Sequenziamento di prossima generazione del 16S RNA ribosomiale Gene ampliconi

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

Una delle principali questioni in ecologia microbica è "chi è là?" Questa domanda si può rispondere utilizzando vari strumenti, ma uno degli standard d'oro di lunga durata è quello di sequenziare ampliconi 16S RNA ribosomiale (rRNA) gene generati da-livello di dominio PCR Le reazioni di amplificazione di DNA genomico. Tradizionalmente, questo è stato eseguito da clonazione e Sanger (elettroforesi capillare) sequenziamento degli ampliconi della PCR. L'avvento di sequenziamento di prossima generazione ha enormemente semplificato e aumentato la profondità di sequenziamento per 16S rRNA sequenziamento del gene. L'introduzione di sequencer da banco permette ora piccoli laboratori per svolgere il loro 16S rRNA sequenza in-casa in una questione di giorni. Qui, un approccio per 16S rRNA gene ampliconi sequenziamento utilizzando un banco di nuova generazione sequencer è dettagliata. Il DNA ambientale viene prima amplificato mediante PCR utilizzando primer che contengono le schede di sequenziamento e codici a barre. Essi vengono poi accoppiati alle particelle sferiche tramite emulsione PCR. Le particelle sono loaded su un chip monouso ed il chip viene inserito nella macchina sequenziamento dopo di che viene eseguito il sequenziamento. Le sequenze vengono recuperati in formato FASTQ, filtrati ed i codici a barre vengono utilizzati per stabilire l'appartenenza campione della legge. Il filtrato e categorizzata letture vengono poi ulteriormente analizzati utilizzando gli strumenti disponibili pubblicamente. Un'analisi esempio in cui la legge sono stati classificati con un algoritmo di tassonomia trovare all'interno del pacchetto software Mothur è dato. Il metodo qui descritto è semplice, poco costoso e semplice e dovrebbe aiutare i laboratori più piccoli di trarre vantaggio dalla rivoluzione genomica in corso.

Sequenziamento metagenomiche è una tecnologia molto potente in quanto esso si rivolge la totalità delle informazioni genetiche contenute in un campione ambientale. Ci sono diversi gusti di sequenziamento metagenomica, tra cui shotgun sequencing, librerie di grandi inserti e amplicon sequenziamento. Amplicon sequenziamento offre il vantaggio di essere relativamente poco costoso, veloce e in grado di produrre legge da una singola regione genomica che può essere generalmente allineato. Inoltre, il flusso dei dati per il sequenziamento degli ampliconi è per lo più standardizzata. Tuttavia, poiché si basa sulla PCR, ha tutti i pregiudizi legati alla specificità incompleta, copertura incompleta e Primer polarizza ^1,2, il che rende questo approccio semiquantitativo al meglio. Diverse regioni genomiche possono essere mirati per il sequenziamento degli ampliconi compresi i geni funzionali, ma le opzioni più popolari sono da utilizzare geni marcatori quali il gene 16S rRNA per generare un profilo di comunità. Tradizionalmente, 16S rRNA gene ampliconi sequencing è stata effettuata utilizzando tecniche di alta intensità di lavoro che comprendeva la clonazione in E. coli, colonia di raccolta ed estrazione plasmide seguita da Sanger sequenziamento sui plasmidi isolati, e, di conseguenza, la maggior parte degli studi analizzati meno di 100 cloni per campione. Sequenziamento di prossima generazione ha portato due importanti progressi: massiccia parallelizzazione delle reazioni di sequenziamento e, soprattutto, la separazione clonale di modelli senza la necessità di inserire frammenti di geni in un ospite. Questo ha semplificato enormemente il sequenziamento del 16S rRNA ampliconi del gene, che ora è tornato come una caratteristica di routine di molti studi di microbiologia ambientale, risultando in un "rinascimento" per il 16S rRNA gene ampliconi sequenziamento ^3.

