Analisi quantitativa di espressione della proteina per studiare Lineage specifica nel topo preimpianto embrioni

Questo protocollo presenta un metodo per eseguire quantitativa, cella singola analisi in situ di espressione della proteina per studiare specifiche lignaggio in embrioni di topo preimpianto. Le procedure necessarie per la raccolta di blastocisti, tutto il montaggio di rilevamento di immunofluorescenza di proteine, l'imaging di campioni su un microscopio confocale, e la segmentazione nucleare e l'analisi delle immagini sono descritte.

Questo protocollo presenta un metodo per eseguire quantitativa, monocellulari in situ analisi dell'espressione della proteina per studiare specifica lineage in embrioni di topo preimpianto. sono descritte le procedure necessarie per la raccolta degli embrioni, immunofluorescenza, imaging su un microscopio confocale, e la segmentazione di immagine e di analisi. Questo metodo consente la quantificazione dell'espressione dei diversi marcatori nucleari e spaziali (XYZ) coordina tutte le cellule nell'embrione. Si avvale di minuti, uno strumento software per la segmentazione di immagini appositamente sviluppato per l'analisi di immagini confocale di embrioni preimpianto e colonie di cellule staminali embrionali (ESC). MINS svolge segmentazione nucleare senza supervisione di tutti i X, Y e Z dimensioni, e produce le informazioni sulla posizione della cella in uno spazio tridimensionale, così come i livelli di fluorescenza nucleari per tutti i canali con input dell'utente minima. Mentre questo protocollo è stato ottimizzato per l'analisi di immaginidi preimpianto embrioni fase di topo, può essere facilmente adattato per l'analisi di altri campioni che presentano un buon rapporto segnale-rumore e dove ad alta densità nucleare pone un ostacolo alla segmentazione dell'immagine (ad es., analisi di espressione di cellule staminali embrionali (ESC ) colonie, differenziando cellule in coltura, gli embrioni di altre specie o stadi, ecc.)

L'embrione di topo preimpianto è un paradigma per studiare la formazione e il mantenimento della pluripotenza in vivo, così come un modello per lo studio della determinazione del fato cellulare e de novo epitelizzazione nei mammiferi. Le fasi preimpianto dello sviluppo dei mammiferi sono dedicati alla creazione di tre linee cellulari che compongono la blastocisti, vale a dire la epiblasto pluripotente - che dà luogo alla maggior parte dei tessuti somatici e le cellule germinali - e due linee extraembrionali, il trophectoderm (TE) e la endoderma primitivo (PRE) (Figura 1A) ^1,2. Questo protocollo descrive le procedure per (1) embrioni raccolta e fissare fase preimpianto del mouse, (2) eseguire immunofluorescenza per etichettare le proteine ​​di interesse, (3) effettuare tutto il montaggio di immagini utilizzando un microscopio confocale con funzionalità di z-sezionamento e (4) eseguire la segmentazione nucleare di immagini confocale e analisi successive immagine quantitativa. Questo gasdotto permette tegli imparziali misurazione dei livelli di proteine ​​per l'assegnazione delle identità cellulari per caratterizzare le sottopopolazioni di cellule in situ. Questo protocollo può essere eseguito in meno di 3 - 4 giorni per una singola cucciolata (generalmente fino a 10 embrioni di topo), dalla raccolta embrione per l'analisi dei dati (Figura 1B). L'analisi simultanea di più cucciolate aumenterebbe l'imaging e analisi di dati in tempo onere, estendendo così la lunghezza complessiva del protocollo.

L'embrione preimpianto fase del mouse è un sistema sperimentale trattabili che, data la sua piccola dimensione e morfologia stereotipata ^3, è adatto per l'imaging in toto di processi cellulari con risoluzione di una singola cellula. Per effettuare un imparziale, analisi a livello di sistema di un numero statisticamente rilevante di embrioni, un sistema automatico, pipeline di analisi quantitativa è desiderabile. Tuttavia, a causa della elevata densità nucleare della massa cellulare interna (ICM) della blastocisti ( Figura 1A, 2D), piattaforme immagine segmentazione convenzionali non riescono a fornire una sufficiente precisione per stabilire un flusso di lavoro automatizzato o semi-automatizzato. D'altra parte, la segmentazione manuale, mentre accurate, non consente l'elaborazione di grandi coorti di cellule ed embrioni, né è adeguato riproducibile, determinazione imparziale delle identità cellulari - che è particolarmente importante quando si studiano stadi di sviluppo in cui i modelli di marcatore espressione non ha completamente risolto (ad esempio, non presentano una distribuzione binaria in una popolazione). Abbiamo recentemente sviluppato e validato un metodo di segmentazione delle immagini su misura per gli embrioni palco del mouse preimpianto e per le cellule staminali embrionali di topo (CES), che raggiunge un'elevata accuratezza, mentre richiede un input minimo dell'utente ^4-8.

Il gasdotto analisi presentata qui ruota attorno lo strumento segmentazione delle immagini MATLAB a base modulare interattivo Segmentazione Nucleare (minuti) ^4. MIN performs segmentazione nucleare senza supervisione su grandi lotti di confocale Z-stack dopo che l'utente ha stabilito un numero minimo di proprietà dell'immagine, utilizzando un'interfaccia utente grafica (GUI) (Tabella 1) ^4. Questo oleodotto si è dimostrato efficace per la generazione di dati ad alto rendimento sulla espressione di proteine ​​e localizzazione cellulare in entrambi wild-type, sperimentalmente trattati e gli embrioni e CES ^5-7 geneticamente modificati. Nel presente protocollo, si descrive l'applicazione di minuti alla segmentazione di immagini dell'embrione preimpianto stadio. Per esempi di prestazioni minuti sul CES si rimanda al ^4,7. La fase di segmentazione nucleare automatizzato riduce notevolmente l'onere tempo del processo di identificazione delle cellule, mentre le misure di intensità spaziale e fluorescenza consentono una determinazione imparziale delle identità delle cellule e la generazione di mappe tridimensionali di domini di espressione genica e la posizione delle cellule nell'embrione (Figura 1C ). Inoltre, la scalabilità di questo flusso di lavoro rende applicabile all'analisi dei singoli cucciolate attraverso grandi coorti di embrioni trattati sperimentalmente, o embrioni di diverso background genetico ^5,6. Minuti è liberamente disponibile presso http://katlab-tools.org (il software richiede una licenza MATLAB).

