En Face Detection di ossido nitrico e superossido in strato endoteliale delle arterie Intact

In questo articolo descriviamo un metodo relativamente semplice adattato utilizzando il colorante fluorescente diaminofluorescein-2 diacetato (DAF-2DA) e dihydroethidium (DHE) per en face rilevazione simultanea e la visualizzazione di ossido nitrico intracellulare (NO) e di anione superossido (O ₂ ^.- ), rispettivamente, in appena isolato aortas intatte di un modello di obesità del mouse.

ossido nitrico endotelio-derivato (NO) prodotto da endoteliale NO-sintasi (eNOS) è uno dei più importanti molecole vasoprotettive nella fisiologia cardiovascolare. Disfunzionale eNOS quali sganciamento eNOS porta alla diminuzione NO biodisponibilità e aumento anione superossido (O ₂ ^.-) di produzione, e, a sua volta promuove malattie cardiovascolari. Pertanto, la misura appropriata di NO e O ₂ ^.- livelli nelle cellule endoteliali sono fondamentale per la ricerca sulle malattie cardiovascolari e complicanze. A causa della natura estremamente labile di NO e O ₂ ^.-, è difficile misurare NO e O ₂ ^.- direttamente in un vaso sanguigno. Sono stati sviluppati numerosi metodi per misurare NO e O ₂ ^.- produzione. È, tuttavia, sia insensibile, o non specifici, o tecnicamente impegnativo e richiede attrezzature speciali. Qui si descrive un adattamentodel metodo colorante fluorescente per en Face Detection e la visualizzazione di intracellulare NO e O ₂ simultanea ^.- utilizzando la cellula permeabile diaminofluorescein-2 diacetato (DAF-2DA) e dihydroethidium (DHE), rispettivamente in aorte intatte di un modello di obesità del mouse indotti per l'alimentazione ricca di grassi-dieta. Abbiamo potuto dimostrare diminuzione intracellulare NO e O migliorato ₂ ^.- livelli nelle aorte intatti appena isolati di topo obesità rispetto al controllo del mouse magra. Abbiamo dimostrato che questo metodo è una tecnica semplice per la rilevazione diretta e visualizzazione di NO e O ₂ ^.- nei vasi sanguigni intatti e può essere ampiamente applicato per l'indagine della funzione endoteliale (dis) sotto (fisio) condizioni patologiche.

Le cellule endoteliali vascolari mantenere l'integrità strutturale e funzionale vascolare rilasciando fattori vasoattivi ^1. Tra questi fattori, l'ossido di azoto endotelio-derivati ​​(NO) prodotto da L-arginina tramite endoteliale NO-sintasi (eNOS) è il fattore più importante e meglio caratterizzato nella fisiologia cardiovascolare ^2. NO provoca il rilassamento della muscolatura liscia e inibisce la proliferazione delle cellule, inibisce l'aggregazione piastrinica e l'adesione delle cellule infiammatorie e l'infiltrazione nello spazio sottoendoteliale, quindi la protezione contro lo sviluppo della malattia vascolare ^3. In molte condizioni fisiologiche e patologiche, tra cui l'invecchiamento, ipertensione, diabete, iperlipidemia, ecc, disfunzione endoteliale caratterizzata da ridotta biodisponibilità di NO e aumentato O ₂ ^.- produzione è presente e promuove la patogenesi dell'aterosclerosi ^2. Gli studi degli ultimi anni dimostrano che il disaccoppiamento di eNOS è unimportante meccanismo per la disfunzione endoteliale, in cui l'enzima eNOS genera O ₂ ^.- invece di NO, nelle varie condizioni suddette ^1,4. Pertanto, l'analisi della funzione endoteliale, in particolare, endoteliali produzione di NO e O ₂ ^.- generazione è fondamentale per la ricerca sperimentale sulle malattie cardiovascolari e complicanze.