Dal momento che l'avvento di Roche 454 sequenziamento nel 2005 ^4, molte altre tecnologie di sequenziamento di prossima generazione sono apparsi sul mercato (ad esempio, Illumina, Solido, PacBio). Più recentemente, l'introduzione della sequenza bancors portati a piccoli laboratori la capacità di sequenziamento, una volta esclusivo di grandi centri di sequenziamento. Cinque macchine da banco sono attualmente disponibili: la 454 GS Junior, la Ion Torrent Personal Genome automatico (PGM) e Proton, e la Illumina MiSeq e NextSeq 500 Mentre tutti questi sequencer offrono meno legge per corsa e un minor numero di basi per ogni dollaro di più pieno sequencer scala, sono più flessibili, rapidi, e le loro bassi costi di acquisizione e di esecuzione li rende alla portata di piccoli laboratori accademici. Sequencer da banco sono particolarmente adatte per ampliconi, piccolo genoma e bassa complessità metagenoma sequenziamento negli studi di microbiologia ambientale, perché questo tipo di studi in genere non richiede una profondità estrema di sequenziamento. Ad esempio, è generalmente accettato che per il 16S rRNA sequenziamento del gene studia il numero di letture per campione non è di primaria importanza, come ~ 1000 recita in grado di generare gli stessi schemi come multi-milioni di letture dataset ^5. Detto questo, da banco di nuova generatio n sequencer ancora generano grandi quantità di dati di sequenza, con rese massime di ~ 35 Mbp (454 GS Junior), ~ 2 Gbp (Ion Torrent PGM), ~ 10-15 Gbp (Ion Torrent Proton), ~ 10 Gbp (Illumina MiSeq) e ~ 100 GBP (Illumina Successivo Seq 500), che è più che sufficiente per la maggior parte degli studi di microbiologia ambientale.

Sequenziamento di prossima generazione di ampliconi 16S rRNA utilizzando sequenziatori da banco è stata recentemente applicata a una vasta gamma di ambienti. Ad esempio, la Ion Torrent PGM è stata utilizzata per la comunità analisi di sterili di miniera di uranio che avevano particolarmente pH elevato e bassa permeabilità ^6, dei sistemi di acquacoltura a ricircolo ^7, di idrocarburi contaminati suoli artici ^8,9, di sabbie petrolifere di estrazione sedimenti colpite e biofilm dal fiume Athabasca ^10,11, della rizosfera di salici piantati in terreni contaminati ^12, dei corpi umani e animali ^13-16 e di digestori anaerobici ^17.

1 16S rRNA gene Amplicon Biblioteca Preparazione con il metodo Fusion

1. Scongelare i primer (forward, F343-Iona-MIDXX: 5'-CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG AC T CAG XXX XXX XXX XTA CGG RAG GCA GCA G-3 '; inversa, R533-IonP1: 5'-CCT CTC TAT GGG CAG TCG GTG AT A TTA CCG CGG CTG CTG GC-3 '; grassetto: Ion Torrent adattatori specifici; corsivo: tasto sequenza per la calibrazione di intensità di segnale all'inizio della corsa di sequenziamento; carattere regolare: primer specifici template; X ... X: 10 bp del codice a barre, vedere la Tabella 1 per alcune sequenze di codici a barre), il master mix 2x HotStartTaq Plus e dei campioni. Mescolare accuratamente prima dell'uso, ad eccezione del master mix che deve essere miscelato con delicatezza.
2. Preparare una miscela di PCR (20 reazioni microlitri) con 0,5 mM del primer reverse, 0,4 mg / ml di albumina di siero bovino (BSA) e 1x HotStartTaq Inoltre mix master. Aggiungere 18,5 ml della master mix all'etubo ach PCR.
3. Aggiungere un primer forward (0,5 ml a 20 mm) con un codice a barre diverso per ciascuno dei campioni che saranno sequenziati insieme. Aggiungere 1 ml di campione (1-10 ng / mL) al tubo di PCR.
4. Porre i tubi in una macchina PCR ed eseguire il seguente programma: denaturazione iniziale a 95 ° C per 5 min; 25 cicli di 95 ° C per 30 sec, 55 ° C per 30 sec e 72 ° C per 45 sec; allungamento finale a 72 ° C per 10 min. I prodotti di PCR possono essere conservati a 4 ° CO / N o congelati fino al momento dell'utilizzo.

