettatura di peptidi TMT

Nota: è fondamentale per garantire che tutti i campioni sono completamente etichettati dai reagenti TMT. Diversi fattori (ad es., quantità di reagenti TMT, valore pH e precisione di quantificazione della proteina) possono influenzare TMT etichettatura di efficienza, che modificherà negativamente tutti i risultati a valle.

1. Ricostituire ogni campione dissalate peptide in 50 µ l di tampone HEPES 50 mM (pH 8.5). Controllare il pH e assicurarsi che è tra 7 e 8.
   Nota: Il campione può essere acida se non completamente asciugato dopo la fase di dissalazione, che influenzerà l'efficienza d'etichettatura.
2. Tenere ~ 1 µ g di ogni campione senza etichetta per un test in efficienza d'etichettatura e TMT successivo, come descritto al punto 3.3.
3. Sciogliere i reagenti TMT in ACN anidro ed etichettare i campioni del peptide seguendo il produttore ' s istruzioni. Incubare i reagenti a temperatura ambiente per 1 h.
4. Eseguire un test di efficienza d'etichettatura QC TMT dissalazione ~ 1 µ g di ogni campione con etichetta TMT e - senza etichetta utilizzando 10 puntali µ l con supporti incorporati cromatografia secondo il produttore ' protocollo s. Analisi di campioni di TMT-etichettati e senza etichetta di LC-MS/MS.
   Nota: I parametri di LC-MS/MS sono lo stesso come descritto in sezione 5, con l'eccezione che il gradiente è 10 min.
5. Esaminare i dati grezzi per garantire che i peptidi senza etichetta non vengono rilevate nei campioni etichettati, garantendo efficienza etichettatura completa ( Figura 2). Fare questo per 6 a 10 peptidi separati verificare l'efficienza d'etichettatura.
6. Placare la reazione aggiungendo 4 µ l di 5% idrossilammina e incubare per 15 min.
7. Mescolare un'aliquota di volumi uguali e piccole (2 µ l) di ciascun campione con etichetta TMT. Desalificare utilizzando 10 puntali µ l con supporti incorporati cromatografia. Analizzare i campioni mediante LC-MS/MS, come descritto al punto 3.4. Utilizzare il programma di software di salto (un algoritmo di ricerca database open-source che converte i file raw di tandem MS in un elenco di peptidi e proteine) per determinare il rapporto di concentrazione relativa di tutti i 10 campioni delle intensità di tag TMT di tutti identificati peptidi.
   Nota: Questa prova di rapporto di premiscela QC è utile per determinare il corretto rapporto per miscelazione uguale prima la condivisione finale, come possono verificarsi errori di pipettaggio che cambierà le concentrazioni e il passo di quantificazione della proteina potrebbe non essere sempre accurato. È anche il modo migliore per garantire che l'importo di ciascuno dei 10 campioni utilizzati per il mixaggio finale sono tutti a un rapporto di parità, come descritto al punto 3.5.
8. Ripetere tante volte quanto necessario per garantire un rapporto di 1:1 tra tutte le 10 campioni.
9. Mescolare ugualmente i 10 campioni secondo i risultati del test rapporto premix. Utilizzare l'esempio con la concentrazione più bassa come base di riferimento per regolare i volumi degli altri 9 esempi.
10. Rimuovere i sottoprodotti della reazione d'estinzione del pool TMT-etichettato campione di desalificazione.
Bossoli di estrazione
11. solido-fase di lavaggio da 1 mL contiene 50 mg di sorbente per colonna con 1 mL 0,25 mL di metanolo se utilizza 100 µ g campioni. Lavare 0,5 a 60 µ g capacità C18 spin colonne con 1 mL 0,25 mL di 60% TFA ACN/0.1% se utilizzando campioni di 10 µ g. Centrifugare le colonne a 500 x g per 30 s.
12. Equilibrare colonne con 0,5 mL di 0,1% TFA e rimuovere mediante centrifugazione a 500 x g per 30 s.
13. Caricare campioni su colonne e associare mediante centrifugazione a 100 x g per 3 minuti o fino a quando tutto il il campione è passato attraverso la colonna.
14. Aggiungere 0,5 mL di 0,1% TFA alle colonne e centrifugare a 500 g per 30 s.
15. Aggiungere 125 µ l di 60% TFA ACN/0.1% a ogni colonna ed eluire mediante centrifugazione a 100 x g per 3 min verificare tutta la soluzione è passato attraverso la colonna.
16. a secco gli eluenti a un concentratore a vuoto. Assicurarsi che i campioni siano resti completamente asciutti e non liquidi nei tubi. Conservare a-80 ° C fino a ulteriori analisi.