Ci sono numerosi approcci metodologici che sono stati sviluppati per analizzare e misurare la produzione di NO in campioni biologici. A causa della natura estremamente labile di NO che viene facilmente ossidato a NO ₂ ^- e NO ₃ ^- con un'emivita di 3 a 6 sec, è difficile da misurare direttamente NO. Pertanto determinazione di NO ₂ ^- / NO ₃ ^- nei campioni di liquido è stato usato come indice di NO liberato dalle cellule o tessuti ^5. Anche se la procedura è relativamente semplice, il metodo è, tuttavia, easily affetto da alta sfondo di NO stabile ₂ ^- / NO ₃ ^- contenuto nella soluzione. Perché NO stimola solubili della guanilato ciclasi per la produzione di guanosina monofosfato ciclico (cGMP) ^6, il livello di cGMP cellulare è stato anche determinato a stimare il rilascio di NO ^7. Anche in questo caso, si tratta di una stima indiretta e non può essere specifica, dal momento che alcuni fattori endotelio-derivati ​​come il C-peptide natriuretico di tipo (CNP) potrebbe anche aumentare i livelli di cGMP attraverso l'attivazione di particolato guanilato ciclasi ^8. NO è prodotto da L-arginina con generazione di L-citrullina come sottoprodotto ^9, misura della produzione di L-citrullina è quindi utilizzato anche come un metodo indiretto per stimare la produzione di NO. I principali svantaggi di questo metodo sono che è radioattivo e non misura i livelli di NO bioattivi, dal momento che NO Liberatoria potrebbe essere rapidamente inattivato da O ₂ ^.-; Inoltre, L-citrullina può essere riciclato a L-arginina ^10. Altri metodi chimici come il rilevamento chemiluminescenza ^11, risonanza di spin elettronico ^12, o porfirinico elettrochimico NO sensore ¹³ sono utilizzati da molti ricercatori. Questi metodi non sono di solito facile in funzionamento, le procedure di rilevamento e richiedono attrezzature speciali. E 'anche ricordare che molti studi si applicano esperimenti bagno per organi con i vasi sanguigni isolati con o senza l'endotelio per valutare la funzione endoteliale e indirettamente misura non mediata rilassamenti vascolare endotelio-derivati. Tuttavia, questo metodo, anche se è principalmente vicino alla situazione fisiologica, ma strettamente a dire, non misura NO funzione, piuttosto valuta endotelio-mediata risposte vasomotorie in generale che riflettono effetti netti della funzione eNOS, produzione di altri derivazione endoteliale rilassante fattori e fattori contraenti endotelio-derivati, la produzione di O ₂ ^.-, e anche le risposte delle cellule muscolari liscea questi fattori. Un'analisi specifica della funzione eNOS e la produzione di NO è di solito necessario ^3.

Molti gruppi di ricerca hanno compreso il nostro, negli ultimi anni ha usato il metodo colorante fluorescente per rilevare la produzione intracellulare di NO ^14-19. In questo metodo è stato utilizzato il cellulare spia permeabile fluorescenza diaminofluorescein-2 diacetato (DAF-2DA) per misurare la libera funzione NO e NOS in cellule e tessuti in vitro o ex vivo vivente. Il principio è che nelle cellule viventi, DAF-2DA è deacetilata da esterasi intracellulare di non fluorescente 4,5-diaminofluorescein (DAF-2) che è stato poi convertito in fluorescente DAF-2 triazolo (DAF-2T) reagendo con NO . La fluorescenza da DAF-2T può essere osservata sotto un microscopio a fluorescenza o un microscopio confocale a fluorescenza ^14. L'intensità della fluorescenza intracellulare riflette quindi la produzione NO intracellulare nelle cellule o dell'endotelio di un intatto in vesse sanguel. In combinazione con uno specifico colorante fluorescente come dihydroethidium (DHE), si può valutare contemporaneamente intracellulare NO e O ₂ ^.- generazione nelle cellule o nei vasi sanguigni ^14. Analogamente, DHE è anche un composto cellula-permeabile che viene ossidato da O ₂ ^.- all'interno delle cellule, e il prodotto ossidativo poi intercala con acidi nucleici per emettere un colore rosso vivo rilevabile quantitativamente mediante microscopio a fluorescenza o microscopio a fluorescenza confocale. DHE è un colorante molto specifica per il rilevamento di O ₂ ^.- da campioni biologici, in quanto rileva essenzialmente radicali superossido, viene mantenuto bene da cellule, e può anche tollerare fissaggio lieve ^20. Uno dei vantaggi di questo metodo colorante fluorescente è che rileva e visualizza NO e / o O ₂ ^.- en face direttamente sullo strato endoteliale intatto di un vaso sanguigno vivente.