2 Amplicon Purificazione, quantificazione e Pooling

1. Preparare un gel di agarosio al 2% utilizzando più grandi pettini disponibili. Aggiungere 5 ml di gel loading dye 6x alla reazione e carico sul gel, separando ciascun campione da un pozzo vuoto. Attivare il gel a 70 V per 50 min.
2. Scatta una foto del gel e tagliare le bande (dimensioni previste circa 250 bp: 190 bp prodotto più di 63 adattatori bp e codici a barre) utilizzando un bisturi pulito.
3. Pesare le bande asportati e procedere con l'estrazione gel e purificazione dei prodotti di PCR (con, ad esempio, kit QIAquick Gel Extraction).
4. Quantificare ciascun prodotto PCR con PicoGreen e fare diluizioni per ottenere una soluzione madre a 5 x 10 ⁹ molecole / ml (circa 1 ng / ml). Se alcuni campioni mostrano minore amplificazione, regolare le diluizioni ad una concentrazione più bassa, tenendo presente che la concentrazione più bassa adatto per le procedure successive è 1,57 x 10 ⁷ molecole / ml (26 pM).
5. Pool 10 ml di ciascun prodotto di PCR diluito per ottenere una piscina equimolare di campioni. Preparare una piscina separata per ciascuna della corsa sequenza programmata. I prodotti della PCR in pool possono essere conservati nel congelatore fino al momento dell'utilizzo.