4. Estesa ad alta risoluzione, base pH LC Prefractionation

1. Set 2 colonne C18 collegate contenente particelle di ibrido di etilene con bridging (4,6 mm x 25 cm, per un totale di 50 cm; 3,5 µm granulometria) e utilizzare una pompa di LC microliter flusso ad alte prestazioni per frazionamento.
   Nota: L'uso di 2 colonne aumenta il carico del peptide e non migliora necessariamente la cromatografia. Per campioni contenenti ≤ 200 µ g di peptidi, 1 colonna è sufficiente.
2. Lavare il ciclo di 100-µ l con aggiunte successive di 300 µ l di tampone A metanolo e acqua (Formiato di ammonio 10 mM, pH 8.0).
3. Lavare le colonne con 100 µ l di altrettanto misto isopropanolo, metanolo, acqua e ACN ed equilibrare la colonna nel buffer di 95% per 2 h.
4. Solubilizzare il campione dissalate pool TMT-etichetta del peptide in 65 µ l di tampone A. Verificare che il pH del campione è ~ 8.0. Se ancora acida, utilizzare idrossido di ammonio per aggiustare il pH a 8.0.
5. Fractionate campione utilizzando il seguente gradiente con buffer B (tampone un plus 90% ACN): 15% al 20% per 15 min, 20% al 35% per 100 min e 35% al 50% per un minimo di 30 Set al collector frazione di raccogliere le frazioni ogni 2 min compreso il tempo di caricamento. Impostare la portata a 0,4 mL/min. Vedere riferimento ²⁹ e Figura 1 per un rappresentanza cromatogramma.
6. Raccogliere un totale di 80 frazioni e asciugare 40 frazioni (ogni altra frazione) con un concentratore a vuoto a completo essiccamento.
7. Utilizzare i 40 campioni secchi per analisi LC-MS/MS.
8. Analizzare 80 tutte le frazioni di LC-MS/MS per ottenere copertura ultra profonde proteome.

5. Preparazione di LC-MS/MS e parametri

Nota: quantificazione In TMT-base, ioni del peptide sono isobarico e appaiono come 1 massa in un'esplorazione MS1. Tuttavia, essi sono quantificati secondo l'intensità di ioni reporter (10 unico reporter ioni) durante la scansione di MS/MS dopo lo ione del peptide è stato frammentato con dissociazione di più alta energia collisione (HCD). I rapporti di TMT reporter dello ione possono essere soppressa da co-eluizione di ioni con etichetta TMT ²⁴. Restringimento dello ione isolamento finestra ²⁵, fase gassosa purificazione ²⁶, il MultiNotch MS3 metodo ²⁷ o vasto frazionamento con LC multidimensionali e lunghi gradienti (4-8 h) ²⁸ sono approcci alternativi.