In questo documento,descriviamo questo metodo colorante fluorescente per rilevare NO e O ₂ ^.- che abbiamo adattato per en face detection di NO e O ₂ ^.- in aorte intatte di un modello murino di obesità indotta da alto contenuto di grassi, la dieta (HFD) di alimentazione. Abbiamo dimostrato che questo metodo potrebbe con successo e in modo affidabile misurare NO e O ₂ ^.- livelli e valutare la funzione eNOS (dis) nello strato endoteliale di appena isolate aorte intatte mouse in obesità.

lavoro Animal è stato approvato dal Comitato Etico del veterinario di Friburgo, in Svizzera. Il protocollo segue le linee guida sulla cura degli animali e la sperimentazione presso il nostro istituto.

1. Preparazione di un set-up per l'incubazione di isolato arterie

1. Costruire un sistema di bagno per organi che può essere riscaldato a 37 ° C e aerato con 95% O ₂ e 5% CO ₂ da un serbatoio di carbonio.
2. Preparare quanto tampone bicarbonato di Krebs-Ringer, se necessario con la concentrazione della seguente composizione: (118 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 2,5 mM CaCl _2, 1.2 mM MgSO _4, 1,2 mM KH ₂ PO _4, 25 mM NaHCO _3, 0,026 mM EDTA, e 11,1 mm D-glucosio).
3. Mantenere la scorta su ghiaccio e aerare il buffer con il 95% O ₂ e il 5% di CO _2.
4. Accendere il sistema bagno per organi, impostare la temperatura a 37 ° C, aggiungere 5 ml del tampone pronte all'uso per ciascuna camerae mantenere aerare il buffer con 95% O ₂ e 5% CO _2.
5. Lavare le camere una volta con tampone Krebs-Ringer per 30 min.
6. Aggiungere 5 ml di Krebs-Ringer buffer per ciascuna camera e coprire la camera per evitare l'evaporazione.

2. Isolamento di mouse aorte

1. Iniettare pentobarbital che viene sciolto in 0,9% NaCl intraperitoneale alla concentrazione di 150 mg / kg di sacrificare i topi.
2. Posare il mouse supinamente su una tavola chirurgica.
3. Spruzzare la pelliccia della regione toracica con il 70% di etanolo a fini di sanificazione e umidità.
4. cavità aperta petto da taglio intorno al costola per esporre il cuore ei polmoni, e rimuovere i polmoni.
5. Rimuovere il sangue nella cavità toracica delicatamente con un fazzoletto di carta.
6. Afferrare cuore delicatamente con una pinza e staccare l'aorta toracica tagliando il tessuto adiposo perivascolare tra l'aorta e la colonna vertebrale con le forbici chirurgiche.
7. immergere immediatamente il da te tessuti a freddo ghiaccio (4 ° C) tampone Krebs-Ringer.
8. Rimuovere cuore e l'arco aortico sotto un microscopio di dissezione e mantenere il segmento aortico toracico nel buffer.
9. Sezionare l'aorta libera di aderire il tessuto perivascolare al microscopio con le forbici e pinze chirurgiche.
10. Afferrare il bordo fine dell'aorta con una pinza, e lavare via il sangue nel lume vascolare da vampate di calore delicatamente tampone Krebs-Ringer con un 26 G × 1 / 2" siringa.
11. Tagliare gli anelli aortici puliti in segmenti lunghi 3 mm.
    Nota: Prestare attenzione a questo passaggio per non danneggiare strato endoteliale.