Nessun approccio sviluppato fino ad oggi consente la generazione di tali dati in modo approfondito l'espressione proteica e la localizzazione delle cellule in embrioni di topo preimpianto. Tutti i tentativi finora a quantificare questi tipi di dati sono stati limitati alla determinazione manuale e quantificare la presenza di numeri di cellulare per le diverse popolazioni nell'embrione (o interamente a mano, o software-assistita) ^9-19. Questo approccio (che incorpora il software minuti) è stata adattata per e testato su embrioni preimpianto mouse e CES; tuttavia la sua prestazione su altri sistemi con elevata densità nucleare, anche se ancora sottoposti a verifica, dovrebbe essere equivalente.

Etica dichiarazione: Tutti i lavori animale, compreso l'allevamento, l'allevamento e il sacrificio è stato approvato dal Comitato Memorial Sloan Kettering Cancer del Centro Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC), il protocollo # 03-12-017.

1. Embrione Collection

Nota: Tutti i lavori animale deve essere stato approvato dalle autorità istituzionali e locali e conformi alle norme locali e istituzionali.

1. Mate un topo femmina vergine con un perno maschio fertile dei genotipi desiderati.
   Nota: Se la creazione di accoppiamenti naturali, selezionando le femmine in fase di estro del ciclo Estral aumenta le possibilità di accoppiamento alla data desiderata. Se inducendo superovulazione, consultare i protocolli descritti nelle ^20.
2. Controllare la presenza di un tappo vaginale al mattino usando una sonda smussato. Idealmente, farlo prima di mezzogiorno (12:00), come tappi di copulazione si perdono per tutta la giornata. Considerare noon di rilevazione della spina vaginale giorno embrionale (E) 0,5.
3. Il giorno e l'ora dello sviluppo embrionale desiderato, riscaldare M2 o vampate di calore tenendo medio (FHM) per RT o, preferibilmente, 37 ° C. Nota: Sia M2 o FHM può essere utilizzato per il lavaggio ed embrioni di movimentazione. Quando non in uso, conservare questi mezzi di comunicazione a 4 ° C. Stima l'uso di ~ 2 ml di terreno per ogni utero.
4. Scongelare congelato 4% paraformaldeide (PFA) in tampone fosfato (PBS) o preparare una soluzione fresca. Stima 500 ml di soluzione al 4% PFA per pozzetto di una piastra 4-pozzetti. Fissare un disordine su ciascun pozzetto di una piastra 4-pozzetti. Nota: In alternativa, una piastra a 96 pozzetti può essere utilizzato per fissare e embrioni negozio. Se si utilizza una piastra a 96 pozzetti, utilizzare 100 ml di soluzione di PFA per pozzetto.
5. Tirare una pipetta Pasteur di vetro utilizzando una fiamma aperta per disegnare un fine capillare sulla punta.
6. Sacrifice femminile da dislocazione cervicale o CO ₂ inalazione, o come richiesto dalle normative locali e istituzionali. Spesso è desirable per confermare l'eutanasia dell'animale da dislocazione cervicale.
7. Spruzzare ventre dell'animale con il 70% di etanolo per minimizzare capelli spargimento ed eseguire un'incisione addominale, prima attraverso la pelle e successivamente attraverso la parete del corpo (peritoneo) per esporre la visceri.
   Nota: I passi seguenti descrivono la procedura per raccogliere blastocisti dal nell'utero di un topo femmina incinta in qualsiasi momento tra il E3.25 e E4.5 (Figura 1A). Per i protocolli sulla raccolta degli embrioni preimpianto precedenti a E3.25, fare riferimento a ^20.
8. Individuare l'utero e rimuovere dall'animale. Tenendo la fine della cervice dell'utero, con un paio di pinze, tagliare il collo dell'utero e tirare delicatamente per allungare entrambe le corna uterine.
9. Tagliare il grasso dall'utero, facendo attenzione a non forare la parete uterina. Questo può essere fatto facilmente al momento della rimozione, mentre ancora attaccato al corpo dell'animale, come l'utero può essere stesa. In alternativa,può essere fatto successivamente, sotto un microscopio di dissezione, in RT PBS. Per un protocollo più dettagliate sulla dissezione dell'utero, vedere Protocolli 5 e 8 ²⁰
10. Taglio sopra il ovidotti, al di sotto delle ovaie, per liberare l'intero utero, posto in una capsula di Petri e coprire con PBS.
    Nota: Questo passaggio consente anche il lavaggio del sangue in eccesso o altri residui dall'utero, che facilita la successiva raccolta di blastocisti.
11. corna separati sia uterine tagliando attraverso l'estremità prossimale, su entrambi i lati della cervice e scartare la cervice. Separare ogni ovidotto dall'utero tagliando sotto l'istmo che li (Figura 1A) collega. Trasferire entrambe le corna ad un calo di mezzo di manipolazione (sia M2 o FHM) per la raccolta degli embrioni e la manipolazione.
12. Sotto un microscopio dissezione, blastocisti scovare dell'utero e nel mezzo forzando 0,5 - 1 ml di M2 o FHM attraverso ogni corno uterino dall'apertura cervicale. Utilizzare un 1siringa ml con un ago ipodermico. Nota: L'ago può essere smussato usando una pietra deposito per evitare di strappare la uteri, anche se questo non è critica. Uno schema dettagliato per lavaggio uterina può essere trovato in ^21.
13. Utilizzando il microscopio dissezione, individuare le blastocisti, che saranno sparsi per tutta la goccia di medium. Consentire fino a 1 - 2 min per blastocisti a depositarsi sul fondo del piatto dopo il lavaggio. Utilizzando il vetro pipetta Pasteur bocca controllato con un finale capillare, raccogliere tutte le blastocisti e trasferimento in una nuova goccia di media.
14. Risciacquare blastocisti spostandoli attraverso 2 - 3 gocce di M2 fresco o di FHM. Spostare gli embrioni in gruppi di 5 - 10 blastocisti alla volta.
    Nota: Lo spostamento grandi gruppi in qualsiasi momento potrà accelerare il processo, ma sarà anche aumentare le probabilità di perdere accidentalmente molti embrioni. Se non addestrato nell'uso di pipette bocca-controllato, a praticare la manipolazione degli embrioni e il trasferimento dovrebbe essere considerato prima di Beginning l'esperimento.
15. Rimuovere la zona pellucida (ZP) da blastocisti non schiuse (generalmente
16. Fare attenzione quando si maneggiano blastocisti spogli, che aderiscano molto facilmente alle superfici in vetro e plastica. media Manipolazione contiene 4 mg / ml di albumina sierica bovina (BSA) per prevenire la fissazione, ma l'acido Tyrode del o PBS non, quindi, di ridurre il rischio di danni o perdita degli embrioni non si solleva più di 2 - 5 blastocisti denudati in un momento in cui la loro manipolazione in BSA-libero o senza siero PBS o acido Tyrode di.
    Nota: In alternativa, rivestire la pipetta di vetro con 1% BSA prima dell'uso per ridurre l'aderenza degli embrioni alla superficie del vetro.

