Dissezione della Retina umana e RPE-coroide per analisi proteomica

La retina umana è composta in modo funzionale e molecolare distinte regioni, tra cui la fovea, la macula e la retina periferica. Qui, descriviamo un metodo utilizzando biopsie punch e rimozione manuale di strati di tessuto da un occhio umano per sezionare e raccogliere queste regioni distinte della retina per analisi proteomica a valle.

La retina umana è composto della neuroretina sensoriale e il sottostante dell'epitelio pigmentato retinico (RPE), che è saldamente complessato allo strato coroidico vascolare. Diverse regioni della retina sono anatomicamente e molecolare distinte, facilitando funzioni uniche e dimostrando la suscettibilità alla malattia. Analisi proteomica di ciascuna di queste regioni e strati possono fornire le comprensioni vitale nel processo molecolare di molte malattie, compreso degenerazione Macular relativa all'età (AMD), mellito di diabete e il glaucoma. Tuttavia, separazione delle regioni retiniche e strati è essenziale prima analisi proteomic quantitativa possono essere compiuta. Qui, descriviamo un metodo per la dissezione e la collezione delle regioni retiniche foveale, maculare e periferiche e sottostante RPE-coroide complesso, che coinvolge le biopsie del punzone regionali e rimozione manuale di strati di tessuto da un occhio umano. Unidimensionale SDS-PAGE, nonché analisi proteomica a valle, come liquida cromatografia-spettrometria di massa (LC-MS/MS), possono essere utilizzato per identificare le proteine in ogni strato retinico dissecata, rivelando biomarcatori molecolari per malattia retinica.

La retina, RPE e coroide sono tessuti complessi che mostrano importanti differenze regionali nell'espressione della proteina, funzione fisiologica e patologica predisposizioni^1,2. Per esempio, malattie come la degenerazione Macular relativa all'età (AMD), retinite pigmentosa e retinopatia sierosa centrale dimostrano caratteristica localizzazione all'interno della fovea, macula o retina periferia^{1,3, 4,6}. Qui, presentiamo un metodo dimostrando retinico come distinta regioni possono essere campionate in modo indipendente. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di fornire una guida affidabile per la raccolta di campioni di tessuto dalle regioni foveale, maculare e periferiche della retina umana e RPE-coroide per analisi proteomica. La spiegazione razionale per lo sviluppo e l'uso di questa tecnica è che attraverso analisi proteomica di queste regioni specifiche della retina, importanti intuizioni molecolare possono essere acquisite nelle funzioni fisiologiche e fisiopatologiche di queste regioni.

Questo approccio promette di rivelare la base di proteomica per la suscettibilità relativa malattia regionale e di facilitare l'identificazione di nuovi bersagli terapeutici specifici. Infatti, le indagini di proteomica del vitreo e delle sue interazioni con la retina hanno fornito spunti preziosi per la composizione molecolare e la funzione del tessuto sano e malato^{5,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13}. Tuttavia, analisi proteomica comparativa chiaro di distinte regioni retiniche sono carenti. La tecnica contribuirà a sostenere questi studi tanto necessaria, fornendo vantaggi rispetto ad altri metodi dimostrando un approccio di raccolta del tessuto affidabili e riproducibili. Più così, l'approccio è molto accessibile, approfittando del punzone di tessuto di dimensioni standard e prontamente disponibili strumenti di biopsia. La nostra tecnica enfatizza l'appropriata raccolta e conservazione dei tessuti per proteomica elaborazione, facendo considerazioni importanti per la stabilità proteica e degradazione. Così, questo metodo è più adatto per gli investigatori considerando l'analisi molecolare a valle di proteomica fattori.

questo studio è stato approvato dall'Università dell'Iowa ' s Institutional Review Board e aderisce ai principi stabiliti nella dichiarazione di Helsinki.

1. Foveal e maculare biopsia Punch

1. Open e farfalla l'occhio umano, tale che si compone di 4 distinti lembi di tessuto, come descritto in una precedente pubblicazione. ⁵
2. a partire da un occhio umano butterflied inserito in una capsula Petri, centro uno strumento di biopsia del punzone da 4 millimetri sopra la fovea, premere verso il basso e rotolare delicatamente fino a quando non viene fatta un'incisione intorno alla fovea.
3. Successivamente, generare un'incisione intorno al macula di centraggio e premendo verso il basso uno strumento di biopsia del punzone 8 mm pelle entro le arcate della macula, applicando una pressione delicata e rotolamento. Questo produrrà un anello di tessuto che circonda il primo secondo, esterno.

2. Periferico della retina biopsia Punch

1. uso il punch di 4 mm pelle strumento di biopsia per fare una serie di pugni nella retina periferica, appena fuori l'arcade. Qui, fare due punzoni per ogni falda quadrante.
   Nota: Dopo tutti i pugni sono fatte, l'occhio avrà due pugni concentrici nel centro, che rappresenta la fovea e macula, e due pugni alla base di ogni falda-per un totale di 8 pugni nella retina periferica.