1. Pack 75 µm di diametro interno (ID) svuotare colonne con 1,9 µm di C18 resina a 30-40 centimetri di lunghezza (~1.3 µ l di letto).
2. Riscaldare le colonne a 65 ° C con un riscaldatore del portfolio di farfalla per ridurre la contropressione e impedire l'eccessiva pressione della ultra-alto-pressione sistema di cromatografia in fase liquida (UPLC). Bobina della colonna 2 o 3 volte all'interno del riscaldatore di farfalla per garantire che la lunghezza del letto intera colonna è riscaldata. Nastro della colonna all'interno del riscaldatore facendo attenzione a non nastro sopra il sensore di temperatura all'interno del riscaldatore.
   Nota: Il riscaldatore di portfolio di farfalla è montato e registrato su un pezzo su misura di plexiglass associato alla fase dello strumento XYZ.
3. Preparare una (3% dimetil solfossido e 0,2% acido formico) nel buffer e B del buffer (buffer un plus 67% ACN) e lavare le colonne accuratamente con buffer di 95% B. Quindi, completamente equilibrare colonne in 95% tampone A (volumi di almeno 3 colonne). Utilizzare una portata di ~0.25 µ l/min e contropressione di 280 a 320 bar
4. Esaminare la qualità del sistema LC-MS/MS eseguendo 100 ng di ratto cervello peptidi (o standard della nostra scelta) due volte prima di analizzare i campioni di TMT-etichettati. Verificare i seguenti parametri frequentemente per garantire la raccolta di dati di alta qualità: sondaggio MS l'intensità del segnale (tra e8 ed e9 per intensità di picco base), qualità degli spettri MS/MS (una buona rappresentanza di ioni y e b), larghezza del picco (12-22 s), tempo di ritenzione complessivo, Pressione di sistema LC (aumento di pressione > 50 barre indica una colonna sporco o intasato emettitore punta) e variabilità Assay (picchi identici dovrebbero essere < 30 s tra le esecuzioni).
   Nota: Per risolvere gli ioni vicino isobarica reporter dei reagenti TMT 10-plex (6.32 mDa differenza), la risoluzione di MS/MS deve essere impostata su almeno 30.000 a 400 m/z. HCD viene in genere utilizzato per frammentazione di ioni TMT10-plex reporter, in quanto non è soggetto alla regola di un terzo che si applica alla dissociazione indotta da collisione (CID) in trappola ionica strumenti.
5. Pulire e tarare lo strumento MS regolarmente e utilizzare i freschi LC buffer per migliorare le prestazioni del sistema.
6. Ricostituire i peptidi secchi dalla separazione pH di base in 5% TFA.
7. Caricare ~0.2 µ g sulla colonna mentre fluenti buffer di 5% r.
8. Elute con il 15% e il 45% del buffer B in 150 min. Come punto di partenza, utilizzare il seguente gradiente: tempo 0, buffer B 5%; tempo 2, tampone B 15%; 135, tampone B 45% del tempo, tempo 145, tampone B 70%; e 150, tampone B 95% del tempo. Regolare la sfumatura leggermente per frazioni RPLC pH di base precoce e tardiva dopo aver esaminato i cromatogrammi di picco base.
9. Operano lo spettrometro di massa in modalità dati-dipendente con una scansione di analisi nell'analizzatore di massa della presa dello ione (400-1600 m/z; 60.000 Risoluzione; 1 x 10 ⁶ guadagno automatico controllo (AGC) target; 50 ms tempo di massima dello ione; e modalità centroide). Eseguire scansioni ad alta risoluzione di 20 MS/MS (60.000 ad alta risoluzione, obiettivo AGC 1 x 10 ⁵, ~ 100 ms tempo di massima dello ione, 35 energia di collisione di HCD normalizzato, 0,4 m/z isolamento finestra ed esclusione dinamica di 20 s).
   Nota: Dissociazione per trasferimento dell'elettrone (ETD) non è consigliabile per i reagenti TMT10-plex siti di fenditura ETD sono diversi da HCD, conseguente sovrapposizione dello ione reporter. Inoltre, ETD non è efficace come HCD perché peptidi triptici in genere generano stati caricati + 2 ed ETD è più efficiente a stati di carica superiori.

6. Analisi di dati di MS

Nota: Descriviamo l'analisi dei dati con il programma di software di salto. Tuttavia, l'analisi dei dati può essere eseguita con altri programmi commercialmente disponibili o free.