2. immunofluorescenza

1. Eseguire immunofluorescenza utilizzando qualsiasi protocollo che è stato precedentemente testato e dimostrato di essere affidabile per tutto il montaggio immunofluorescenza. Nota: Si consiglia di quelli descritti in ^{22 e 11.} Nel presente articolo l'ex verrà descritta. Qualunque sia il metodo di scelta, sia costante durante gli esperimenti equivalenti per facilitare il confronto dei risultati di colorazione.
2. Utilizzare un flessibile, polivinile, chiaro, piastra a 96 pozzetti U-bottom per eseguire le fasi sequenziali del protocollo immunofluorescenza. Riempire ogni pozzetto con 50 - 100 ml di soluzione e spostare gli embrioni da una soluzioneall'altro tramite una bocca pipetta a forma di L. Nota Questo approccio minimizza l'uso di reagenti e facilita passi monitoraggio e la colorazione in parallelo di più gruppi sperimentali.
   1. Opzionale: Rivestire il fondo dei pozzetti con un sottile strato di 1% agar, 0.9% NaCl per impedire l'adesione di embrioni alla plastica. Non aggiungere BSA a soluzioni di immunofluorescenza.
3. Preparare PBX (0,1% Triton X-100 in PBS). Se anticipando l'esecuzione di vari esperimenti di immunofluorescenza, preparare 50 ml di PBX e conservare a 4 ° C tra esperimenti.
4. Preparare la soluzione permeabilizzazione (0,5% Triton X-100, 100mM glicina in PBS). Fare 1 ml (o qualsiasi quantità necessaria) di soluzione permeabilizzazione fresco per ogni esperimento.
5. Preparare soluzione bloccante (siero 2% di cavallo (HS) o il 20% di siero fetale bovino (FBS) con Pen-Strep in PBS). Preparare 10 ml e conservare a 4 ° C tra esperimenti.
   1. Non sono state osservate differenze tra i duetipo di siero, tuttavia, essere coerente nella scelta della soluzione bloccante utilizzato per esperimenti equivalenti.
6. Risciacquare embrioni fissati per 5 minuti a temperatura ambiente a PBX (~ 100 ml).
7. Permeabilize embrioni per 5 minuti a temperatura ambiente in una soluzione di permeabilizzazione (~ 100 ml).
8. Risciacquare embrioni per 5 minuti a temperatura ambiente a PBX (~ 100 ml).
9. embrioni di blocco per 30 minuti a 1 ora a temperatura ambiente in ~ 100 ml di soluzione bloccante. Coprire la soluzione con uno strato di olio minerale per prevenire l'evaporazione o restare in una camera umidificata.
   Nota: Gli embrioni possono essere bloccati per un massimo di O / N periodi a 4 ° C, senza notevole miglioramento o pregiudizio rispetto a 30 min passaggi di blocco.
10. Incubare gli embrioni O / N a 4 ° C in anticorpo primario / anticorpi diluito in soluzione bloccante (~ 100 ml). Coprire la soluzione con uno strato di olio minerale per prevenire l'evaporazione o restare in una camera umidificata.
    1. Determinare diluizione ottimale per ogni anticorpo primario anticipo. Vedi dsezione ISCUSSIONE e Materiali per diluizioni testati di una serie di anticorpi.
11. Dopo O / N di incubazione, lavare gli embrioni 3x per 5 minuti ciascuno a RT a PBX (~ 100 ml).
12. embrioni di blocco per 30 minuti a 1 ora a temperatura ambiente in ~ 100 ml di soluzione bloccante. Coprire la soluzione con uno strato di olio minerale per prevenire l'evaporazione o restare in una camera umidificata.
13. Incubare gli embrioni per 1 o 2 ore a 4 ° C in anticorpo secondario / anticorpi diluito al 4 mg / ml a ~ 100 ml di soluzione bloccante. Coprire la soluzione con uno strato di olio minerale per prevenire l'evaporazione o restare in una camera umidificata.
14. Risciacquare embrioni 2x per 5 minuti ciascuno a RT in PBX.
15. Spostare gli embrioni a macchia DNA preferito. Se si utilizza Hoechst 33342, diluire a 5 mg / ml in PBS. Coprire la soluzione con uno strato di olio minerale per prevenire l'evaporazione o restare in una camera umidificata.
    Nota: Punto Pausa: se gli embrioni non vengono ripreso immediatamente, possono essere conservati per up per diverse settimane in soluzione colorazione nucleare. In questo caso, assicurarsi PBS è sterile e / o aggiungere Pen-Strep o sodio azide per prevenire la crescita batterica e la contaminazione.

3. Confocale Imaging

Nota: I singoli configurazioni microscopio confocale richiedono specifici parametri di acquisizione da regolare per il sistema e software sul posto. Tuttavia, la sezione seguente fornisce una serie di regole generali da seguire che dovrebbe essere applicabile a qualsiasi installazione.