3. Fovea e Macula biopsia collezione

1. come il tessuto è ora pronto per la raccolta, raccogliere tutte le biopsie di tessuto in tubi separati del microfuge e congelamento con azoto liquido per l'elaborazione a valle. Conservare tutti i campioni a-80 ° C fino al momento di utilizzo.
2. Utilizzare una pinzetta Colibri 0,12 per afferrare i bordi del tessuto traslucido della fovea retinica. Per raccogliere, elevare e separare il tessuto foveal dalla sottostante coroide-RPE.
3. Allo stesso modo, utilizzare il forcipe Colibri 0,12 per afferrare l'anello esterno del tessuto traslucido macula. Se il tessuto è ancora attaccato al tessuto sottostante o adiacente, è possibile utilizzare un paio di forbici di Westcott attentamente tagliare il bordo, catturare solo il componente retinico e dissezione distanza qualsiasi tessuto di nervo ottico incluso nel punzone.

4. Collezione di Retina periferica

1. utilizzare la pinzetta Colibri 0,12 per separare delicatamente i dischi di tessuto retinico periferico da RPE-coroide sottostanti e posto all'interno di tubi individuali del microfuge.
2. Nel caso di residuo gel vitreale, usare il forcipe per sollevare e separare il gel di distanza per quanto possibile prima dell'accumulazione del tessuto retinico. Una volta tolta la retina, pigmentata RPE-coroide rimane di sotto.

5. Foveal e Macula RPE-coroide collezione

1. uso il 0.12 Colibri pinze per afferrare i bordi del tessuto RPE-coroide scuro che si trova sotto l'area della fovea rimossa. Separare con cura questo tessuto dalla sclera e raccogliere.
2. Usando la pinza stessa, afferrare i bordi dell'anello esterno di tessuto scuro di RPE-coroide sottostanti l'area maculare rimossa. Separare con cura questo tessuto da sclera afferrando i bordi in diversi punti intorno al ring e tirando leggermente. Alla fine, l'anello di tessuto RPE-coroide sarà essere sloggiato e possono essere raccolto.
   Nota: Forcipe secondario nella mano opposta può essere utile nel manipolare il tessuto RPE-coroide durante la rimozione. Come il tessuto retinico, Wescott forbici possono essere utilizzate per aiutare a rimuovere tutto il tessuto che non è stato completamente inciso utilizzando lo strumento punch.

6. Collezione di RPE-coroide Retina periferica

1. utilizzare il forcipe Colibri 0,12 per staccarsi le RPE-coroide nei settori periferici punch 8.
2. Come in precedenza, posizionare il tessuto RPE-coroide in tubi del microfuge e congelamento con azoto liquido per l'elaborazione a valle. Mantenere tutti i campioni a-80 ° C fino a utilizzo.

7. Dissezione di forbici

Nota: se la lama di biopsia del punzone è noiosa o lo strumento di biopsia punch non viene spinto abbastanza duro, potrebbe non esserci un Clean-Cut che circonda il tessuto.

1. In questi casi, tirare via il tessuto per quanto possibile e quindi utilizzare Westcott forbici per tagliare e separare.

Tessuto di RPE-coroide e della retina possono essere elaborati in vari modi per soddisfare un'indagine individuale. Dopo la raccolta, il ricercatore sarà in possesso di campioni di tessuto RPE-coroide dalla regione foveal, macula esterno e retina periferica (Figura 1) e della retina. In particolare, il pugno di regione foveal includerà la fovea, il parafovea e una piccola quantità del perifovea adiacente. Il punzone maculare include il resto della regione perifoveal come pure una piccola quantità della regione vicino a periferico adiacente. Infine, i pugni periferici del campione le regioni medio-periferica e lontano-periferico. In un esperimento rappresentativo, campioni di tessuto sono stati tripsina-digerito e analizzati utilizzando unidimensionale SDS-PAGE per visualizzare contenuto proteico (Figura 2A). I risultati di questa analisi indicano proteine distinte tra le varie regioni della retina. L'analisi di liquido cromatografia-spettrometria di massa (LC-MS/MS)⁶ identificato correttamente peptidi da rodopsina, una proteina di retina altamente abbondanti e unico. Uno spettro di rodopsina rappresentativo ottenuto dalla regione maculare è mostrato nella Figura 2B. Ulteriore analisi del contenuto proteico fornirà approfondimenti funzioni molecolari delle regioni anatomicamente distinte della retina. Nel caso in cui la dissezione non viene eseguita con attenzione, e la retina non è correttamente separata dalla RPE-coroide, differenze nel contenuto proteico fra questi due tessuti non sarà percepibile.