3. DHE e DAF-2DA colorazione

1. Trasferire i segmenti aortici puliti con una pinza verso le camere di bagno per organi pieni di Krebs-Ringer tampone a 37 ° C aerato con 95% O ₂ e 5% CO _2.
   Nota: toccare solo il lato avventiziale degli anelli aortici con una pinza e non bloccare il bvasi lood.
2. Equilibrare le arterie nella camera vasca organo per 30 min.
3. Aggiungere acetilcolina (ACh) al bagno per organi alla concentrazione finale 1 mM, e incubare le arterie per 10 min.
4. Preparare 1 ml di soluzione DHE / DAF-2DA (5 micron di ogni colorante, diluito da 1.000 × magazzino) con pre-riscaldato tampone Krebs-Ringer in 1,5 ml provetta. Avvolgere la provetta con un foglio di alluminio per evitare l'esposizione alla luce.
5. Dopo la stimolazione, trasferire gli anelli aortici da bagno per organi alla soluzione DHE / DAF-2DA in una provetta a 37 ° C aerato con 95% O ₂ e 5% di CO ₂ e incubare gli anelli aortici per 30 min.
   Nota: Da questo punto, tenere le aorte sempre nel buio.
6. Trasferire gli anelli aortici ad una nuova provetta con tampone Krebs-Ringer per il lavaggio e ripetere il lavaggio tre volte entro 1 min.
7. Trasferire gli anelli aortici alla soluzione di paraformaldeide al 4% per il fissaggio per il 30min.
8. Preparare 1 ml 4 ', 6-soluzione diamidino-2-phenylindole (DAPI) (300 Nm, diluito da 1.000 × magazzino) con tampone fosfato (PBS) in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Controcolorare le aorte per 3 min.
9. Trasferire i aorte alla nuova provetta con tampone PBS per il lavaggio per 1 min. Ripetere il lavaggio tre volte.
   Nota: Fare attenzione a non bloccare gli anelli aortici o danneggiare lo strato endoteliale.

4. En Face di montaggio

1. Aggiungere una goccia di mezzo di montaggio alla diapositiva.
2. Tagliare gli anelli aortici longitudinalmente con le forbici microchirurgia al microscopio, apportare le aorte arrotolati piatta e montarlo en face sul mezzo di montaggio con l'endotelio rivolto verso il basso sul vetrino. Non spostare le aorte avanti e indietro.
3. Coprire il vetrino con copertura di slittamento e sigillare il vetrino con smalto.
4. Dopo l'essiccazione aria sotto protezione dalla luce, utilizzare gli scivoli per l'imaging directly entro poche ore o conservarli a -20 ° C per i prossimi giorni.

5. confocale microscopico Imaging

1. Utilizzare un microscopio confocale per rilevare i segnali di fluorescenza. Accendere la macchina e ottimizzare le impostazioni di imaging, come l'ingrandimento, la velocità di scansione, la risoluzione, Z-stack.
   1. Per questo protocollo, utilizzare un 200 Hz velocità di scansione, risoluzione di 1.024 × 1.024 pixel e la dimensione Z-passo di 0,25 micron. Eccitare la fluorescenza da DAF-2DA con 488 nm laser ad argon e rilevare a 515 nm, mentre eccitare la fluorescenza da DHE a 514 nm e rilevare a 605 nm di emissione.
2. Utilizzare 10X ingrandimenti di concentrarsi sul campione fino a quando il segnale è chiaro DAPI con raggi ultravioletti, e quindi regolare l'obiettivo a 40x ingrandimenti.
3. Definire l'intervallo dello strato endoteliale regolando la posizione Z sul pannello di controllo. I segnali di nuclei DAPI macchiati sono punti ovale o rotonda nello strato endoteliale.
4. Scansione dall'alto(Strato endoteliale sul confine lume) del campione attraverso l'intero spessore di immagini segnale e registrare endoteliali. Scegli almeno 3 campi diversi per la scansione di ogni campione.

6. Analisi di Immagini

1. Utilizzare il software per aprire i dati acquisiti al microscopio confocale. Scegliere tre immagini consecutive per campo per l'analisi e la valutazione di almeno 3 diversi campi per campione. Esportare le immagini scelte e salvarle come file JPEG.
2. Quantificare le immagini da DAF-2DA, DHE e colorazione DAPI con il software di elaborazione delle immagini. Per l'immagine dalla colorazione DAPI, scegliere 'Plugin' → 'analizzare' → 'cellulare Contatore' per contare il numero di DAPI nucleo positivo.
   1. Per le immagini da DAF-2DA e DHE colorazione, scegliere 'Analizza' → 'Misura' per analizzare l'intensità dei segnali, e prendere il valore 'medio', come l'intensità del segnale relativo. Presenti poi i risultati come il rapporto tra DAF-2DA pernuclei positivi DAPI o il rapporto di DHE per DAPI. Per ogni campione, prendere il valore medio di ogni immagine e campo.
3. Dividere il risultato di ogni campione per la media del gruppo di controllo per ottenere il cambiamento piega. L'analisi statistica è stata effettuata con test t di Student spaiato o ANOVA con Dunnett o Bonferroni post-test. Dare dati come media ± SEM. Considerate le differenze di valori medi, come significativa a p <0.05 ^14.