1. Usando una pipetta bocca fine, fare microgocce di PBS o soluzione nucleare macchia sulla superficie di vetro di un piatto fondo di vetro 35mm e coprire con olio minerale. In alternativa, utilizzare un vetrino regolare con separatori di silicone per evitare di danneggiare gli embrioni e coprire con un vetrino da microscopio in vetro. Nota: Quando si utilizza un vetrino regolare, gli embrioni non possono essere successivamente ri-posizionati o recuperati per la genotipizzazione, pertanto si consiglia vivamente l'uso di fondo di vetropiatti.
2. Inserire embrioni nelle microgocce e organizzare in modo coerente, preferibilmente con l'ICM cavità asse parallelo alla superficie del vetro. Impostare piatto sul supporto del microscopio. Nota: Le immagini ottenute sulla scansione laser confocale soffrono di una perdita Z asse-associato di intensità di fluorescenza. Pertanto, la coerenza nella disposizione è importante per comparare le intensità tra le regioni equivalenti sui diversi embrioni.
3. Impostare i parametri di riferimento che utilizzano embrioni wild-type, che non sono state oggetto di alcun tipo di trattamento che possono alterare l'espressione genica.
   1. Acquisire le immagini utilizzando un obiettivo ad alto ingrandimento (vale a dire, 40X o superiore) al fine di ottenere i dati che faciliteranno la segmentazione accurata utilizzando lo strumento MINUTI ^4.
      Nota: Utilizzando lo zoom digitale su un obiettivo 20X non produrrà immagini di adeguata risoluzione per la segmentazione utilizzando min. Si dovrebbe anche notare la distanza di lavoro (WD) dell'obiettivo, come dovrebbe esseresufficiente a consentire l'acquisizione di un Z-stack che si estende su un intero blastocisti, quindi una lunga WD (~ 130 - 150 pm) obiettivo è di solito necessario. Le immagini mostrate nelle figure 2 - 4 sono stati acquisiti utilizzando un 40X / NA obiettivo ad immersione 1.30 olio con una distanza di lavoro di 210 micron.
   2. Utilizzare l'uscita laser basso che fornisce un forte rapporto segnale-rumore senza sbiancamento fluorofori.
   3. Regolare il guadagno e offset per ottenere la gamma dinamica più ampia senza sovraesporre il campione. Esponendo le immagini per coprire la maggior parte di, o di coprire l'intera gamma di scala di grigi, faciliterà l'individuazione di piccole differenze di intensità tra le immagini.
   4. Usare un piccolo (1 micron) Z-step, dal momento che la risoluzione asse Z è un fattore critico per la segmentazione accurata con min.
      Nota: le dimensioni XY non influenzano il processo di segmentazione nucleari, solo la dimensione del file immagine. In generale, 512 x 512 pixel è una risoluzione XY sufficiente per immagini la pubblicazione di qualità senza compromicantare spazio sul disco rigido.
   5. Passaggio fondamentale: mantenere l'imaging parametri coerenti all'interno e tra le sessioni di imaging dello stesso esperimento, in modo da essere in grado di confrontare i campioni.
4. Imaging lotti di embrioni:
   1. gruppi di un'immagine coerente (cucciolate, esperimenti) in una singola sessione, quando possibile.
   2. Mantenere parametri coerenti all'interno e tra le sessioni di imaging per replicati dello stesso esperimento.
   3. embrioni di immagini in tutto (asse Z intero) per catturare ogni cellula.
      Nota: Se lo si desidera, embrione genotipizzazione può essere effettuata dopo l'imaging come descritto in ^23. La necessità di nested PCR deve essere determinato empiricamente e dipende dal locus da analizzare ed i primer utilizzati.
5. Assicurarsi di essere in grado di abbinare gli embrioni alle immagini in modo retrospettivo.