3. Emulsione PCR e sequenziamento

1. Eseguire emulsione PCR:
   1. Diluire i prodotti di PCR in pool a 26 pM in un volume di 25 microlitri. Scongelare i reagenti provenienti da un kit modello Ion PGM.
   2. Preparare la miscela di emulsione PCR (reagenti forniti nel kit) in una cappa PCR e aggiungere i prodotti di PCR in pool e le particelle sfera (in dotazione) in panchina. Mescolare accuratamente e inserire il composto in una cartuccia filtrante e top accuratamente con olio emulsione (in dotazione).
   3. Lentamente invertire la cartuccia del filtro e carico sul emulsione automatizzato PCR apparecchi (ad esempio, Ion Uno strumento Touch 2). Selezionare il programma appropriato e avviare la procedura.
2. Dopo l'emulsione automatizzato PCR è stata completata, rimuovere il surnatante dai tubi di raccolta e recuperare le particelle sfera sul fondo delle provette. Risospendere le sfere in 100 ml di soluzione di lavaggio (fornito nel kit) e prendere un aliquota di 2,0 microlitri per la libreria quantificazione.
3. Eseguire la quantificazione biblioteca.
   1. Mescolare 100 ml di tampone PESS (150 mM NaCl, 10mM NaPO _4, 1mM Na ₂ -EDTA) con 2 ml di adattatore B'-Fam (5'-FAM -CTG AGA CTG CCA AGG CAC ACA GGG AGG GAT-3 ') della sonda e 2 ml di Adapter A-Cy5 (5'-Cy5 -CCA TCT CAT-3 CAG CCC TGC GTG TCT CCG ACT' sonda). Aggiungere 52 ml di questa miscela per l'aliquota di 2,0 microlitri preso nel passo 3.2 e aggiungere 2 ml di soluzione di lavaggio (dal kit modello) per i restanti 52 microlitri come un vuoto per la quantificazione.
   2. Incubare a 95 ° C per 2 min, quindi a 37 ° C per 2 min. Trasferire le miscele in provette da 1,5 ml.
   3. Aggiungere 1,0 ml di tampone TEX (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, 0,01% Triton X-100, pH 8.0), mescolare e centrifugare a 15.500 xg per 3 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e lasciare 20 microlitri in ciascun tubo. Ripetere questa procedura di lavaggio due volte.
   4. Aggiungere 180 ml di tampone TEX, risospendere le particelle di pellet e trasferirli in provette 500 microlitri Qubit.
   5. Misurare la fluorescenza per FAM e Cy5 utilizzando un apparato Qubit e calcolare il rapporto delle sfere positive utilizzando la calcolatrice disponibile sul sito web Ion Comunità.
4. Arricchisci il resto delle particelle sfera di sfere positivi (contenenti DNA amplificato) utilizzando un sistema di arricchimento automatico (ad esempio, Ion One Touch Enrichment System).
   1. Reagenti Dispensare nei pozzetti della strip 8-ben fornito: Bene 1: particelle sfera dal punto 3.2; Bene 2: pre-lavato perline MyOne streptavidina C1 (13 microlitri); Beh 3, 4 e 5: soluzione di lavaggio (fornito nel kit modello); Ben 6: vuota; Ben 7: fondere-off soluzione (NaOH 125 mM, 0,1% Tween 20); Ben 8: vuoto.
   2. Installare un suggerimento sul braccio pipettaggio e un tubo di 0,2 ml per la raccolta del campione. Avviare lo strumento. Alla fine l'arricchimento, aggiungere 10 ml di soluzione neutralizzante (fornito). Le sfere arricchite possono essere conservati a 4 ° C per un massimo di 15 giorni.
5. Inizializzare lo strumento sequenza:
   1. Collegare allo strumento sequenziamento e preparare un piano di corsa di sequenziamento, specificando i dettagli della corsa sequenziamento.
   2. Installarel la soluzione di lavaggio # 2 (fornita nel kit di sequenziamento Ion PGM), la soluzione di lavaggio # 1 (350 ml NaOH 100 mM) e la soluzione tampone di auto-pH (in dotazione).
   3. Avviare la procedura di inizializzazione e quando viene richiesto aggiungere il dATP, dGTP dCTP e dTTP nucleotidi (in dotazione) nelle rispettive provette da 50 ml. Avvitare i tubi sulla macchina per il sequenziamento e continuare la procedura di inizializzazione. Quando l'inizializzazione è completata, avvia immediatamente la procedura di esecuzione.
6. Preparare i campioni per il sequenziamento e caricare il chip:
   1. Raccogliere le sfere arricchite dal punto 3.4 alla parte inferiore del tubo per centrifugazione a 15.500 xg per 1,5 min. Rimuovere il surnatante lasciando esattamente 3 ml.
   2. Aggiungere 3 ml di sequenziamento Primer (fornito nel kit di sequenziamento), mescolare accuratamente pipettando su e giù per risospendere le particelle. Incubare a 95 ° C per 2 min, quindi a 37 ° C per 2 min.
   3. Aggiungere 1 ml di polimerasi (in dotazione), mescolare bene e incubmangiato a temperatura ambiente per 5 min. Procedere per caricare la miscela di enzimi sfera sul chip sequenziamento entro 30 min.
   4. Durante l'incubazione, caricare il chip sequenza sul sequencer ed eseguire un controllo di qualità chip. Rimuovere il liquido dal chip per centrifugazione e caricare il campione nel chip lentamente pipeting premuto il mix enzima-sfera (7 ml) ed evitando l'introduzione di bolle nel chip.
   5. Centrifugare il chip per tre volte per 1 minuto in una microcentrifuga. Modificare l'orientamento del chip ad ogni centrifugazione e mescolare pipettando su e giù tra ogni esecuzione.
   6. Caricare il circuito integrato nello strumento e iniziare la corsa.