1. Motore salto ²¹, che combina una ricerca di database basato su reticolo e un sequenziamento basato su tag de novo per migliorare la sensibilità e la specificità di ricerca i file raw di processo dallo spettrometro di massa con l'ibrido basato su tag.
2. Convertire dati grezzi per mzXML formattare e ricerca MS2 spettri contro il database umano di UniProt destinazione-decoy (o altri database appropriato specie-specifico) per calcolare il tasso di falsi scoperta (FDR).
3. Eseguire le ricerche utilizzando una tolleranza di 10 ppm di massa per gli ioni precursore e di frammento. Impostare altri parametri di ricerca completamente triptico restrizione con 2 fenditure perse massimi, 3 massimo modifica siti al peptide e l'assegnazione di un, b e y ioni di segnare i peptidi. Impostare statiche modifiche ai tag TMT sui residui di Lys e N termini (+229.162 Da) e carbamidomethylation di residui di Cys (+57.021 Da). Impostare modifiche dinamiche per includere l'ossidazione Met (+15.994 Da), che è un artefatto di peptide comuni derivanti dalla manipolazione del campione.
4. Filtrare i dati dai seguenti criteri: 7 dell'amminoacido peptide minima lunghezza, precisione m/z (ad es., 5ppm) e corrispondenti punteggi (score J e deltaCn). Peptidi secondo la lunghezza del peptide, trypticity, di gruppo e stato di carica.
5. Utilizzare un ulteriore livello di filtraggio abbinando Spartiti per ridurre proteina FDR a inferiore all'1%. Proteine identificate da un singolo conteggio spettrale richiedono un punteggio più alto corrispondente.
6. Per condiviso da più membri di una famiglia di proteine, peptidi cluster i membri corrispondenti proteine in 1 gruppo.
   Nota: Secondo il principio di parsimonia, il gruppo è rappresentato dalla proteina con il maggior numero di peptidi assegnate e altre proteine accompagnati da peptidi unica ¹.
7. Quantitate proteine sommando reporter dello ione conteggi attraverso tutte le partite di spettro del peptide abbinati (PSMs) utilizzando un programma che integrato la suite di software salto.
8. Per ciascuna accettato PSM, estrarre e correggere le intensità di ioni del reporter TMT secondo la distribuzione isotopica di etichettatura reagenti e la polarizzazione di caricamento, che è calcolata dai dati di quantificazione del PSM globali. Filtro PSMs con intensità bassa ed alta rumorosità con soglie definite dall'utente durante la quantizzazione.
9. Calcolare un segnale relativo tra ciascuno ione di reporter e la media di tutti gli ioni 10 reporter. Sommare i relativi segnali del PSMs per proteine identificate. Convertire questi segnali relativi ai segnali assoluti moltiplicando l'intensità di ione Media reporter del PSMs top 3 in corrispondenti proteine.
10. Utilizzare un approccio computazionale post-MS interferenza. Supponendo che l'intensità di ioni ₁ y è proporzionale all'intensità di ioni di reporter, calcolare il rapporto lineare da scansioni pulite e derivare il livello di interferenza dall'intensità y1ion contaminati in scansioni rumoroso ²³.
    Nota: Per i peptidi triptici TMT-etichettati, residui di K-TMT e R sono 2 tipi di ioni y ₁ (Da 376.27574 e Da 175.11895, rispettivamente) in scansioni MS2. Se solo 1 y ₁ ione viene rilevato ed è coerenza con il peptide identificato, il MS2 è considerata pulita scansione ( Figura 3A). Se vengono rilevati sia y1ions, la MS2 è ritenuto una scansione rumorosa.
11. Esportare i valori di quantificazione della proteina in un programma di software di foglio di calcolo per ulteriori analisi. Utilizzare confronti a coppie o un'analisi della varianza per identificare proteine differenzialmente espressi.

7. Convalida dei dati MS

Nota: per valutare la qualità dei dati di MS, almeno 1 metodo di convalida deve essere eseguita prima di procedere con gli esperimenti biologici che richiede tempo.

1. Esaminare manualmente gli spettri MS/MS di proteine di interesse per convalidare la sequenza del peptide e la quantificazione dello ione TMT reporter.
2. Uso conosciuto dati di quantificazione della proteina per confermare i risultati di MS.
3. Verificare cambiamenti della proteina con approcci basati su anticorpi (ad es., westeRN analisi immunohistochemistry e della macchia).
4. Chimicamente sintetizzare i peptidi di interesse e li usa come interni standard per confermare l'identificazione dei peptidi nativi.
   Nota: I loro modelli di MS/MS e il tempo di ritenzione durante LC-MS/MS dovrebbe essere identiche.
5. Verificare le modifiche di proteine con un approccio mirato di MS.