4. Analisi dell'immagine e dei dati di pre-elaborazione

1. Scaricare e installare MINUTI ⁴ da http: // Katlab-tools.org (licenza MATLAB richiesto).
2. Eseguire la segmentazione di immagini:
   1. Seguire l'interfaccia utente grafica (GUI) di minuti per caricare un immagine confocale o stack dal disco rigido, individuare i nuclei e segmentare l'immagine. Caricare l'intero Z-stack dei dati grezzi generati dal microscopio (.lsm, .lif, .oif, etc.). Vedere la Tabella 2 per i dettagli su ogni passaggio e le istruzioni presenti sulla http://katlab-tools.org e ^4. Una volta completato, visualizzare il risultato di ogni passo facendo clic sul pulsante corrispondente 'Visualizza'. Un tag gialla sopra il pulsante indica il funzionamento in processo, un tag verde indica operazione è stata completata.
      Nota: MINUTI attualmente non supporta i file .czi, .tiff sequenze o file multi-posizione - ogni Z-stack deve essere un file indipendente.
   2. Dopo la segmentazione soddisfacente, salvare la pipeline creato in modo che possa essere utilizzato direttamente per altri embrioni o cucciolate.
3. segmentazione Batch-Mode:
   Nota: Sii file possono essere segmentati ngle singolarmente. Tuttavia, dato che gli embrioni all'interno di una cucciolata o esperimento sono generalmente di fase paragonabile, MINUTI può applicare la pipeline di segmentazione creato per una singola immagine di un gruppo di loro senza supervisione.
   1. Dal menu Batch-Mode Run, fare clic su 'Aggiungi file' e caricare tutti i file da elaborare in una sola volta. Nota: i file da fonti differenti possono essere aggiunti alla coda di segmentazione.
   2. Fai clic su 'Start Batch-Mode Run' e lasciare il tempo per il software per elaborare i file. Nota: L'uscita segmentazione verrà salvato nella stessa directory in cui in cui trovano i file originali.
4. valutazione Segmentazione e correzione manuale
   Nota: min segmenti immagini con precisione molto elevata (> 85%), tuttavia, la qualità della colorazione e di imaging, così come la fase dell'embrione, possono influire sulle prestazioni MIN. Generalmente, maggiore è la densità nucleare all'interno dell'embrione, gli errori di segmentazione più probabilmente avrà place (figure 2D, 3). Pertanto, la precisione di segmentazione dovrebbe essere valutata per ciascun campione e corretto manualmente, se necessario. Due tipi di errori si verificano in genere: un eccesso di segmentazione e sotto-segmentazione.
   1. Risoluzione sovra-segmentazione:
      1. Identificare i falsi positivi - vescicole apoptotici (figura 3A a, b, d, asterischi) o altri elementi che non sono nuclei intatti, ma che potrebbero essere stati identificati come tali da min.
         Nota: Generalmente tali falsi positivi hanno una dimensione più piccola di nuclei reali e possono, nella maggior parte dei casi, essere facilmente identificati e scelti sopra il foglio. Tuttavia, l'esame visivo è fortemente raccomandato, come spesso i nuclei possono essere solo parzialmente segmentati, con un conseguente, ma il volume segmentato valido più piccolo (Figura 3a B, punta di freccia).
      2. Eliminare i record corrispondenti per falsi positivi dal file * statistics.csv. Conserva le statistiche originali *.csv per riferimento futuro e modificare solo una copia di esso.
      3. Se un nucleo è stato over-segmentato e presentato come 2 o più nuclei (Figura 3a C, freccia e punte di freccia), o unire i record facendo la media il loro livello di intensità o, in caso simile, tenere uno dei record per quella cella e scartare il riposo.
   2. Risoluzione sotto-segmentazione:
      1. Identificare eventi in cui MINUTI non è riuscita a rilevare il confine tra due o più nuclei e di conseguenza li segmentato come un singolo nucleo (Figura 3a D, freccia e 3B). Nota: Questo pone un problema per un conteggio di cellule accurata, ma soprattutto, per quantificare i livelli di proteine, come i livelli misurati saranno la media delle cellule che sono state erroneamente fuse, e che possono appartenere a diverse linee.
      2. Identificare eventi in cui MINUTI non è riuscita a rilevare un nucleo del tutto.
      3. In questi casi (4.4.2.1 e 4.4.2.2), misurare i livelli medi di grigio fo ciascun canale nella cella (s) sotto o non-segmentato mediante uno strumento alternativo, come ad esempio ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/), e sostituire il record errato con i livelli corretti. Conserva il file originale * statistics.csv per riferimento futuro e modificare solo una copia di esso. Per fare questo usando ImageJ, attenersi alla seguente procedura:
         1. Aprire la relativa pila multicanale su ImageJ e importare il file corrispondente * overlaid.tiff generato da MINUTI come uno stack virtuale ( 'File'> 'Importa'> 'TIFF stack virtuale ...').
         2. Trova una sezione mediana del nucleo comprensione o non-segmentato.
         3. Utilizzando lo strumento di selezione a mano libera delineare il perimetro del nucleo comprensione o non-segmentato sul canale macchia del DNA.
         4. Premere il Crl + M (Cmd + M su un Macintosh) o andare al menu Analizzare e selezionare 'misura'. Questa azione registra il valore di grigio medio per l'area delineata e visualizza su una nuova finestra. Vai a 'analizzare'>9; Set misurazioni ... 'e assicurarsi che' dire valore di grigio 'sia selezionata. Selezionare tutti gli altri parametri da misurare.
         5. Utilizzando la stessa area delineata nel passaggio 4.4.2.3.3, ripetere la misurazione per ognuno dei canali di fluorescenza di interesse. I risultati saranno aggiunti al precedente sulla finestra delle misure 'Risultati'.
         6. Utilizzare le misure ottenute per sostituire le registrazioni errate nel file * statistics.csv. Se il nucleo non fosse stato segmentato, inserire una nuova riga, assegnargli un nuovo Cell ID e di introdurre i valori ottenuti in ImageJ sotto la colonna corrispondente per ogni canale. Questa cella non avrà coordinate spaziali (X, Y e Z) valori. Se il nucleo era stato undersegmented, duplicare la sua fila, assegnare gli ID cella diversa per ogni nuova cellula e di introdurre i valori ottenuti in ImageJ sotto la colonna corrispondente. In questo caso, entrambe le celle condivideranno coordinate spaziali.
            Nota: Se la distribuzione spaziale deve essere analizzato, abbiamo recommend escluso il coordinate XYZ di queste cellule, in quanto si sovrappongono. A tal fine, durante la creazione di nuovi record, assegnare le Cell ID a loro che sono facilmente distinguibili da quelli originali (per i numeri esempio, non intero).
   3. Punteggio divisione delle cellule. Nota: MINS rileva mitotico nonché nuclei interfase, ma non può distinguere tra loro.
      1. Se i nuclei mitotico sono da considerarsi separatamente in analisi, segnare manualmente questi e aggiungere queste informazioni al file di dati. Per registrare le cellule in mitosi, aggiungere una nuova variabile (colonna) al file di dati * statistics.csv e assegnare valori diversi per mitosi e l'interfase nuclei.
5. I dati pre-elaborazione.
   Nota: Una volta che i fogli di calcolo sono stati corretti per sovra e sotto-segmentazione sono pronti per essere analizzati. Il processo di analisi e presentazione dei dati dipenderà l'esperimento specifico. Tuttavia, di seguito sono alcune trasformazioni di dati generalisi consiglia di eseguire prima dell'analisi:
   1. Trasformare i valori di intensità di fluorescenza nel loro logaritmo o radice quadrata di ridurre la dispersione dei dati. Questo aiuta anche visualizzazione, come i dati grezzi tendono a concentrarsi in prossimità assi del grafico (vedere la Figura 4B, C).
   2. Correggere l'attenuazione Z-associato della fluorescenza:
      Nota: L'intensità della fluorescenza a scansione laser immagini di microscopia confocale diminuisce la profondità sull'asse Z una fetta si trova (Figura 4E, F).
      1. Se uno degli epitopi identificati nei campioni è un marcatore nucleare pulizia onnipresente e omogeneamente espresso, normalizzare le intensità di fluorescenza di altri epitopi dividendo loro valori in ciascuna cella dal corrispondente valore del marcatore pulizia.
      2. In assenza di tale marcatore di riferimento, compensare la perdita Z-associata della fluorescenza nel modo seguente:
         1. Tracciare i valori di ogni indicatore (Yasse del grafico) sulla posizione Z (asse X del grafico) per visualizzare la diminuzione dell'intensità over Z - trama insieme i valori per ogni controllo, di tipo embrioni selvatici (Figura 4F).
         2. Montare un modello lineare (curva di regressione) alla trama ottenuto nel passaggio precedente (valori di intensità su Z) per ciascun marcatore (Figura 4F).
         3. Correggere tutti i valori per ogni indicatore utilizzando la seguente formula:
            log (valore originale) + Z * pendenza del modello (Figura 4D, G).
            Nota: I passaggi specifici per eseguire questa correzione dipenderà dal software di analisi utilizzato (R, MATLAB, ecc). Se si utilizza R, eseguire la seguente formula per adattarsi a un modello lineare per i dati:
            > Lm (log (canale) ~ Z, data = dataframe)
            dove, canale è il canale di fluorescenza da correggere, Z è la coordinata Z e dataframe è la tabella contenente tutti i valori per l'embrione desiderato (s) (il * statistics.csv file generato da minuti o una modifica di esso).
            Nota: L'uscita della formula sopra avrà il seguente formato:
            (Intercept) Z
            4,76,373 mila -,01947
            dove il valore Z è l'inclinazione della linea di regressione per tale insieme di dati, quale valore assoluto deve essere utilizzato per modificare il valore originale con la formula in 4.5.2.2.3 (vedere Figura 4G per un esempio).