Analisi 4. base dei dati di sequenza

1. Connettersi al server di dati di sequenziamento e scaricare il file FASTQ. Creare un file delimitato da tabulazioni "oligo" contenente le informazioni di fondo e di codici a barre (vedi esempio nella tabella 1). Scaricare i file di riferimento Greengenes dal Motsito Hur ( http://www.mothur.org/wiki/Taxonomy_outline ).
2. Avviare Mothur ed eseguire analisi:
   1. Convertire il file FASTQ ad un FASTA e un file di qualità utilizzando il seguente comando: fastq.info (FASTQ = test.fastq)
   2. Determinare l'appartenenza al gruppo di ogni sequenza e tagliare le sequenze utilizzando il seguente comando: trim.seqs (FASTA = test.fasta, oligo = barcode.txt, qfile = test.qual, qwindowaverage = 20, qwindowsize = 50, minLength = 150, keepforward = T)
   3. Le varie opzioni possono essere modificati secondo la severità desiderato
   4. Classificare le sequenze del greengenes tassonomia utilizzando il seguente comando: classify.seqs (FASTA = test.trim.fasta, method = wang, gruppo = test.groups, template = gg_99_otus.fasta, tassonomia = gg_99_otus.tax, cutoff = 50)

Dopo purificazione su gel, con 25 cicli di amplificazione PCR, i prodotti di amplificazione sono generalmente ad una concentrazione di 0,2-10,0 ng in 50 ml di acqua. Questo può variare notevolmente a seconda della concentrazione di DNA di partenza, il tipo di campione e il kit di purificazione utilizzato. Si raccomanda di mantenere il numero di cicli di PCR per il più basso possibile per evitare la formazione chimera e diminuire pregiudizi amplificazione, tenendo presente che tutti i campioni devono essere amplificati utilizzando lo stesso numero di cicli. Per ridurre al minimo il numero di policlonale letture e sfere vuote e massimizzare il numero di letture, il rapporto Qubit deve essere compresa tra 0,1 e 0,3 e la fluorescenza FAM deve essere superiore a 200 314 Utilizzo di un chip su una Ion Torrent PGM, la produzione media è di circa 0,3-0,5 M buona qualità legge dopo il filtraggio dei risultati in Mothur. Tabella 2 mostra una tipica composizione del numero di letture dopo ogni fase della procedura per una corsa contenente 36 ambienti multiplexaticampioni mentali amplificato con primer mira la regione V3-4 delle 16S e analizzati utilizzando Mothur. In Mothur, la procedura trim.seqs generare un file "* .trim.fasta" che contiene le sequenze che passavano i filtri di qualità e un "* .scrap.fasta" che contiene le sequenze che non ha superato i filtri di qualità con la ragione di reiezione in sequence header. Quando fornito con codici a barre nel file "oligo", questo comando genererà anche un file "* .Gruppi" che contiene l'appartenenza al gruppo di ogni sequenza in base alla sequenza di codice a barre. La procedura classify.seqs genera un ".tax.summary" che può essere aperto in Excel. Questo file contiene il riassunto della appartenenza tassonomica (in linee) per ciascuno dei campioni (nelle colonne). Questo file può essere utilizzato per analisi statistiche a valle e di visualizzare composizione della comunità a vari livelli tassonomici. Il file ".taxonomy" contiene il tassonomica dettagliataaffiliazione per ogni sequenza. La composizione media della comunità a livello di phylum / classe in tutti i 36 campioni è mostrato in Figura 1.

Figura 1 Composizione media comunitaria a livello di phylum / classe per tutti i campioni.

Tabella 1 Esempio di file "oligo" per l'uso in Mothur.

Tabella 2 Numero di letture prodotte da una corsa tipica per 36 campioni ambientali multiplexing su una Ion Torrent 314 chip.