L'obesità è un importante fattore di rischio di malattia coronarica ischemica ed è associata a diminuzione endoteliale NO biodisponibilità, un segno distintivo della malattia vascolare aterosclerotica ^21. eNOS-disaccoppiamento ha dimostrato di essere un importante meccanismo di disfunzione endoteliale in numerose condizioni fisiologiche e patologiche inclusi anziani ^22, arteriosclerosi, l'obesità e ^14. Pertanto, qui mettiamo a confronto i topi magri e obesi per mostrare il risultato rappresentante del NO e O ₂ ^.- livelli nelle aorte.

A partire all'età di 7 settimane, i topi maschi (C57BL / 6J) hanno avuto accesso gratuito durante 14 settimane, o un chow normale (NC; contenuto energetico: il grasso del 10,6%, di proteine ​​del 27,6%, e il 57% di carboidrati, fibre 4,8% ) o di una dieta ricca di grassi (HFD, contenuto energetico: 55% di grassi, proteine ​​21%, e il 24% di carboidrati). Dopo 14 settimane di topi HFD eranosacrificati e aorte toraciche sono stati sezionati, puliti e dei tessuti aderenti. Prima di DAF-2DA e DHE colorazione passo, le eNOS inibitore LN ^G -Nitroarginine metil estere (L-NAME) (1 mm) è stato aggiunto alla camera da bagno per 1 ora per bloccare l'attività eNOS ^14. I risultati rappresentativi confocale a fluorescenza sono stati mostrati in Figura 1. Il colore blu nel pannello superiore rappresenta il nucleo delle cellule endoteliali colorati con DAPI. Nel pannello centrale, il colore verde è il segnale di fluorescenza da DAF-2T convertito dal DAF-2 non fluorescente da NO, che significa che se l'intensità del segnale verde è superiore, ci sono più NO nelle cellule. Analogamente, il colore rosso nel pannello inferiore è il segnale di fluorescenza da DHE ossidato O ₂ ^.-, quindi il campione mostra il colore più rosso ha più O ₂ ^.- nelle cellule.

Confocale microscopia a fluorescenza rivelato diminuzioned produzione di NO (DAF-2DA colorazione) e aumento sensibile O _L-NAME-2 ^.- generazione (DHE colorazione) nello strato endoteliale aortico di topi alimentati HFD rispetto a quello dei topi alimentati NC (Figura 1) ^14, suggerendo eNOS-disaccoppiamento in obesità. I segnali sono stati quantificati e presentati nei grafici a barre ^14.

Figura 1. eNOS-disaccoppiamento in obesità. Microscopico confocale en face detection di NO e O ₂ ^.- rispettivamente DAF-2DA e DHE colorazione,. n = 5; *** p <0,005 vs NC; ^††† p <0.005 vs gruppo HFD. Barra di scala = 0.1 mm. (I dati sono stati da riferimento ¹⁴⁾ Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Rilevazione di NO o O ₂ ^.- con coloranti fluorescenti è stato spesso usato in molti studi in cellule endoteliali in coltura e anche in tessuto criosezioni ^23. Qui abbiamo esteso questo metodo per i vasi sanguigni di vita intatto, vale a dire, en face detection di NO e O ₂ ^.- livelli nello strato endoteliale con rispettivamente DAF-2DA e DHE, che è efficace, relativamente semplice, e intuitivo. In confronto con il metodo criosezioni vascolari, questo metodo mostra bassa inferiore ed è più quantitativa, poiché le fibre elastiche nei mezzi di un'arteria particolare l'aorta nelle criosezioni danno molto forti segnali di autofluorescenza che potrebbero interferire con la specifica NO o O ^{_2. -} segnali generati in cellule endoteliali. Inoltre, specifica O ₂ ^.- generazione del NADPH ossidasi o altri enzimi nelle cellule muscolari lisce mediale potrebbero interferirecon i segnali nelle cellule endoteliali nella sezione vascolare, che rappresenta lo svantaggio del metodo con criosezioni vascolari. Al contrario, il metodo di colorazione faccia en rileva i segnali specificamente dallo strato endoteliale di un segmento di vaso sanguigno intatto e dà quindi un'analisi più precisa. Una macchina per la preparazione del criostato cryosection è anche un investimento costoso. Rispetto ad altri metodi biochimici, il principale limite di questo metodo è meno quantitativa, ma è una buona scelta per confronto relativo tra i campioni. Inoltre, l'esigenza di un microscopio confocale che è costosa può anche essere una limitazione di questo metodo. Il sistema camerale multi-organo è conveniente e se questo non è disponibile in laboratorio, si può facilmente stabilire un sistema con bagno di acqua e tubi che sono collegati ad un serbatoio di gas carbonio con sistema di regolazione, in modo che i vasi sanguigni nei tubi sono mantenuta a 37 ° C e aerato con 95% O ₂ e 5% CO _2.