Per facilitare l'interpretazione e la presentazione dei dati, si deve prestare attenzione a non danneggiare gli embrioni durante la raccolta e la manipolazione, in modo che tutte le cellule e la loro posizione relativa possono essere analizzati Figura 2A -. D mostra esempi di blastocisti intatti in diverse fasi, con una cavità estesa. In caso di danni, la cura dovrebbe essere presa quando l'analisi e l'interpretazione dei risultati.

La qualità e l'affidabilità dei dati generati usando questo protocollo dipende dalla qualità del fissaggio e sul rapporto segnale-rumore degli anticorpi utilizzati per rilevare le proteine ​​di interesse. Utilizzare sempre fissativo fresco e sperimentare nuovi anticorpi, con opportuni controlli positivi e negativi, prima di iniziare una serie di esperimenti. Figura 2A mostra esempi di buone anticorpi per un certo numero di proteine ​​nucleari. La Figura 2B mostra un example di un buon anticorpi per una proteina citoplasmatica (DAB2). Figura 2C mostra un esempio di una cattiva colorazione, con basso rapporto segnale-rumore, dove il campione è stato determinato solo per 10 min. In questo caso, l'anticorpo utilizzato per GATA4 (Santa Cruz, sc-1237) richiede O / N fissaggio per fornire un segnale forte (vedi ^{24 per} istanze di embrioni fissi O / N e colorate con questo anticorpo). Aumentando il livello del segnale durante la post-elaborazione rivela un'immagine molto rumoroso. Per contro l'anti-GATA4 utilizzato per la Figura 2A (sc-9053) fornisce alto rapporto segnale-rumore dopo fissazione soli 10 min. Dettagli per questi e altri anticorpi robusti sono forniti nella sezione Materiali.

I fattori limitanti per una segmentazione buoni MINS sono a) l'ingrandimento dell'obiettivo usato per l'imaging, b) Z risoluzione e c) la qualità della colorazione nucleare. Figura 2D mostra esempi di embrioni impressi con un oil immersione obiettivo 40X con un NA di 1,30 e un 0,21 millimetri WD. pannelli centrali mostrano ingrandimenti delle ICM dove i singoli nuclei e il confine tra di loro possono essere distinti. Se non si utilizza la colorazione del DNA (es., Hoechst, DAPI, TO-PRO3, YO-YO1, ecc) valori di fluorescenza per la quantificazione, parametri di acquisizione può essere regolato individualmente per ottenere il miglior segnale. Pannelli inferiori mostrano come il più avanzato dell'embrione, maggiore è la densità nucleare e quindi maggiore è la probabilità di errori di segmentazione (punta di freccia e freccia). La Figura 3 mostra esempi di errori che MINS può commettere, quali il rilevamento nuclei apoptotici come cellule vive ( asterischi nei pannelli in figura 3AA, Ab, Ad), over-segmentazione (freccia e punte di freccia in Figura 3 AC) o sotto-segmentazione (freccia in Figura 3AD). la figura 3B mostra una sequenza di Z-fette di un evento sotto-segmentazione, dove due cellule sono state identificate come uno. Si noti come MINS segmentazione prende l'asse Z in considerazione per segmentare un volume che comprende tutte le sezioni in cui è presente una determinata cella.

Infine, le specifiche dell'analisi dei dati dipenderà dalla domanda in esame, quindi, le linee guida per il processo di analisi non possono essere qui indicati. Tuttavia, abbiamo trovato alcune trasformazioni di dati iniziale per essere utile Figura 4B -.. D mostra trame dei valori di fluorescenza per i marcatori NANOG e GATA6 nel ICM dell'embrione mostrato in Figura 4A Figura 4B mostra i valori di fluorescenza grezzi ottenuti da MINUTI (dopo la correzione manuale della comprensione e sovra-segmentazione). la figura 4C mostra gli stessi dati dopo una trasformazione logaritmica, che separa i valori dalla trama assi (una trasformazione radice quadrata è anche possibile e produce una trama simile). Figura spettacoli 4D gli stessi dati dopo automaticamente correcting i valori per l'attenuazione Z-associata in fluorescenza, come spiegato nel passaggio 4.5.2.2 del protocollo. Esempi di questo decadimento della fluorescenza Z-associati sono riportati nell'immagine Figura 4E e le trame in 4F. Figura 4G mostra l'effetto della trasformazione di dati spiegato in 4.5.2.2. Colori che rappresentano sia epiblast (rosso, Nanog +, GATA6-) o pre (blu, NANOG-, GATA6 +) identità sono state aggiunte alla trama in funzione del NANOG e valori GATA6. In questo particolare esempio, cellule in cui il rapporto di registro [GATA6] / log [NANOG]> 1,25 sono stati considerati PRE, cellule in cui il rapporto di registro [GATA6] / log [NANOG] <1 sono stati considerati EPI, e cellule con un intermedio rapporto sono stati considerati non impegnati (nessuno in questo caso). Tutte le trasformazioni di dati e terreni sono state fatte in Rstudio, tuttavia, la scelta del software non è critica e dipenderà l'utente finale.