Il metodo presentato qui è semplice e poco costoso, e dovrebbe consentire a molti laboratori di accedere al potere di sequenziamento metagenomica. Anche se varia a seconda della piattaforma di sequenziamento utilizzate, una volta che le librerie sono costruite è richiesto molto poco hands-on tempo, con la maggior parte del processo di essere automatizzate. Per la piattaforma di sequenziamento qui utilizzato (Ion Torrent PGM), la procedura completa può essere eseguita in due giorni di lavoro. Al momento della scrittura (settembre 2013), i costi dei reagenti relativi all'esempio sopra descritto sono stati i seguenti: amplificazione PCR di 36 campioni: $ 25, purificazione gel e DNA PicoGreen quantificazione di 36 campioni: $ 125, emulsione PCR per un campione ampliconi pool : $ 150 e reagenti di sequenziamento: $ 250, per un totale di $ 550 o $ 15 per campione o $ 0,0015 lettura qualità-filtrato. Questo prezzo non comprende contratto di strumento di servizio, gli ammortamenti strumento, stipendio tecnico e l'utilizzo dello spazio in laboratorio.

Ad oggi, la tecnologia di sequenziamento di nuova generazione più utilizzato per il gene 16S rRNA è 454. tecnologia di sequenziamento La Ion Torrent utilizzato in questo protocollo è concettualmente molto similea 454 e le due tecnologie sono soggette allo stesso tipo di errori di sequenziamento. Non sorprendentemente, è stato dimostrato che il sequenziamento Ion Torrent portato risultati di sequenziamento molto simili a 454 sequenziamento ^10. Recentemente, molti ricercatori hanno esplorato l'uso della tecnologia Illumina per 16S rRNA gene ampliconi sequenziamento ^18,19. In ogni caso, sarebbe facile per adattare l'attuale protocollo per altri sequencer da banco come l'Illumina MiSeq o la 454 GS Junior cambiando le sequenze dei primer fusione per abbinare gli adattatori e codici a barre necessari per queste tecnologie di sequenziamento, come nel metodo descritto recentemente per il Illumina MiSeq ^19. In alternativa, i ricercatori potrebbero seguire i passi 1 e 2 del protocollo qui descritto e inviare i ampliconi pool a un centro di sequenziamento, dove sarebbero stati eseguiti l'emulsione PCR e sequenziamento.

Il gene 16S rRNA letture sono stati tagliati e classificati utilizzando Mothur, ma molte altre analisi può essere eseguita su16S rRNA ampliconi del gene. Ad esempio, la diversità beta può essere valutata calcolando le distanze Unifrac tra ogni coppia campione utilizzando la procedura descritta in http://unifrac.colorado.edu/ ^20. Alpha indici di diversità e il numero di unità tassonomiche operative di ciascun campione possono essere calcolati utilizzando strumenti all'interno QIIME come AmpliconNoise ²¹ o utilizzando la procedura descritta da Huse et al. ²² e disponibili all'interno Mothur.

I primer usati qui amplificato le regioni variabili 3 e 4 del gene 16S rRNA, ma molte altre regioni potrebbero essere mirati. In questo studio, i geni 16S rRNA sono stati amplificati da materiale vegetale e la scelta di fondo è stata fatta per evitare l'amplificazione del cloroplasto 16S rRNA gene ^23,24. Vi è un'ampia varietà di altri primer disponibili che variano in termini di durata del prodotto, potenza tassonomica e l'utilità ^25,26. Tuttavia, in tutti i casi 200-400 bp legge del gene 16S rRNA non può essere classificato in modo affidabile a livello di specie, e le analisi sono limitate al genere e livelli tassonomici più elevati. Altri geni potrebbero essere più appropriato se sono necessarie informazioni a livello di specie, come i cpn60 e rpoB geni ^27,28. Future gocce drastici nel costo di sequenziamento e di aumenti nel potere di strumenti analitici potrebbero rendere fattibile sostituire 16S rRNA gene sequencing da metagenomica fucile, ma fino ad allora 16S rRNA sequenziamento del gene rimane il gold standard di microbiologia ambientale.

The authors have nothing to disclose.

Development of the method presented here has been carried out with various sources of funding, including Genome Canada and Genome Quebec, Environment Canada STAGE program and internal NRC funds.