Figura 1 . Regioni della retina. Un'immagine rappresentativa di una retina umana sana. Diverse regioni della retina sono evidenziate dai cerchi punteggiati e regioni campionate da biopsie del punzone sono indicate da cerchi pieni. Il giallo punteggiati cerchi rappresentano la regione foveal, tra cui la fovea, parafovea e perifovea (in viaggio verso l'esterno dal centro), mentre il cerchio giallo pieno rappresenta il pugno foveal di 4 mm. Il cerchio tratteggiato blu rappresenta la regione maculare anatomica, mentre il cerchio tinta blu rappresenta il pugno maculare di 8 mm. Infine, i cerchi rosa punteggiati rappresentano vicino regione periferica della retina (vicino a P), metà regione periferica della retina (metà P) e regione periferica lontano (lontano P). I cerchi di tinta rosa rappresentano i pugni di retina periferica di 4 mm, che contengono le regioni P Mid e lontano P. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 . Identificazione di proteine retiniche. Regioni foveale, la macula e la retina periferica sono stati biopsiati e usati per analisi proteomica. (A) unidimensionali SDS-PAGE e macchiatura d'argento visualizzato proteine in ogni regione della retina. (B) i campioni di tessuto di Retina sono stati oggetto di analisi liquido cromatografia-spettrometria di massa (LC-MS/MS). Lo spettro rappresentanza indicato è della proteina rhodopsin identificata nella regione maculare. Questo spettro rappresenta uno dei cinque peptidi di rodopsina unico identificati nella macula. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Dopo tessuto raccolta, manipolazione e trattamento sono cruciali considerazioni¹⁴. Conservazione in azoto liquido è preferibile fissazione chimica, come quest'ultimo può causare danni alla struttura della proteina, che potrebbe inclinare analisi a valle. Inoltre, la conservazione in azoto liquido è preferito ai metodi che non comportano congelamento di campioni. In particolare, Ferrer et al hanno evidenziato differenze significative nei livelli della proteina tra cervello campioni conservati a 4 ° C o a temperatura ambiente, rispetto a quelli conservati a 0 ° C¹⁵. Inoltre, è importante fare attenzione durante l'elaborazione di campioni, come trattamento chimico e fisico specifico prima di congelamento ha il potenziale di alterare i livelli della proteina e modificazioni post-traduzionali^16,17. Questo punto sottolinea l'importanza di considerare l'analisi previsto a valle dei campioni. Separatamente, temporizzazione post mortem del tessuto raccolto è un altro fattore che può influenzare i livelli e la stabilità delle proteine specifiche. Degradazione può verificarsi per il proteoma del campione a seconda del tempo post-mortem e deposito temperatura^18,19,20. Inoltre, controllare per tempo post mortem del degrado, come da uso di controlli interni tra malattia tessuto e tessuto sano, è cruciale. Se il fattore di temporizzazione viene ignorato, degrado potrebbe distorcere risultati. Come regola generale, prima il tessuto è analizzato post mortem, il minor rischio per la degradazione di alterare i risultati dello studio.

Parecchie modifiche procedurale possono essere fatto al presente protocollo per meglio adattarsi a una domanda di ricerca specifici. Una modifica è che diverse dimensioni pelle punch biopsia strumenti possono essere utilizzati per raccogliere diverse quantità di campioni di tessuto. Tessuto più o meno può essere richiesto per proteomica a valle di elaborazione a seconda della quantità o la stabilità di specifiche proteine di interesse. Inoltre, la dimensione della biopsia del punzone del tessuto può determinare come grossolanamente saranno campionate specifiche regioni della retina o RPE-coroide. Ad esempio, se regioni specifiche, fine del tessuto patologico sono necessari, più piccolo pelle punch strumenti di biopsia possono essere necessaria. Inoltre, se una sezione è così sottile che si scende sotto le funzionalità degli strumenti di biopsia del punzone, microdissection essere richiesto²¹. Inoltre, l'uso di ausili visivi, come ad esempio un ambito o una lente di ingrandimento, dissezione può essere di aiuto la raccolta di tessuto processo-in particolare nei casi di dimensioni ridotte del globo, come con infantile tessuto oculare.

Infine, è importante notare che questa tecnica raggruppa le RPE e coroidico tessuti come un unico complesso, questi tessuti rimangono molecolarmente e funzionalmente distinti. Infatti, i proteomi differiscono notevolmente fra questi due tessuti. Tuttavia, nonostante che queste differenze, la RPE e coroide rimangono anatomicamente, funzionalmente e clinicamente collegato^2,6,7. Così qualsiasi analisi proteomica a valle del complesso RPE-coroide dovrebbero tener presente questa distinzione chiave.

Questo manoscritto dimostra un approccio semplice, affidabile, basso overhead di raccolta dei campioni per analisi proteomica della fovea, macula e retina periferica e tessuto RPE-coroide in occhi umani. A discrezione dello sperimentatore, potranno subire modifiche per il processo di raccolta o tessuto manipolazione, pre- collezione e post-raccolta, a seconda l'analisi proteomica a valle previsto.

Conflitti di interesse non dichiarati.

VBM è sostenuta da sovvenzioni NIH [K08EY020530, R01EY024665, R01EY025225, R01EY024698 e R21AG050437], Doris Duke Charitable Foundation Grant n.: 2013103 e la ricerca per prevenire la cecità (RPB), New York, NY. MT e GV sono supportati da NIH concedere T32GM007337.