Figura 1. Embrione posizione, Timeline e Analisi Pipeline. (A) Schema di uno (di due) corno del mouse uterina e le fasi di sviluppo preimpianto, allineati con la regione del corno dove dovrebbero essere trovati. (B) temporale sperimentale con temporizzazione per ogni passo. Fasi del protocollo e punti di pausa (blu) sono indicati. (C) Sintesi di acquisizione delle immagini e pipeline di analisi utilizzando min. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Esempi di immunofluorescenza e densità nucleare. (A) Gli esempi di buoni risultati immunofluorescenza con anticorpi testati per tr nucleareFattori anscription. Anti-CDX2 è stato rilevato con un AlexaFluor 488 asino anti-topo anticorpo secondario, anti-GATA6 con un AlexaFluor 568 asino anti-capra, anti-NANOG con un AlexaFluor 647 asino anti-coniglio, anti-GATA4 (Santa Cruz, SC-9053 ) con un AlexaFluor 488 asino anti-coniglio e anti-OCT4 con un AlexaFluor 647 asino anti-topo. Tutti gli anticorpi primari sono elencati nella tabella materiali. Citoplasmatica colorazione nucleare GATA4 è non specifico, e appare anche in GATA4 embrioni nulli (non mostrato). (B) Esempio di buona immunofluorescenza per una proteina citoplasmatica, DAB2. È stato rilevato utilizzando un AlexaFluor 488 asino anti-topo. (C) Esempio di cattiva immunofluorescenza, con un rapporto segnale-rumore per un fattore nucleare. GATA4 è stato rilevato con un anti-GATA4 cresciuto in capra (Santa Cruz, sc-1237 e che SC-9053 (coniglio anti-GATA4) è stato utilizzato in (A)) e un AlexaFluor 568 asino anti-capra. ( D) Esempi di embrioni intatti con buona colorazione nucleare che mostrano come aumenta la densità nucleare con l'età degli embrioni e come questo aumenta errori in min segmentazione (punta di freccia - oversegmentation - e la freccia - undersegmentation). Scala = 20 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Esempi di errori min. (A) Sequenza di singole Z-sezioni da un embrione che mostra esempi di errori di segmentazione min. apoptosi delle cellule che sono comunque identificati come nuclei sono contrassegnati con un asterisco (*) in pannelli A, B e D. Nel pannello b, ID # 39 (freccia), anche se molto piccola, non identificare il nucleo corrispondente e può quindi essere lasciata non corretta. Nel pannello di C, ID # 66 (freccia) si estende su due diversi nuclei, che sono a loro volta stati identificati separatamente (punte di freccia, gli ID # 65 # 54 e # 53). Nel pannello d, due celle (ID # 63) sono stati identificati come uno solo (vedi freccia che segna il confine sottile) e questo disco dovrebbe quindi essere ripetuto a scopo di conteggio delle cellule. (B) MINS rileva cellule lungo l'asse Z. Le immagini mostrano una sequenza di Z-fette di due celle che sono state erroneamente segnato come uno solo (# 123). Si noti come l'area blu che delimita i nuclei è continuo lungo Z. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Esempio di segmentazione e Trasformazioni di dati. (A) Immagini di cellule ICM di una blastocisti colorate per NANOG e GATA6 e fotografia istantanea della segmentazione nucleare dello stessoembrione utilizzando minuti sul canale di colorazione nucleare (Hoechst 33342). (BD) valori Nanog e GATA6 fluorescenza nelle cellule ICM misurate dal MINS tracciati come dati grezzi (B), dopo aver eseguito la trasformazione logaritmica (C) e dopo la correzione valori per il decadimento di fluorescenza lungo l'asse Z e assegnando automaticamente identità cellulari basate sul corretto valori (D). (E - G) Esempi di correzione dei dati per il decadimento della fluorescenza lungo l'asse Z. (E) Immagini di una blastocisti marcato con Hoechst e anti-CDX2 + AlexaFluor 488 (AF488), mostrando diminuzione di fluorescenza lungo l'asse Z. (F) diagrammi a dispersione di valori di fluorescenza lungo l'asse Z per Hoechst e AF488 per un pool di embrioni compreso quello mostrato in (E). linea grigia rappresenta la curva di regressione per ciascun insieme di valori. (G) stessi dati in F dopo compensare decadimento della fluorescenza per ogni cellautilizzando il seguente fattore: la coordinata Z * la pendenza del modello lineare (vedere il punto 4.5.2.2 nel protocollo). Pannelli E - G sono stati originariamente pubblicato da nel nodo autori (http://thenode.biologists.com/99problems/discussion/) Ogni punto rappresenta una cella. Scala = 20μm. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Tabella 1. Caratteristiche MINS

Tabella 2. MINUTI segmentazione Pipeline

Il presente protocollo descrive un metodo per eseguire un'analisi quantitativa di tutto il montaggio immunofluorescenza su preimpianto degli embrioni palco del mouse. Un robusto protocollo di immunofluorescenza ²² è seguito da ad alta risoluzione, tutto il montaggio confocale e dalla segmentazione delle immagini utilizzando un pezzo su misura del software ^4. Mentre la scelta del protocollo immunofluorescenza non è critica, troviamo quello qui presentato ²² per essere veloce, affidabile e per fornire il segnale robusto per molti degli anticorpi abbiamo testato. Altri protocolli possono essere seguite, purché la loro applicazione è coerente tra esperimenti equivalenti. Mentre molti fattori influenzano l'esito di ogni singolo esperimento, e il confronto diretto tra gli esperimenti non è necessariamente possibile, abbiamo trovato che lotta per la coerenza tra le ripetizioni e l'esecuzione di repliche tecniche sufficienti riduce notevolmente la variabilità. Pertanto, una volta ottimizzato, fissazione e immunolabeling reagenti e protocolli, nonché le condizioni di imaging deve essere mantenuta costante tra esperimenti equivalenti.

I principali problemi che possono sorgere durante l'applicazione di questo autunno protocollo in due gruppi: 1) di colorazione scarsa qualità, con il segnale debole, e 2) segmentazione ottimale, con molti errori (vale a dire, sovra e sotto-segmentazione). immunofluorescenza bassa qualità è generalmente dovuta alla fissazione improprio dei campioni o per gli anticorpi non essere adatto a tutto il montaggio immunofluorescenza. Assicurarsi PFA è fresco (sia preparato al momento o scongelato a RT da -20 ° C non più di una settimana prima). Date le piccole dimensioni degli embrioni preimpianto, 10 min fissazione in PFA dovrebbe essere sufficiente. Tuttavia, abbiamo trovato alcuni anticorpi per produrre un segnale più forte con tempi di fissazione più lunghi (vedi Materiali). Se un anticorpo che è stato testato in precedenza fornisce il segnale è debole, provare diversi protocolli di fissaggio. Non tutti gli anticorpi eseguire robustamente su tutto il montaggio immunofluorescence e la scelta di anticorpo primario è critica per l'esito dell'esperimento. I nuovi anticorpi devono essere testati sugli embrioni e la concentrazione ottimale determinati empiricamente. Nella tabella Materiali Noi forniamo i dettagli di un numero anticorpi abbiamo testato e utilizzare regolarmente. Fare riferimento alla letteratura pubblicata o alle informazioni del produttore quando si considera nuovi anticorpi. Si noti che non tutti gli anticorpi adatti per il lavoro Western Blot in immunofluorescenza tutto il montaggio, e le concentrazioni necessarie per immunofluorescenza possono essere fino a un ordine di grandezza superiore. anticorpi secondari commerciali in genere funzionano bene, fuori dalla scatola, tuttavia, essere coerente nell'uso di combinazioni anticorpo primario-secondario in tutta esperimenti equivalenti che stanno per essere confrontati.