Abbiamo usato un mix di peptide cross-specie precedentemente descritte per analizzare sistematicamente l'effetto di compressione rapporto in 3 passi principali del protocollo, tra cui frazionamento pre-MS, MS impostazioni e correzione post-MS²³. Il frazionamento di pre-MS è stato valutato e ottimizzato utilizzando una combinazione di pH di base RPLC e pH acido RPLC. Per l'analisi di post-MS, sono stati considerati solo specie-peptidi. Abbiamo usato questo modello di interferenza per esaminare una serie di parametri in LC/LC-MS/MS, inclusi finestra isolamento MS2, risoluzione online di LC, quantità di caricamento del pH siliceo online RPLC e risoluzione del RPLC alto pH non in linea (vedere la Figura 3 in riferimento ²⁹).

Per modificare la risoluzione durante la LC non in linea, abbiamo separato i peptidi con etichettati isobarico in 320 frazioni e quindi combinati selezionate frazioni insieme per regolare la potenza di separazione. Risoluzione di LC non in linea è stato testato utilizzando un numero di sottoinsiemi di frazione raccolti (1, 5, 10, 20, 40, 80 e 320), mentre il monitoraggio dei livelli di interferenza. Abbiamo trovato che i livelli di interferenza è diminuito gradualmente da 16,4% al 2,8%, indicando tale frazionamento estesa durante la separazione LC non in linea un po' alleviato il problema della co-eluizione peptidi ma non era in grado di rimuovere completamente il interferenze.

Successivamente, abbiamo valutato l'effetto della finestra isolamento MS2 sull'interferenza. Abbiamo determinato sperimentalmente che l'interferenza è approssimativamente proporzionale alla dimensione della finestra di isolamento, in accordo con precedenti studi^29,30. Ad esempio, una differenza di 4 volte della dimensione della finestra (Da 1.6-0,4) ha provocato un ~ 4 volte differenza di livello di inferenza (14,4% al 3,7%). Abbiamo anche determinato la quantità di carico ottimale sulla colonna per analisi MS e utilizzato queste informazioni per negare ulteriori interferenze. Abbiamo ridotto l'interferenza dal 9,4% al 3,3% del caricamento la giusta quantità di campione. Carico troppo campione può portare a picco ampliamento³¹ e quindi aumentare il livello di interferenza, con conseguente precisione di quantificazione della proteina ridotta. Infine, abbiamo ottimizzato la risoluzione RPLC online modificando le lunghezze gradiente (1, 2 e 4 h) e utilizzando una colonna lunga (~ 45 cm). Abbiamo trovato che una sfumatura di 4-h quasi eliminato l'interferenza (fino a 0,4%) ma anche aggiunto tempo di strumento. I parametri ottimizzati ha rivelato una finestra stretta isolamento (Da 0,4), ~ 100 ng di campione caricato sulla colonna e frazionamento midlevel (~ 40 x 2 h, 3,3 giorni). Abbiamo anche dimostrato che utilizzando una strategia basata su computer post-MS correzione migliorato precisione quantitativa quando determinazione rapporti di proteina (Figura 3B).

I nostri risultati indicano che l'uso di LC-MS parametri ottimizzati e correzione di post-MS in grado di fornire un profilo proteomico approfondita e virtualmente eliminano i disturbi che spesso viene prodotto mediante tecniche di etichettatura isobariche per quantificazione della proteina.