Ci sono diversi passaggi critici che si deve prestare attenzione. Assicurarsi che il tessuto perivascolare viene pulito per un facile montaggio. I coaguli di sangue nel lume vascolare devono essere spazzati via, perché possono causare segnali artificiali e interferire con i segnali di fluorescenza. Durante l'intera procedura di preparazione dei vasi sanguigni, incubazione, lavaggio, taglio e il montaggio, si deve essere estremamente attenzione a non danneggiare lo strato endoteliale dei vasi sanguigni. Non lasciate che il vaso sanguigno secca durante l'intera procedura di preparazione. DHE e DAF-2DA sono entrambe le sonde fluorescenti, così a partire dalla fase di colorazione delle aorte devono essere sempre protetti da esposizione alla luce. Prima del fissaggio intensificare le cellule endoteliali di aorta devono essere vivi, così le aorte devono sempre essere tenuti in buffer Krebs-Ringer aerato con 95% O ₂ e 5% CO _2. Immagini dei campioni devono essere prese il più presto possibile dopo la preparazione. la fluorescenzasegnale nce diventerà più debole in pochi giorni, anche con la protezione di mezzo di montaggio, che possono influenzare l'accuratezza dei risultati. Il metodo non può essere applicata per i vasi sanguigni con la parete vascolare troppo spessa.

Questo metodo consente immaginazione simultanea di NO e O ₂ ^.- produzione nello strato endoteliale dei vasi sanguigni intatti, se sono stati aggiunti i due coloranti ai vasi sanguigni insieme. Si può anche utilizzare questo metodo per valutare gli effetti farmacologici dei farmaci su NO e O ₂ ^.- produzione in vitro nei vasi sanguigni isolati. A questo scopo, l'aorta pulita di solito è tagliato in due parti, una è per il controllo e un altro è per il trattamento farmacologico, e il farmaco deve essere aggiunto al buffer di incubazione dopo equilibrazione prima DAF-2DA e DHE della colorazione. E 'particolarmente utile, se questo metodo viene utilizzato insieme a un altro metodo, ad esempio, con l'analisi delle risposte vasomotori di sangue isolato vessels, una funzione fisiologica di cellule endoteliali può essere confermata. Questo metodo è adatto anche per l'analisi di qualsiasi funzione endoteliale (dis) nei vasi sanguigni intatti di modelli di malattia e dei meccanismi sottostanti.

In sintesi, abbiamo presentato un semplice protocollo per rilevare simultaneamente NO e O ₂ ^.- produzione nello strato endoteliale dei vasi sanguigni intatti con un microscopio a fluorescenza confocale. Mostriamo come questo metodo ha funzionato con successo nel modello murino di obesità. Questo metodo è una tecnica utile nelle indagini endoteliale NO e O ₂ ^.- produzione in molte condizioni di malattia vascolare.

No conflicts of interest declared.

This work was supported by the Swiss National Science Foundation (310030_141070/1), Swiss Heart Foundation, and National Center of Competence in Research (NCCR-Kidney.CH) Switzerland. Yu Yi is supported by the Chinese Scholarship Council.