La qualità di segmentazione dell'immagine dipende sia dalla qualità della colorazione nucleare e sulla densità nucleare nell'ICM dell'embrione. Cercate sempre per luminoso,nuclei taglienti e utilizzano un obiettivo ad alta risoluzione (40X o più). Se il segnale macchia nucleare è bassa, utilizzare una nuova aliquota o di un nuovo lotto. Finché la macchia nucleare non è usato per la quantificazione, i parametri di acquisizione possono essere regolati per ogni embrione per registrare taglienti, nuclei luminosi. Analogamente, se un canale diverso dalla colorazione nucleare è utilizzata per la segmentazione, il rapporto segnale-rumore di quel particolare canale determinerà la qualità della segmentazione. blastocisti fase avanzata (E4.0 in poi) presentano una densità molto alta nucleare all'interno della ICM. Pertanto, è in queste fasi che la colorazione di alta qualità è più critico. Tuttavia, gli errori di segmentazione si svolgeranno il più delle volte in queste fasi. Introdurre il diametro nucleare stimato e il livello di rumore dell'immagine sul gasdotto MINUTI, esplorare il risultato di ogni passo utilizzando il pulsante 'Visualizza' e regolare i parametri fino ad ottenere un risultato soddisfacente. Utilizzare i parametri che producono il migliore segmentazionee correggere manualmente degli errori durante l'elaborazione dei dati. Si noti che gli embrioni fase avanzata (~ E4.5) hanno un numero di celle ad alta e la correzione manuale dei dati sarà tempo.

Le limitazioni di questo protocollo sono determinati dal sistema microscopio confocale utilizzato per l'acquisizione delle immagini. Come discusso, utilizzare un obiettivo ad alto ingrandimento, con una distanza di lavoro che permette l'imaging Z dell'intero dell'embrione (preimpianto embrioni di topo possono arrivare fino a 150 - 160 micron di diametro). Analogamente, il numero di epitopi che possono essere rilevati sarà determinato dal numero di canali del microscopio può acquisire contemporaneamente. Usando questo protocollo, tre differenti epitopi oltre al DNA (4 canali in totale) possono essere etichettati simultaneamente su ogni campione. Assicurarsi che lo strumento è calibrato per ogni canale di fluorescenza, il gating è ottimizzata e che l'uscita laser è coerente.

I metodi qui descritti consentono l'analisi della posizione della cella lungo laAssi XYZ nonché la quantificazione dei livelli di espressione della proteina in situ per ogni singola cella in blastocisti di topo. Nella nostra esperienza, metodi alternativi utilizzando qualsiasi altro software disponibile non in grado di fornire il livello di risoluzione che il gasdotto applicata in questo protocollo può (vedi ^{4 per un} confronto diretto con altri strumenti). La densità nucleare alta trovato nell'ICM della blastocisti causa altri strumenti per generare tanti errori che l'entità della correzione manuale prescritti rende il loro uso pratico. In alternativa, le misure di conteggio delle cellule e fluorescenza manuali sono stati precedentemente utilizzati per sottoinsiemi di cellule o regioni definite dell'embrione ^{10,11,18,19,24.} Tuttavia, conteggio manuale e misura di tutti i canali di fluorescenza e posizione della cella, in tutti gli assi XYZ, per le decine di cellule presenti in ogni embrione sarebbe così tempo che non consentirebbe l'analisi ad alta produttività per il quale è stato ideato il nostro protocollo . Inoltre, un manualeVALUTAZIONE dei livelli di fluorescenza è incline a polarizzazione, mentre un oleodotto come quello qui descritto permette una misurazione oggettiva di intensità di fluorescenza per la successiva determinazione dell'identità cellulare. Per assegnare le identità delle cellule, l'investigatore dovrebbe stabilire un criterio standard per essere applicato su tutti i campioni per un particolare set up sperimentale. Date le differenti fattori - biologici e tecnici - che possono influenzare l'esito di immunomarcatura, questo criterio dovrebbe essere determinato mediante esperimenti di controllo appropriati e dati precedentemente pubblicati, ove possibile. Prevediamo un futuro prossimo in cui un algoritmo può essere progettato per la determinazione automatica di identità della cella indipendentemente dell'esperimento. Tuttavia, un tale strumento arriverà solo tra più ampia applicazione e il miglioramento del metodo attuale, molto probabilmente accoppiato con algoritmi di apprendimento automatico.

Infine, data la semplicità di questo gasdotto e la Morphol stereotipologia di embrioni di topo preimpianto, questo protocollo è facilmente scalabile per l'analisi di un gran numero di embrioni, permettendo così high-throughput analisi dei fenotipi nulli ^5,6 o qualsiasi altra manipolazione sperimentale ^7. Infine, mentre il protocollo attuale è stato progettato e ottimizzato per l'analisi di embrioni di topo preimpianto e colonie ESC, vediamo alcuna ragione a priori per cui non potrebbe essere applicata ad altri sistemi con caratteristiche simili - cioè ad alta densità nucleare. Incoraggiamo gli altri a sperimentare e adattare questo protocollo ad altri scenari e fornire un feedback per il suo miglioramento futuro.

The authors declare no conflicts of interest.

The authors would like to thank Stefano Di Talia, Alberto Puliafito, Venkatraman Seshan and Panagiotis Xenopoulos, for input on data handling, analysis and representation, Berenika Plusa for assistance in the design of the immunofluorescence protocol and antibody testing and members of the Hadjantonakis lab for comments on the manuscript and on the development of this protocol. Work in our lab is supported by the National Institutes of Health R01-HD052115 and R01-DK084391, and by NYSTEM N13G-236.