Figura 1: schema di analisi del profilo intero proteoma di TMT-LC/LC-MS/MS. Dieci campioni biologici sono stati lisati, digeriti ed etichettati con 10 diversi tag TMT, ugualmente riunite e frazionate in 80 frazioni mediante cromatografia liquida (LC) a fase inversa pH di base non in linea. Ogni altra frazione è stata ulteriormente separata da RPLC acide e analizzata online con uno spettrometro di massa ad alta risoluzione. I file raw di MS/MS sono stati elaborati e consultati in un database Uniprot per identificazione di peptidi e proteine. Proteine sono state quantificate secondo le intensità relative dei tag TMT. Infine, le proteine identificate e quantificate sono stati sottoposti ad analisi di dati integrativi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: TMT etichettatura esame efficienza. Entrambi con etichetta TMT e loro corrispondenti senza etichetta di campioni sono stati analizzati mediante LC-MS/MS separatamente per esaminare TMT etichettatura di efficienza. Per l'etichettatura completa di TMT, (A), il peptide senza etichetta di picco era completamente assente nel campione con etichettato, (B), mentre il peptide TMT-etichetta era presente solo nel campione con etichettato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: approccio computazionale per la rimozione di interferenza dopo la raccolta di dati di MS. (A) MS2 tutte le scansioni sono state divise in pulito (pannello di sinistra) e scansioni rumorosi (pannello di destra). Scansioni rumorosi esibiscono entrambi y₁ ioni di K e R (1 da un peptide di destinazione e gli altri da contaminanti peptidi). (B) Peptidi di Escherichia coli sono stati individualmente etichettati con 3 diversi reagenti TMT e riuniti a 1:3:10 rapporti. Circa 20 volte più peptidi di ratto sono stati aggiunti come sfondo. Le intensità relative sommate dei peptidi Escherichia coli nei 3 gruppi ha rivelato che y₁ basati su ion correzione è più accurato per la quantificazione di TMT-basato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Descriviamo un protocollo ad alta velocità per la quantificazione delle proteine con una strategia di etichettatura isobarica 10-plex, che è stata implementata con successo in diverse pubblicazioni^12,13,14,32 . In questo protocollo, possiamo analizzare fino a 10 campioni biologici differenti della proteina nell'1 esperimento. Ordinariamente possiamo identificare e quantificare ben oltre 10.000 proteine con elevata fiducia. Anche se etichettatura isobarica è un'efficace tecnologia per quantificare le proteine, è limitato dalla compressione di rapporto che può condurre ad inesattezza quantitativa. Nostro protocollo usando varie strategie, come l'ottimizzazione di LC/LC e le impostazioni di MS/MS in combinazione con y₁ basati su ion post-MS correzione, rimuove efficacemente la maggior parte degli effetti di interferenza e di conseguenza migliora notevolmente la precisione di quantificazione della proteina.

Per la quantificazione della proteina, la suite di salto delle funzioni di programmi in un certo numero di modi. Abbiamo misurato l'impurità isotopico per ogni lotto di reagenti acquistati, che differisce leggermente dai valori riportati nei certificati fornito dal fornitore. L'impurità isotopica misurata è utilizzato per correggere le intensità degli ioni di reporter del software di salto. Una proteina è quantificata in genere da molti PSMs con varie intensità assoluta che sono influenzati da molteplici fattori, quali l'efficienza di ionizzazione. Poiché l'influenza dei fattori è sconosciuto, spettri di massa rivelano solo le abbondanze relative di ioni di reporter in un'analisi TMT. Le abbondanze relative di ioni di reporter sono calcolate dividendo l'intensità di ogni ione reporter dall'intensità media di 10 tutti i reporter. Per fornire il miglior rappresentante "segnale assoluto" della proteina, abbiamo calcolato una media delle intensità relative di 3 PSMs con la più alta intensità assoluta dalla proteina e la media di più forte intensità assoluta per stimare l'assoluto segnale della proteina. Abbiamo definito questi passaggi come ridimensionamento. La correzione di₁ y è universalmente applicabile a qualsiasi analisi TMT; Tuttavia, in alcuni casi potremmo non correggiamo per peptidi con spettri MS/MS che contiene lo ione₁ y. Tuttavia, abbiamo trovato che ~ 90% degli spettri hanno gli ioni y1 dalla lisina e arginina. Per compensare le interferenze causate dai co-eluizione peptidi che hanno gli stessi residui C-terminale come il peptide identificato, il livello di interferenza stimato era essenzialmente raddoppiato e utilizzato per la correzione. Questa ipotesi si basava sull'evidenza empirica che abbiamo raccolto nel corso di numerosi esperimenti TMT, in cui abbiamo osservato lo stesso livello di intensità per y₁ a K - e R-contenenti peptidi.

Possono ridurre le interferenze con molti metodi diversi da quello che abbiamo descritto in questo protocollo, ad esempio l'approccio multinotch MS3. Tutti questi metodi sono validi e hanno i loro meriti individuali. In definitiva, la metodologia utilizzata dipende da vari fattori, compreso ma non limitato a quantità di campione, disponibilità dello strumento (cioè, tipo di strumento e tempo necessario per l'analisi dei campioni), risultati desiderati (ad esempio, numero di proteine identificate) e la quantificazione precisione necessarie.

Per garantire i risultati più accurati, è importante ascoltare i passaggi di controllo di qualità in tutto il protocollo. Questi includono l'utilizzo di precise norme per la quantificazione del campione (ad es., BSA che ha subito l'analisi dell'amminoacido), verificare l'efficienza di etichettatura del reagente TMT, determinare l'efficienza della digestione della tripsina, esecuzione di un test di rapporto premix per assicurare una miscelazione uguale di tutti i 10 campioni e utilizzando un software per correggere eventuali pregiudizi di caricamento. Nei casi in cui una proteina nota o più proteine sono tenuti ad esporre i cambiamenti di espressione tra singoli campioni, è importante eseguire l'analisi western blot dopo la lisi della cellula iniziale per confermare che questi cambiamenti sono presenti e possono essere rilevati. Questo assicura che i campioni rappresentano la biologia per essere testato e consente di risparmiare tempo, denaro e sforzo prima di effettuare l'intero protocollo TMT. Se un campione particolare è previsto per non esprimere determinate proteine, è anche importante utilizzare l'analisi western blot per confermare la loro assenza dopo lisi prima di continuare con il protocollo. Il test del rapporto di premiscela viene utilizzato quando la maggior parte delle proteine sono tenute a non cambiare attraverso i 10 campioni biologici. Abbiamo anche rimosso proteine contaminanti note, come le cheratine, così essi non inciderebbe negativamente la nostra correzione. Il nostro metodo di quantificazione rettificato per eventuali errori che possono essersi verificati da errori di pipettaggio, ecc. Quando possibile, abbiamo usato specificamente pipetta volumi superiori a 5 µ l per ridurre gli errori. Abbiamo eseguito vari cicli di questa prova di premiscela per garantire che abbiamo ottenuto un accurato mix di 1:1. È importante notare che abbiamo non ha eseguito questo tipo di test del rapporto di premiscela quando utilizzando campioni di immunoprecipitazione per il protocollo, come ci aspettavamo una grande percentuale delle proteine per cambiare. In tali casi, il test di premiscela sarebbe falsare i risultati. Questo vale anche per qualsiasi esperimento in cui almeno 1 dei 10 campioni dovrebbe variare notevolmente nell'espressione della proteina (vettore vuoto, inibizione del proteosoma, ecc.) In questi casi, si consiglia vivamente di utilizzare la replica per facilitare la quantificazione statistiche. Si consiglia in genere eseguendo 3 replica per questi tipi di campioni. In definitiva, il numero delle ripetizioni è basato sulla variabilità prevista di ciascun campione.

Con qualche limatura, questo robusto protocollo utilizzabile come una pipeline di proteomica generale per studiare le proteine, vie della proteina, la progressione della malattia e altre funzioni biologiche. Il protocollo qui presentato fornisce una potente tecnica per ottenere il riempimento della proteina profonda ed alleviare la soppressione del rapporto durante la quantificazione. Con modifiche minori, il presente protocollo può essere facilmente adattato per quantificare le modifiche post-traduzionali della proteina, quali fosforilazione, ubiquitinazione e acetilazione^33,34. Questi tipi di progetti di proteomica globale possono essere integrati con la genomica, trascrittomica e possibilmente metabolomica per un approccio di biologia di sistemi comprendere i sistemi biologici e facilitare nuove scoperte dei meccanismi molecolari, biomarcatori e target terapeutico nella malattia^{13,28,35,36,37,38}.

Abbiamo dimostrato un metodo per la quantificazione accurata oltre 10.000 proteine da lisati di cellule intere o tessuto. Ci aspettiamo che questo metodo sia ampiamente applicabile a molti sistemi biologici.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Gli autori ringraziano tutti gli altri membri lab e impianto per utile discussione. Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto da NI H concede ALSAC, R01AG047928, R01AG053987 e R01GM114260. L'analisi di MS è stata eseguita in Research Hospital proteomica Facility di St. Jude Children, parzialmente sostenuto da NIH Cancer Center Support grant P30CA021765. Gli autori ringraziano Nisha Badders per aiuto con il manoscritto di editing.